CN102131919B - 一种增殖多能性干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

为了在不使用支持细胞、血清等动物性材料的体系中有效地增殖多能性干细胞，本发明提供了一种增殖多能性干细胞的方法，其包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在含有层粘连蛋白‑5的体系中培养该多能性干细胞的工序。

Description

一种增殖多能性干细胞的方法
技术领域
本发明涉及增殖多能性干细胞的方法、层粘连蛋白-5作为细胞支持材料(cell-supporting material)的用途以及多能性干细胞的培养用试剂盒。
本申请以2008年3月31日提出的日本专利申请特愿2008-93350和2008年9月3日提出的日本专利申请2008-225686号为基础要求优先权。
背景技术
多能性干细胞的增殖方法
多能性干细胞为具有分化成所有组织的细胞的能力(分化多能性)的干细胞。作为多能性干细胞，目前已知有胚胎干细胞(ES细胞)、通过在体细胞中导入并表达特定因子的组合(例如，Oct3/4，Sox2，Klf4及c-Myc的组合)而制作的诱导多能性干细胞(iPS细胞)、通过原始生殖细胞制作的胚胎生殖干细胞(EG细胞)、通过精巢的生殖细胞制作的种系干细胞(GS细胞)等。
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells：ES细胞)是通过发育初期的胚泡内细胞群(ICM)建立的多能性干细胞(Nature.292，154-156，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78，7634-7638，1981，Science.282，1145-1147，1998)。小鼠ES细胞在白血病抑制因子(LIF)的存在下能够维持其多能性(Nature.336，684-687，1988，Nature.336，688-690，1988)。通常，在维持培养中使用产生LIF的细胞株或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为支持细胞(饲养细胞)，或者使用添加有LIF的培养基和适当的支持材 料。
小鼠ES细胞的培养中，支持细胞担负着提供细胞粘附的支架及供给ES细胞生长因子和LIF的任务。另外除了从支持细胞供给LIF外，还可以在培养液中添加LIF。作为添加LIF的方式，可以直接将LIF添加到培养液中，也可以在培养液中添加产生LIF的细胞株的培养上清。另一方面，在不使用支持细胞的体系中，通过以明胶等各种胞外基质作为支持材料、并向培养液中添加LIF来进行小鼠ES细胞的培养。
另一方面，在人ES细胞的培养中，为了维持多能性，需要存在碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)(Dev Biol.227，271-278，2000)，进而还需要从MEF供给的因子。人ES细胞在FGF2存在下，通过使用MEF作为支持细胞，或者使用MEF的培养上清和适当的支持材料，能够在保持多能性的状态下进行维持培养(Nature Biotech.19，971-974，2001)。
具体而言，在FGF2和血清存在下能够培养人ES细胞，或者也可以用无血清的培养基培养人ES细胞。现在一般采用的是用无血清培养基培养人ES细胞，作为血清代替物可使用例如Invitrogen公司的KNOCKOUTTM血清替代品(KSR，knockout serum replacement)等。作为一般的人ES细胞的培养体系，可以使用如下的体系：使用MEF作为支持细胞并将FGF2添加到培养液中的体系、以Matrigel等各种胞外基质蛋白作为支持材料并在添加有FGF2的MEF培养上清中进行培养的体系。另外，作为支持细胞不仅可以使用小鼠成纤维细胞，还可以使用人成纤维细胞。
此外，据报道，近年来在小鼠和人中由体细胞建立了具有与胚胎干细胞非常相似的性质的诱导多能性干细胞(induced Pluripotent Stem cells：iPS细胞)(Cell.126，663-672，2006， Cell.131，861-872，2007，Science.318，1917-1920，2007，国际公开WO2007/069666)。iPS细胞为在体细胞中导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等因子而建立的体细胞来源的多能性干细胞。一般在iPS细胞的维持培养中，与ES细胞同样也需要存在支持细胞。
iPS细胞可通过与ES细胞同样的方法进行培养。在STO细胞(稳定产生LIF的SIM小鼠成纤维细胞株)中、使用LIF产生细胞的培养上清能够维持培养小鼠iPS细胞。并且，作为不使用支持细胞的体系，通过在培养基中添加LIF，能够在包被有明胶的培养板上维持培养小鼠iPS细胞。另外，据了解，STO细胞对于稳定维持小鼠来源的ES细胞、EG细胞、EC细胞是有效的。
人iPS细胞还可以利用小鼠成纤维细胞作为支持细胞并在添加有FGF2的体系中进行培养。另外京都大学山中伸弥等的研究小组，使用SNL细胞(小鼠成纤维细胞株，同时表达LIF和G418耐性基因)进行培养(Cell.131，861-872，2007)。在不使用支持细胞的体系中维持培养人iPS细胞的情况下，采用使用Matrigel作为支持材料并在MEF的培养上清中添加了FGF2的体系。
体细胞来源的iPS细胞与初期胚来源的胚胎干细胞相比，伦理性的问题较少，并且，由于可由患者本人的细胞进行调制因此并不存在免疫排斥的问题。可期待其在再生医疗上的应用。
胚胎生殖干细胞(Embryonic germ cells：EG细胞)为在青灰因子(Kit-Ligand)、LIF、FGF2的存在下培养原始生殖细胞而建立的细胞，通过小鼠的实验可知该细胞具有与ES细胞大致相同的性质。EG细胞的维持培养可以使用与ES细胞同样的培养方法。即，在MEF、STO细胞等支持细胞的存在下，能够在添加有LIF的体系中培养EG细胞。(Cell 70：841-847，1992， Development 120，3197-3120，1994)。
由精巢的生殖细胞制作的种系干细胞(Germline Stem cells：GS细胞)是通过在至少含有GDNF(Glial cell-line derived neurotrophic growth factor，胶质细胞源性神经营养因子)的培养条件下进行培养从而能够在体外培养精原干细胞(精子干细胞)的细胞株，通过注入到精巢的曲细精管(seminiferous tubules)内而能够形成精子。GS细胞的长期培养可通过在作为支持细胞的MEF上使用添加有GDNF、FGF2、EGF(epidermal growthfactor)及LIF的培养基来进行。还有在无支持细胞的体系内培养GS细胞的报道，其通过在用层粘连蛋白包被后的培养板进行培养，能够维持GS细胞(Biology of Reproduction 69：612-616，2003，Biology of Reproduction 72：985-991，2005)。
GS细胞中尤其是mGS细胞(multipotent germline stem cell)，具有与ES细胞同样的性质，还具有分化多能性。mGS细胞通过在ES细胞的培养体系中使所建立的GS细胞进一步变成多能性干细胞而建立。所建立的mGS细胞也能够采用与ES细胞同样的方法进行培养，可在支持细胞存在下且在使用了添加有LIF的培养基的体系中进行培养。(Cell 119：1001-1012，2004，Nature 440：1199-1203，2006)。
上述那样的多能性细胞被期待应用在再生医疗等中。但是，为了应用在临床上而尤为需要避免免疫排斥的问题、未知的病毒混入等潜在的危险性，可以说需要开发完全不使用动物来源的物质的维持培养体系。即，可以预料，当人所不具有的动物来源的唾液酸被吸收到人ES细胞、iPS细胞时，这些唾液酸所具有的抗原性将引发问题，从而使再生后的组织发生免疫排斥。此外，即使使用例如人蛋白质，从胎盘等组织调制出的天然型蛋白质，也存在混入除艾滋病病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV) 等病毒以外的未知病毒等潜在的危险性。
为此，对能够维持人ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞的多能性且支持该细胞的增殖用培养液组成、以及代替MEF的适当的支持材料进行了探索(Nature Biotech.24，185-187，2006，Stem Cell.24，2649-2660，2006)。然而，在使用MEF作为支持细胞(饲养细胞)的情况下，细胞粘附效率也只得到百分之几，现在探讨的不使用支持细胞的体系该效率还会进一步降低。在多能性干细胞的维持培养中期望开发出完全不使用动物来源的物质的体系，但上述细胞粘附效率低已成为重大问题之一。要求一种维持多能性且显示出有效的粘附活性的人来源的支持材料，所述支持材料将成为对确保可用于再生医疗等临床上的细胞材料有用的工具。
层粘连蛋白-5
层粘连蛋白主要定位存在于各种组织的基底膜上，是在组织结构的维持和细胞功能的控制中发挥重要作用的胞外基质蛋白(Matrix Biol.，18：19-28，1999，Dev.Dyn.，218：213-234，2000)。
作为层粘连蛋白的结构，是α链、β链、γ链分别通过二硫键连接而成的异三聚体分子，具有特征性的十字架结构。各链由多个结构域构成，结构域I和II形成三股螺旋。在本申请前，层粘连蛋白分子通过5种α链(α1～α5)、3种β链(β1～β3)、3种γ链(γ1～γ3)的不同的组合可至少被认定为15种，实际上意味着存在其数倍的种类(宫崎等，实验医学Vol.16No.16(增刊)1998年，第114-119页，Dev.Dyn.，218：213-234，2000，J.Neurosci.，20：6517-6528，2000，Physiol Rev.85，979-1000，2005)。这些α、β、γ链分别被不同的基因编码，各自的层粘连蛋白亚型具有特有的存在部位或功能，主要介由细胞膜受体整合蛋白(cellmembrane receptor integrin)调节细胞粘附、增殖、运动、分化等(Dev.Dyn.218，213-234，2000，Physiol.Rev.85，979-1000，2005)。
表1表示15种层粘连蛋白分子种类及其亚基构成。
表1层粘连蛋白分子种类和亚基构成
层粘连蛋白分子通过以3条链的氨基(N)末端部分(短臂)相互缔合、或者与其他基质分子缔合来构建基底膜。另一方面， α链的羧基(C)末端存在5个相同的球状结构域(G1～G5结构域或LG1～LG5)，该部分主要与整合蛋白或其他的受体结合。
层粘连蛋白-5(也称作缰蛋白、表皮整联配体蛋白、nicein、ladsin)，为由α3链、β3链、γ2链形成的层粘连蛋白亚型之一，被多个研究机关在不同的情况下发现(J.CellBiol.114，567-576，1991，Cell 65，599-610，1991，J.Invest Dermatol.101，738-743，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90，11767-11771，1993)。
据报道，层粘连蛋白-5对各种细胞表现出较强的细胞粘附活性、细胞分散活性、细胞增殖活性等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90，11767-11771，1993，J.Biochem.116，862-869，1994，J.Cell Biol.125，205-214，1994，Mol.Biol.Cell.16，881-890，2005，StemCell.24，2346-2354，2006)。国际公开WO2007/023875记载了利用层粘连蛋白-5培养间充质系干细胞的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2007/069666
专利文献2：国际公开WO2007/023875
专利文献3：日本特开2001-172196号公报
非专利文献
非专利文献1：Nature.292，154-156，1981
非专利文献2：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.78，7634-7638，1981
非专利文献3：Science.282，1145-1147，1998
非专利文献4：Nature.336，684-687，1988
非专利文献5：Nature.336，688-690，1988
非专利文献6：Dev.Biol.227，271-278，2000
非专利文献7：Nature Biotech.19，971-974，2001
非专利文献8：Cell.126，663-672，2006
非专利文献9：Science.318，1917-1920，2007
非专利文献10：Nature Biotech.24，185-187，2006
非专利文献11：Stem Cell.24，2649-2660，2006
非专利文献12：Matrix Biol.，18：19-28，1999
非专利文献13：Dev.Dyn.，218：213-234，2000
非专利文献14：宫崎等，实验医学Vol.16 No.16(增刊)1998年第114-119页
非专利文献15：J.Neurosci.，20：6517-6528，2000
非专利文献16：Physiol.Rev.85，979-1000，2005
非专利文献17：J.Cell Biol.114，567-576，1991
非专利文献18：Cell.65，599-610，1991
非专利文献19：J.Invest Dermatol.101，738-743，1993
非专利文献20：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.90，11767-11771，1993
非专利文献21：J.Biochem.116，862-869，1994
非专利文献22：J.Cell Biol.125，205-214，1994
非专利文献23：Mol.Biol.Cell.16，881-890，2005
非专利文献24：Stem Cell.24，2346-2354，2006
非专利文献25：Dev.Biol.163：p.288-292，1994
非专利文献26：Dev.Biol.127：p.224-227，1988
非专利文献27：Reprod.Fertil.Dev.6：p.563-568，1994
非专利文献28：Reprod.Fertil.Dev.6：p.553-562，1994
非专利文献29：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：p.7844-7848，1995
非专利文献30：Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726-13731， 1998
非专利文献31：Nature Biotech.，18，p.399-404，2000
非专利文献32：Nature 439：216-219，2006
非专利文献33：Cell Stem Cell 2：113-117，2008
非专利文献34：Stem Cells 24：2669-2676，2006
非专利文献35：Curr.Biol.，11：p.1553-1558，2001
非专利文献36：Nature Biotechnol 26：101-106，2008
非专利文献37：Cell Stem Cell 2：10-12，2008
非专利文献38：Cell 131：861-872，2007
非专利文献39：高桥和山中，细胞工学，Vol.27，No.3，252-253，2008
非专利文献40：J.Biol.Chem.，280(2005)，14370-14377
非专利文献41：J.Biol.Chem.269：p.22779-22787，1994
非专利文献42：J.Biol.Chem.269：p.11073-11080，1994
非专利文献43：J.Cell.Biol.119：p.679-693，1992
非专利文献44：Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997
非专利文献45：J.Mol.Biol.215：403-410，1990
非专利文献46：J.Mol.Biol.147：195-197，1981
非专利文献47：Cell 70：841-847，1992
非专利文献48：Development 120，3197-3120，1994
非专利文献49：Biology of Reproduction 69：612-616，2003
非专利文献50：Biology of Reproduction 72：985-991，2005
非专利文献51：Cell 119：1001-1012，2004
非专利文献52：Nature 440：1199-1203，2006
非专利文献53：Mol.Reprod.Dev.36：p.424-433，1993
非专利文献54：Nature 454：646-650，2008
非专利文献55：Cell 136：411-419，2009
非专利文献56：Cell Stem Cell 3：568-574，2008
非专利文献57：Science 322：945-949，2008
非专利文献58：Science 322：949-953，2008
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于，提供在不使用支持细胞、血清等动物性材料的体系中有效地增殖多能性干细胞的技术。
本发明人等，为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，本发明人等通过利用胞外基质分子中的层粘连蛋白-5，即使不使用支持细胞和血清，也能使多能性干细胞在保持未分化状态下进行增殖，从而完成了本发明。
由此，为了解决上述课题，本发明提供了一种增殖多能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中培养该多能性干细胞的工序。
本发明还提供了层粘连蛋白-5作为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用途。
本发明进一步提供了包含用层粘连蛋白-5处理过的培养容器和血清替代品的多能性干细胞的培养用试剂盒。
本发明的优选方式包含如下方式。
[方式1]
一种增殖多能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中培养该多能性干细胞的工序。
[方式2]
根据方式1所述的方法，其中，所述多能性干细胞为诱导多 能性干细胞。
[方式3]
根据方式1或方式2所述的方法，其中，所述诱导多能性干细胞为人的诱导多能性干细胞。
[方式4]
根据方式1所述的方法，其中，所述多能性干细胞为选自由胚胎干细胞、胚胎生殖干细胞和种系干细胞组成的组中的细胞。
[方式5]
根据方式4所述的方法，其中，所述多能性干细胞为胚胎干细胞。
[方式6]
根据方式1～方式5中任一项所述的方法，其中，在培养基中含有血清替代品。
[方式7]
根据方式6所述的方法，其中，所述血清替代品含有：选自由甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸组成的组中的1种或多种氨基酸，由硫胺素和/或抗坏血酸组成的维生素，选自由银、铝、钡、镉、钴、铬、锗、锰、硅、钒、钼、镍、铷、锡和锆组成的组中的1种或多种微量金属元素，选自由溴、碘和氟组成的组中的1种或多种卤素、以及选自由白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素和亚硒酸钠组成的组中的1种或多种成分。
[方式8]
根据方式1～方式7中任一项所述的方法，在含有层粘连蛋白-5的基础上进一步含有其他胞外基质蛋白的体系中培养所述多能性干细胞。
[方式9]
根据方式8所述的方法，其中，所述其他胞外基质蛋白为胶原蛋白。
[方式10]
根据方式1～方式9中任一项所述的方法，其在用层粘连蛋白-5处理过的培养容器中培养所述多能性干细胞。
[方式11]
根据方式10所述的方法，其中，所述层粘连蛋白-5为人层粘连蛋白-5。
[方式12]
根据方式1～方式11中任一项所述的方法，其中，所述多能性干细胞在培养中不发生分化。
[方式13]
层粘连蛋白-5作为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用途。
[方式14]
一种多能性干细胞的培养用试剂盒，其包含用层粘连蛋白-5处理过的培养容器和血清替代品。
发明的效果
根据本发明，即使不使用支持细胞和血清，也能够使多能性干细胞在维持未分化状态下有效地增殖。
附图说明
图1为用SDS聚丙烯酰胺凝胶对纯化后的重组人层粘连蛋白-5进行电泳而得到的图。另外图1右侧的泳道为对1μg的重组人层粘连蛋白-5进行电泳而得到的结果。
图2为比较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白给对 ES细胞的粘附效果所带来的效果的图。图2的A表示培养30分钟后进行粘附实验的结果，图2的B表示培养60分钟后进行粘附实验的结果。
图3为比较在支持细胞的非存在下胞外基质蛋白给ES细胞的增殖所带来的效果的图。图3为增殖检测的结果，圆形标识表示S+G1，菱形标识表示K+Lm5-4，×标识表示K+Lm5-2，星号标识表示K+Lm-Mix，小黑方型标识表示K+Mg。
图4为比较在支持细胞的非存在下胞外基质蛋白给ES细胞的长期传代培养所带来的效果的图。图4为增殖检测的结果，圆形标识表示S+G1，菱形标识表示K+Lm5-4，×标识表示K+Lm5-2，三角标识表示K+Lm5-4→S+G1。
图5所示为在经重组人层粘连蛋白-5包被后的培养板中、在无血清培养基中长期传代培养的ES细胞的形态以及将其恢复至在经明胶包被培养板中、在血清培养基中培养时的细胞的形态的图。图5自上而下分别表示S+G1的结果、K+Lm5-4的结果、K+Lm5-4→S+G1的结果。
图6为在添加有KSR的培养基中培养ES细胞时对各培养条件下各种未分化标记的表达进行比较的RT-PCR的图。
图7所示为将用添加有KSR的培养基培养的ES细胞在不含有LIF的维持培养基中进行培养时的胚状体的状态的图。图7的比例尺条为250μm。
图8所示为在经明胶包被培养板中对用血清培养基的培养体系(S+G1)中的ES细胞的分化能力进行研究的结果的图(实施例5)。图8的上段为S+G1(LIF+)的结果，下段为S+G1(LIF-)的结果。图8中的比例尺条为100μm，1个星号标识表示比例尺条为50μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图9所示为在经明胶包被培养板中、在添加有KSR的无血清培养基的培养体系(K+Gl)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+Gl)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图(实施例5)。图9的上段为 的结果，下段为的结果。图9中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。。
图10所示为在经4μg/ml的重组人层粘连蛋白-5包被后的培养板中、在添加有KSR的无血清培养基的培养体系(K+Lm5-4)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+Gl)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图10的上段为 的结果，下段为 的结果。图10中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图11所示为在经2μg/ml的重组人层粘连蛋白-5包被后的培养板中、在添加有KSR的无血清培养基的培养体系(K+Lm5-2)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图11的上段为 的结果，下段为 的结果。图11中的比例尺条为100μm，1个星号标识表示比例尺条为50μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图12为在支持细胞的非存在下使用添加有实施例6所述的血清代替物的培养基(培养基Y)进行ES细胞的长期传代培养时，对胞外基质蛋白所带来的效果进行比较的图。图12为增殖检测的结果，三角标识表示Y+G1，×标识表示Y+Lm5-4，星号标识表示Y+Lm5-2，圆形标识表示K+Lm-Mix，+表示Y+Mg。
图13为在培养基Y中培养ES细胞时，对在各培养条件下各种未分化标记的表达进行比较的RT-PCR的图。
图14所示为在培养基Y中培养ES细胞后在不含有LIF的维持培养基中进行培养时的胚状体的状态的图。图14的比例尺条为250μm。
图15所示为在经明胶包被培养板中、在用血清培养基的培养体系(S+G1)中对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图(实施例7)。图15的上段为S+G1(LIF+)的结果，下段为S+G1(LIF-)的结果。图15中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图16所示为在经明胶包被培养板中、在添加有KSR的无血清培养基的培养体系(K+G1)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图(实施例7)。图16的上段为 的结果，下段为的结果。图16中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图17所示为在经明胶包被培养板中、在用培养基Y的培养体系(Y+G1)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图17的上段为 的结果，下段为 的结果。图17中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图18所示为在经4μg/ml的重组人层粘连蛋白-5包被后的培养板中、在用培养基Y的培养体系(Y+Lm5-4)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图18的上段为 的结果，下段为 的结果。图18中的比例尺条为100μm，**表示比例尺条为25μm。
图19所示为在经2μg/ml的重组人层粘连蛋白-5包被后的培 养板中、在用培养基Y的培养体系(Y+Lm5-2)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图19的上段为 的结果，下段为 的结果。图19中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图20所示为在Lm-Mix与培养基Y的培养体系(Y+Lm-Mix)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图20的上段为 的结果，下段为 的结果。图20中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图21所示为在Mg与培养基Y的培养体系(Y+Mg)中培养后，恢复至用血清培养基的培养体系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图21的上段为 的结果，下段为 的结果。图21中的比例尺条为100μm，2个星号标识表示比例尺条为25μm。
图22所示为在饲养细胞上的人iPS细胞的形态的图。图22的左侧表示201B2的形态，右侧表示201B7的形态。图22的比例尺条为1mm。
图23所示为比较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白给对人iPS细胞的粘附效果所带来的影响的粘附实验的结果的图。
图24所示为粘附实验中比较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白给对人iPS细胞的粘附效果所带来的影响时的、细胞的粘附形态的图。图24的比例尺条为250μm。
图25所示为比较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白对形成人iPS细胞的集落的效果的集落检测的结果的图。图25的 上段为“单个”的结果，下段为“团块”的结果。
图26A所示为对于在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白上由单个细胞所形成的人iPS细胞的集落是否维持有未分化性进行研究的结果的图。图26A为以“单个”进行集落检测时的免疫染色的结果，比例尺条为250μm。
图26B所示为对于在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白上由细胞块所形成的人iPS细胞的集落是否维持有未分化性进行研究的结果的图。图26B为在“团块”上进行集落检测时的免疫染色的结果，比例尺条为250μm。
图27所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白上所形成的人iPS细胞进行长期传代培养时的、培养5周的人iPS细胞的形态的图。就各个胞外基质而言，比例尺条在左侧为1mm，比例尺条在右侧为100μm。
图28所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白的存在下培养人iPS细胞时的、各种未分化标记的表达进行研究的结果的图。
图29所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白的存在下培养的人iPS细胞进行分化诱导时的、人iPS细胞的形态的图。图29的比例尺条为1mm。
图30所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白的存在下培养的人iPS细胞进行分化诱导时的、各种分化标记的表达进行研究的结果的图。
具体实施方式
以下，基于实施方式详细说明本发明的详细内容以及其他特征和优点。
1.增殖多能性干细胞的方法
本发明提供一种增殖多能性干细胞的方法。本发明的方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中培养该多能性干细胞的工序。
多能性干细胞
本发明中所述“多能性干细胞”，是指具有分化成所有组织的细胞的能力(分化多能性)的干细胞的总称。在本说明书的后述实施例中使用ES细胞进行了研究，能通过本发明的方法增殖的多能性干细胞，不仅限于胚胎干细胞，还包括来源于哺乳动物的成体脏器或组织的细胞、骨髓细胞、血液细胞、以及胚或胎儿的细胞等的、具有与胚胎干细胞类似的性状的所有多能性干细胞。此种情况下，所述与胚胎干细胞类似的性状，可定义为胚胎干细胞中特异的表面(抗原)标记的存在或胚胎干细胞特异的基因的表达、或畸胎瘤(teratoma)形成能力等胚胎干细胞所具有的特异的细胞生物学性质。
并非对其进行限定，作为能够通过本发明的方法增殖的细胞的具体例，可列举出例如，胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能性干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、种系干细胞(GS细胞)等。另外，作为本发明的多能性干细胞优选ES细胞和iPS细胞。根据不构成伦理性的问题等的理由，特别优选iPS细胞。
本说明书的“ES细胞”，是指：取得处于发育初期的、具有分化成构成个体的所有组织细胞的能力的多能性干细胞并株化后的、能够在体外培养的细胞。ES细胞与初期胚中的多能性干细胞同样也能够在保持分化成构成个体的所有细胞的能力的状态下实际上无限制地增殖。
具体而言，ES细胞中，于1981年首次记载了小鼠的ES细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，7634-7638，1981，Nature292，154-156， 1981)。ES细胞具有分化多能性，能够产生构成个体的所有的组织和细胞类型。
已从包括大鼠(Iannaconns et al.，Dev.Biol.163，288-292，1994)、仓鼠(Dev.Biol.127，224-227，1988)、家兔(Mol.Reprod.Dev.36，424-433，1993)、鸟类、鱼类、猪(Reprod.Fertil.Dev.6，563-568，1994)，牛(Reprod.Fertil.Dev.6，553-562，1994)、以及灵长类(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，7844-7848，1995)在内的多种多样的物种中分离获得分化多能性胚胎干细胞。
若干研究小组在分离来自胚性人体组织的ES细胞和ES细胞样干细胞方面也取得了成功。初期的成功例如以下所述。(Science 282，1145-1147，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，13726-13731，1998，Nature Biotech.，18，399-404，2000)。通过在饲养细胞上培养从胚泡分离的ICM而建立了这些ES细胞株。在其他最近的研究中显示，通过将胚和成熟哺乳动物细胞来源的核移植到去核卵母细胞中能够获得胚和胚性细胞。
2006年，Advanced Cell Technology公司的Robert Lanza等的研究小组，在小鼠和人的胚盘中，仅使用胚泡期以前的卵裂期的胚的单卵裂球，在不损害胚的发育能力的前提下，成功地建立了ES细胞(Nature 439：216-219，2006，Cell Stem Cell 2，113-117，2008)。通过开发该技术能够不破坏受精卵地进行ES细胞的建立。同年，纽卡斯尔大学的Miodrag Stojkovic等的研究小组从停止发育的人胚中成功地建立了ES细胞(Stem Cells24，2669-2676，2006)。由此，因不孕而在治疗中被废弃的过剩的卵能够得以使用。
此外，2004年芝加哥生殖遗传学研究所的Yury Verlinsky等的研究小组成功地从具有遗传病的人的胚建立20个ES细胞株。这些是可在深刻的遗传病的治疗研究中使用的最初的ES细胞。 Yury Verlinsky现在还保有另外的基因不同的200株以上的ES细胞，这些可在药品的筛选(分选)等中使用。
本发明的方法中能够使用任意建立的ES细胞株。有时，为了防止将通过本发明的方法制成的ES细胞适用在个体时的免疫排斥反应，使用个体的体细胞制成克隆胚(cloneembryos)再依此建立ES细胞株的方法是有效的。只要使用该方法，就能够建立与个体具有同一遗传要素的ES细胞。
有时，在制作体细胞克隆时被导入到卵子的体细胞的核变成与受精卵的核类似的状态，认为发生了称之为“再编程(reprogramming)”的现象。据报道，ES细胞具有与卵子所具备的此种活性类似的活性(Curr.Biol.，11，1553-1558，2001)。即，通过将个体的体细胞和ES细胞融合，可期待将体细胞变换成ES细胞这样的细胞。由于ES细胞能够在体外进行基因操作，因此通过在预先操作了MHC基因组等与免疫排斥相关的因子的ES细胞中进行上述操作，可以期待不使用制作体细胞克隆胚等的手法来回避排斥反应。
本发明中，“ES细胞”优选为人的ES细胞，现在，已建立的人ES细胞株可从例如京都大学再生医科学研究所获得。
或者，ES细胞还可根据本说明书中上述各种文献的记载来制得。
本说明书的“iPS细胞”是指，通过向体细胞中导入Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等转录因子的基因而获得的、具有与ES细胞类似的分化多能性的细胞。因此，iPS细胞也与ES细胞同样，能够在保持分化多能性的状态下无限制地增殖。
京都大学山中伸弥等的研究小组，为了仅分离出从体细胞变化成ES样细胞的细胞，而着眼于仅在ES细胞中表达、而在维持ES细胞的分化多能性方面非必要的Fbx15这一基因。使用同 源重组技术在该基因部位导入新霉素耐性基因，在培养基中添加因该耐性基因而不显示出毒性的G418，从而构建出仅使表达Fbx15的ES样细胞获得G418耐性且留存下来而通常未表达Fbx15的体细胞死灭的实验体系。使用该实验体系建立iPS细胞时，发现采用Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc4基因就足够了(Cell.126，663-672，2006)。
此外，该研究小组还使用了与小鼠iPS细胞建立中所使用的小鼠基因同源的人基因即OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC，成功地从成纤维细胞建立了人iPS细胞(Cell.131，861-872，2007)。
同时，世界上首次建立人ES细胞的詹姆斯·汤姆森(James Thomson)等的研究小组使用了与京都大学山中伸弥等成功建立小鼠iPS细胞时相同的战略，通过向胎儿肺来源的成纤维细胞或新生儿包皮来源的成纤维细胞中导入OCT3/4、SOX2、NANOG、LIN28这四种在人ES细胞中特异地表达的基因，成功地建立了人iPS细胞(Science 318：1917-1920，2007)。
此外，2007年12月，京都大学山中伸弥等的研究小组表示，不导入c-Myc的基因而仅通过Oct-4、Sox2、Klf4三个因子也能够建立小鼠和人的iPS细胞，成功地抑制了iPS细胞变化成癌细胞(Nat.Biotechnol.26：101-106，2008)。几乎与此同时，在马萨诸塞工科大学的鲁道夫·詹尼士(Rudolf Jaenisch)等的研究小组也成功地以小鼠完成了同样的实验(Cell Stem Cell 2：10-12，2008)。
另外，为了回避致癌等风险，作出了进一步减少导入的因子的尝试。其结果MaxPlanck研究所的汉斯·斯科勒(Hans R Scholer)等，在成体小鼠的神经干细胞中导入2个基因即Oct4和Klf4、或者Oct4和c-Myc中的任意一组，从而成功地建立了iPS细胞(Nature454：646-650，2008)。此外，最近汉斯·斯科勒(Hans R Scholer)等报道，在从神经干细胞制作iPS细胞时，仅单独导入Oct4也是足够的(Cell 136：411-419，2009)。
此外，Sheng Ding等报道了在诱导iPS细胞时能够以低分子对部分基因进行辅助(Cell Stem Cell 3，568-574，2008)。报道显示，通过利用BIX、BayK这些低分子，仅在小鼠胚胎性成纤维细胞中导入Oct4和Klf4两个基因就能够诱导iPS细胞。
此外，在诱导iPS细胞时作出了改善基因导入方法的尝试。现在广泛使用的是反转录病毒这样的、导入的基因整合到染色体的可能性高的病毒，据报道有使用整合的可能性低的腺病毒(Science 322，945-949，2008)、质粒载体(Science 322，949-953，2008)的方法。
本发明中，“iPS细胞”优选为人的iPS细胞，现在，所建立的人iPS细胞株，可从例如京都大学、理化学研究所生物资源中心获得。
或者，也可参考以下文献的记载制作iPS细胞。例如，诱导多能性干细胞可按照京都大学山中伸弥教授的研究小组的文献(Cell 131，861-872，2007，Nat.Biotechnol.26，101-106，2008)，Wisconsin大学的Thomson的研究小组的文献(Science 318，1917-1920，2007)中记载的方法来制作。
具体而言，iPS细胞可如下制作：对任意的体细胞导入Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、Nanog、LIN28中的至少一个以上基因，检测多能性干细胞的特异的基因或蛋白质的表达，以对这些进行分选。
这样制作的iPS细胞，与ES细胞同样，能够在失去增殖活性的小鼠成纤维细胞或能够代替其的细胞存在下与碱性成纤维细胞生长因子一起进行培养，并与ES细胞同样能够用作多能性干细胞。
到目前为止，已明确该iPS细胞在分化成各种组织的特征方面或在细胞内进行基因表达的特征方面具有与ES细胞同样的性状(Cell.126，663-672，2006，Cell 131：861-872，2007，Science318，1917-1920，2007)，可直接将ES细胞的培养条件或从ES细胞分化诱导各种组织的条件应用于iPS细胞(高桥和山中，细胞工学，Vol.27，No.3，252-253，2008)。
本说明书的“EG细胞”是指从原始生殖细胞制作的任意的胚胎生殖干细胞，其起源等没有特别的限制。
此外，本说明书中的“GS细胞”，是从精巢的生殖细胞制作的种系干细胞，其是为了能够在体外培养精原干细胞(精子干细胞)而制成的细胞株(Cell.119，1001-1012，2004)。GS细胞中特别优选具有与ES细胞同样的性质且具有分化多能性的mGS细胞(multipotentgermline stem cell，多能种系干细胞)。本说明书中记载为“GS细胞”的情况，根据上下文可能意味着mGS细胞。
层粘连蛋白-5
本发明的方法最显著的特征为：在培养多能性干细胞时，在含有层粘连蛋白-5的体系中培养该多能性干细胞。
据报道，对于大多的细胞类型而言，层粘连蛋白-5与包含其他层粘连蛋白亚型的各种胞外基质蛋白相比表现出较强的粘附活性(J.Biochem.116，862-869，1994，J.CellBiol.125，205-214，1994，Mol Biol Cell.16，881-890，2005)。
如表1所示，层粘连蛋白-5为由α3链、β3链、γ2链构成的层粘连蛋白分子，对表皮与真皮的结合发挥出核心的作用，在大部分的细胞中优先与整合蛋白(integrin)α3β1结合，根据细胞还与整合蛋白α6β1、α6β4结合。已解明层粘连蛋白-5的α3链G2结构域的α3G2A序列(RERFNISTPAFRGCMKNLKKTS)、G3结 构域的KRD序列为对整合蛋白的主要的结合部位。
此外，据了解，层粘连蛋白-5作为三聚体被分泌后，受到蛋白酶的限制性水解(limited degradation)，从而除去存在于α3链C末端的G4和G5结构域，从190kDa(非剪切型)转换为160kDa(剪切型)。用通常的方法分离的层粘连蛋白-5不存在G4、G5结构域。据了解，这种α3链剪切型层粘连蛋白-5与非剪切型层粘连蛋白-5相比，具有高的细胞粘附促进活性、运动促进活性、和神经再生促进活性(J.Biol.Chem.，280(2005)，14370-14377)。
本发明的层粘连蛋白-5，没有特别的限制，可以为含有G4和G5结构域状态的非剪切型，或者也可为除去G4和G5结构域全部或部分的剪切型。
此外，层粘连蛋白-5蛋白质可以为天然型，或者也可为保持其生物学的活性、尤其是细胞粘附促进活性的状态下的、1个以上的氨基酸残基被修饰后的修饰型。此外，本发明的层粘连蛋白-5蛋白质只要具有本说明书记载的特征即可，其起源、制法等不受限制。即，本发明的层粘连蛋白-5蛋白质可以为由天然产的蛋白质、通过基因工程的手法得到的重组DNA所表达的蛋白质、或者化学合成蛋白质的任一种。
层粘连蛋白-5蛋白质的来源没有特别的限制，优选为人来源的蛋白质。在为了获得再生医疗材料等而培养人多能性干细胞时，从避免使用来源于其他动物的材料的意义来看，优选使用人来源的层粘连蛋白-5。
本说明书中的序列表的序列号1～6表示人层粘连蛋白-5的α3链、β3链和γ2链的碱基序列和氨基酸序列。本发明中使用的层粘连蛋白-5蛋白质，优选为由下述的α3链、β3链和γ2链的各亚基构成的蛋白质：所述α3链为具有序列号2的氨基酸序列或该 序列中1个以上的氨基酸缺失、附加、或置换的氨基酸序列(氨基酸残基No.1-No.1713)(J.Biol.Chem.269，22779-22787，1994)；所述β3链为具有序列号4的氨基酸序列或该序列中1个以上的氨基酸缺失、附加、或置换的氨基酸序列(氨基酸残基No.1-No.1170)(J.Biol.Chem.269，11073-11080，1994)；及，所述γ2链为具有序列号6的氨基酸序列或该序列中1个以上的氨基酸缺失、附加、或置换的氨基酸序列(氨基酸残基No.1-No.1193)(J.Cell.Biol.119，679-693，1992)。
α3链的球状结构域(G1-G5结构域)分别相当于序列号1的氨基酸残基No.794-No.970、No.971-No.1139、No.1140-No.1353、No.1354-No.1529和No.1530-No.1713。
层粘连蛋白-5的各链为具有对应序列号表示的氨基酸序列中缺失、附加、或置换1个以上的氨基酸残基的氨基酸序列。这种具有与天然的蛋白质同源的氨基酸序列的蛋白质也可在本发明中使用。在α3链、β3链和γ2链的各氨基酸序列中，可变更的氨基酸数并没有限定，优选为1～300个氨基酸残基、1～200个氨基酸残基、1～150个氨基酸残基、1～120个氨基酸残基、1～100个氨基酸残基、1～80个氨基酸残基、1～50个氨基酸残基、1～30个氨基酸残基、1～20个氨基酸残基、1～15个氨基酸残基、1～10个氨基酸残基、1～5个氨基酸残基。更优选为能够通过公知的定点突变法修饰的数个氨基酸残基，例如，1～10个氨基酸残基、1～5个氨基酸残基。
众所周知，在本技术领域中通过进行氨基酸的保守置换能够获得保持原有功能的蛋白质或多肽。此种置换包括用具有类似的物理化学特性的残基置换氨基酸，例如，用其他残基置换1个脂肪酸残基(Ile、Val、Leu或Ala)；或者在碱性残基Lys和Arg、酸性残基Glu和Asp、酰胺残基Gln和Asn、羟基残基Ser和Tyr、 或芳香族残基Phe和Tyr之间进行置换。
此外，本发明中使用的层粘连蛋白-5可以为与序列号2、4、6所记载的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的同源性，且能够促进细胞粘附活性的蛋白质。对层粘连蛋白-5与层粘连蛋白-1的构成亚基的结构进行比较时，各亚基间的氨基酸序列的同源性为50％以下。尤其上述的α链的G结构域的同源性低，为约25％。
同源性通过相同残基的数目除以已知的序列或已知序列结构域中的残基的总数再乘以100来计算。使用标准的参数来决定序列的同源性的计算机程序，可利用例如GappedBLAS T PSI-BLAST(Nucleic Acids Res.25，3389-340，1997)、BLAST(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)、和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147：195-197，1981)。优选使用这些程序的默认设定，但可根据要求改变这些设定。
本发明的层粘连蛋白-5蛋白质除了具有本说明书记载的特征外，其起源、制法等不受限制。即，本发明的层粘连蛋白-5蛋白质可以为分泌层粘连蛋白-5的人或动物细胞的培养液上清、或从该培养上清纯化得到的天然型层粘连蛋白-5蛋白质。然而通过使用本技术领域中已知的重组DNA技术来表达各亚基从而能够有效地制造作为基因重组蛋白质的层粘连蛋白-5。然而从避免不必要的动物性因子的意义出发，特别优选获得的层粘连蛋白-5为人重组蛋白质。
基于包含编码层粘连蛋白-5α3链的序列号1的核酸残基No.1-No.5139的DNA序列、编码β3链的序列号3的核酸残基No.121-No.3630及编码γ2链的序列号5的核酸残基No.118-No.3696的碱基序列来设计引物，以适当的cDNA文库作为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增目标序列，从而可以制造层粘连 蛋白-5。此种PCR手法为本技术领域中所广泛知晓的手法，记载于例如“PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications”，Academic Press，Michael，et al.，1990”。
将编码层粘连蛋白-5的各链基因的DNA引入适当的载体中，使用可在各种宿主中表达的表达载体将其导入真核生物或原核生物细胞的任一者中，使其表达各个链，从而得到所期望的蛋白质。能够用于表达层粘连蛋白-5的宿主细胞，没有特别的限制，可列举出大肠杆菌、枯草杆菌等原核宿主细胞，以及酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等真核生物宿主。另外，特别优选以下述的实施例中所使用的人胎儿肾细胞株HEK293作为宿主细胞。
通过转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射(direct microinjection)等能够将为表达层粘连蛋白-5而构建的载体导入上述宿主细胞中。使含有载体的细胞在适当的培养基中生长，产生本发明中使用的层粘连蛋白-5蛋白质，从细胞或培养基中纯化，从而获得层粘连蛋白-5蛋白质。纯化通过使用尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography)、HPLC、离子交换色谱法、和免疫亲和色谱法(immunoaffinity chromatography)等来进行。
对于层粘连蛋白-5，在日本特开2001-172196中有详细的记载，援引于本说明书中。
增殖多能性干细胞的方法
本发明中，在含有层粘连蛋白-5的体系中培养多能性干细胞。本发明中“含有层粘连蛋白-5的体系”，是指在多能性干细胞的培养体系中以任意的状态含有层粘连蛋白-5，其方式没有特别的限制。
本发明中，为了在含有层粘连蛋白-5的体系中培养多能性 干细胞，优选的方式为使用用层粘连蛋白-5处理后的培养容器。但并非限定于此，本发明的“含有层粘连蛋白-5的体系”还包括为了培养多能性干细胞而在培养基中添加层粘连蛋白-5的方式等。
此外，本发明中“用层粘连蛋白-5处理后的培养容器”，是指对其表面实施层粘连蛋白-5包被等处理的培养容器。此外本发明的“培养容器”，没有特别的限制，为了防止细菌的混入可使用灭菌处理后的、且适合于培养细胞的任意材料、任意形状的容器。作为此种培养容器的例子，可列举出本技术领域中一般使用的培养皿、培养烧瓶、培养盘、96孔板、48孔板、12孔板、6孔板、4孔板等培养板、培养瓶等，但并不限定于此。对培养容器的表面用层粘连蛋白包被的处理技术，为本技术领域公知的技术，本领域技术人员，可根据本发明的目的而采用任意的培养容器并将该容器用层粘连蛋白-5进行处理，使用层粘连蛋白-5处理后的该容器用于通过本发明的方法培养多能性干细胞。
处理培养容器时所使用的层粘连蛋白-5的量，没有特别的限制。优选的是，在以0.05μg/ml以上、优选0.5～15μg/ml、更优选3.75μg/ml～15μg/ml的层粘连蛋白-5溶液进行处理时，能够获得良好的结果。
如本说明书中后述的下述实施例所述，本发明人等发现，对于小鼠ES细胞，重组人层粘连蛋白-5与Matrigel、层粘连蛋白混合物或其他胞外基质蛋白相比，表现出较强的粘附活性，从而完成了本发明。此外，还发现本发明中能够用LIF和无血清培养基用以重组人层粘连蛋白-5包被后的培养板在MEF非存在下维持培养小鼠ES细胞。在MEF非存在下的小鼠ES细胞的培养以往在用以明胶包被后的培养板在胎牛血清(FBS)存在下进行。 采用本发明的方法进行培养时，小鼠ES细胞在不存在MEF和FBS的条件下也能表现出与通常法同等的增殖，进而还可以确认维持其未分化性。此外，采用本发明的方法进行培养时，还维持了其分化多能性。
此外，还进行了人iPS细胞的研究，结果如下述的实施例所示，对于人iPS细胞，重组人层粘连蛋白-5也表现出较强的粘附活性。此外，用以重组人层粘连蛋白-5包被后的培养板培养人iPS细胞时，在无血清的条件下形成集落，从而能够进行维持培养。进而，通过本发明的方法培养的人iPS细胞维持了未分化性。
因此，本申请发明的方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中培养多能性细胞的工序。更优选在不含有人以外的动物性来源的物质的培养基中进行培养。
关于人ES细胞，过去作为代替MEF的支持材料，尝试了Matrigel、纤连蛋白、层粘连蛋白-1、1型胶原蛋白、4型胶原蛋白等多种胞外基质蛋白，其粘附活性均为数％以下(StemCell.24，2649-2660，2006)。本发明中，通过在细胞粘附效率极差的、多能性干细胞，例如人ES细胞或人iPS细胞的维持培养中利用层粘连蛋白-5的较强的粘附活性，能够改善在MEF非存在下的粘附效率和增殖效率。此外，为了将人ES细胞或人iPS细胞利用于再生医疗，作为构建完全不含有动物来源的物质的培养体系的材料，重组人层粘连蛋白-5是有用的。
这样，本发明中，通过用层粘连蛋白-5进行处理，多能性干细胞对培养容器的细胞粘附效率提高，即使不使用通常在多能性干细胞的培养中所需的支持细胞，也能够有效地增殖该细胞。
本说明书中的“支持细胞(饲养细胞)”，是指为了达到使多能性干细胞发生增殖或分化的目的而调整培养条件时所使用 的发挥辅助作用的其他细胞。在ES细胞、iPS细胞等多能性细胞的情况下，采用以往的一般方法，使用小鼠来源的初代培养成纤维细胞作为支持细胞，从而由该支持细胞向多能性细胞提供生长因子等营养物，因此使细胞的培养成为可能。根据本发明，通过层粘连蛋白-5的强力的粘附效率，即使不使用所述支持细胞，也能够培养ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞。
此外，本发明中“支持材料”是指为了辅助细胞的增殖而使用的蛋白质性的因子，本发明中使用层粘连蛋白-5作为支持材料。如下述的实施例中所示，层粘连蛋白-5与各种胞外基质相比，具有较高的粘附能力，作为多能性干细胞的支持材料是优异的。
此外，本发明中多能性干细胞的“分化”，是指丧失具有分化成所有组织的潜在能力即丧失分化多能性，变成具有构成特定组织的细胞的性状。例如可通过测定Ecat1、ERas、Nanog、Oct4、Rex1、Sox2、Utf1等多能性干细胞的未分化标记，评价培养中的多能性干细胞是否未发生分化。如下述的实施例3、4所示，评价由本发明的方法培养的ES细胞的传代导致的分化，结果显示，进行10次以上传代培养也未发生分化，保持了未分化状态。此外，如下述实施例5所示，通过由本发明的方法培养的ES细胞的传代评价了分化多能性的维持，结果仍显示，即使进行传代也维持了分化多能性。
此外，如下述实施例11所示，由本发明的方法培养的人iPS细胞，进行5周传代培养也未发生分化，保持了未分化状态。此外，如下述实施例12所示，对本发明培养的人iPS细胞还能够诱导分化。
本发明的一个方式中，可通过在培养容器的内部表面包被层粘连蛋白-5后进行干燥等，用层粘连蛋白-5处理培养容器。 在层粘连蛋白-5处理后的培养容器中装入在GMEM、DMEM等多能性干细胞的培养中一般使用的培养基，在该培养基中添加多能性干细胞。接着，在公知的适当的培养条件下，例如在37℃、5％二氧化碳气相条件下等进行该多能性干细胞的培养，但这并非是进行限定。
本发明的优选的一个方式中，进一步优选，除了含有层粘连蛋白-5的体系外，还在培养基中加入适当的添加物。添加物优选为血清以外的添加物，更优选不含有人以外的动物来源的物质。
并非对其进行限定，添加物的一个例子为血清替代品。血清替代品是指，使其含有与血清类似的成分而构成的人工的液体组合物，通过添加该血清替代品，即使在血清不存在的情况下也能够增殖细胞。另外，作为血清替代品的一个例子，可使用添加有各种氨基酸、无机盐类、维生素、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、抗氧化成分的血清替代品。各种氨基酸包括例如，甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-羟基脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等。无机盐类包括例如AgNO3、AlCl3·6H2O、Ba(C2H3O2) 2、CdSO4·8H2O、CoCl2·6H2O、Cr2(SO4)3·1H2O、GeO2、Na2SeO3、H2SeO3、KBr、KI、MnCl2·4H2O、NaF、Na2SiO3·9H2O、NaVO3、(NH4)6Mo7O24·4H2O、NiSO4·6H2O、RbCl、SnCl2、ZrOCl2·8H2O及亚硒酸钠等。维生素包括例如硫胺素、抗坏血酸等。抗氧化成分包括例如还原型谷胱甘肽等。
此外，KNOCKOUTTM血清替代品(KSR)为Invitrogen公司市售的ES细胞用血清替代品。如下述实施例3和实施例4那样， 本发明的优选的方式为在培养基中添加10％左右的KSR，并在该培养基中培养多能性干细胞。
此外，使用下述实施例6所示组成的血清替代品也是本发明的优选方式。实施例6中公开了包含甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等氨基酸，硫胺素、抗坏血酸等维生素，银、铝、钡、镉、钴、铬、锗、锰、硅、钒、钼、镍、铷、锡、锆等微量金属元素，溴、碘、和氟等卤素，以及，白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸钠等成分的血清替代品的组成。然而，构成本发明的血清替代品的成分，不限定于这些，可施加各种改变，如用类似的其他成分置换等。此外，血清替代品所含有的各成分的含量也不限定为实施例6所记载的内容，可根据细胞的性质、实验的目的而进行适当调整。
作为添加物，只要是与KSR同样的成分和发挥同样的功能的添加物即可。
2.层粘连蛋白-5作为细胞支持材料的用途
本发明还涉及层粘连蛋白-5作为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用途。如前所述那样，层粘连蛋白-5由于在细胞粘附中具有强力的作用，因此在不含有支持细胞和血清的培养基中培养多能性干细胞时层粘连蛋白-5是有用的。
3.多能性干细胞的培养用试剂盒
本发明进一步涉及包含用层粘连蛋白-5处理后的培养容器和血清替代品的多能性干细胞的培养用试剂盒。血清替代品优选为KNOCKOUTTM血清替代品(KSR)。有时，也可利用实施例6所示组成的血清替代品。
除此以外，该试剂盒可包含GMEM、DMEM等多能性干细胞的培养用的培养基。并且，若必要时，该试剂盒还可进一步 包含细胞培养所需的其他添加物、应培养的多能性干细胞。作为所述添加物的例子，可列举出非必需氨基酸、丙酮酸钠、巯基乙醇或抗生素。可以此种试剂盒作为1个包装体构成试剂盒，或者也可仅将需要低温保存的多能性干细胞分开包装从而制成的多个包装体形式的试剂盒。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行详细说明，本发明不受这些实施例的限制。
实施例1重组人层粘连蛋白-5(rLm5)的调制
本实施例中按照公知的方法调制重组人层粘连蛋白-5蛋白质。
将从导入了α3链(序列号1)、β3链(序列号3)、γ2链(序列号5)的cDNA的人胎儿肾细胞株HEK293(Lm 5-HEK293)回收的无血清培养上清在4℃、3000rpm下离心5分钟。人胎儿肾细胞株HEK293按照J.Biochem.132，607-612(2002)而获得。接着，加入到Heparinsepharose CL-6B(GE healthcare)中，并进行洗脱。将含rLm5的级分通过使Protein Asepharose CL-6B(GE healthcare)共价结合有小鼠抗Lm-α3(抗层粘连蛋白-α3)单克隆抗体(BG5)的抗体柱，接着进行洗脱。另外，单克隆抗体BG5为本发明人等用层粘连蛋白-α3B链N末端片段为抗原按照公知的单克隆抗体制作方法制成的抗体。
使1μg的纯化rLm5在还原条件下变性后，使用5～20％凝胶通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳确认了α3链、β3链、γ2链的大小、纯度，结果可确认出分别为160kDa、135kDa、105kDa的区带(band)。图1中示出对纯化rLm5进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
使用CS-Analyzer进行解析的结果，纯化rLm5的纯度为约 98％。在以下的实施例中使用上述那样调制出的rLm5。
实施例2使用了小鼠ES细胞株EB3的粘附实验
本实施例中示出了在使用各种细胞支持材料的情况下使用了小鼠ES细胞株EB3的粘附实验的结果。
使用添加有10％胎牛血清(FBS)、0.1mM非必需氨基酸(Gibco)、1mM丙酮酸钠(Gibco)、1000U/ml ESGRO(Chemicon)及10-4M 2-巯基乙醇(WAKO)的GMEM(SIGMA)作为小鼠ES细胞株即EB3细胞的维持培养基。EB3细胞接受由大阪大学医学系研究科未来医疗开发专业G6分子治疗学讲座干细胞控制领域提供的EB3细胞。
粘附实验中使用了未添加FBS的与维持培养基同样组成的无血清培养基。作为细胞支持材料，使用牛明胶(SIGMA)、rLm5、Matrigel(注册商标，BD)、人玻连蛋白(SIGMA)、人IV型胶原蛋白(BD)、人纤连蛋白(BD)、人层粘连蛋白-2(Chemicon)及人层粘连蛋白(SIGMA)。而且，按下述那样制作用各种细胞支持材料进行处理后的培养板，对各细胞支持材料进行了粘附实验。
用调整浓度后的各种胞外基质蛋白处理96孔板(Corning)，用1.2％BSA(SIGMA)溶液在37℃下封闭处理1小时。将各种胞外基质蛋白的浓度调制成明胶(G1)1.5mg/ml、层粘连蛋白-2(Lm2)3.75μg/ml、层粘连蛋白混合物(Lm-Mix)3.75μg/ml、Matrigel(Mg)150μg/ml、胶原蛋白(Co)15μg/ml、纤连蛋白(Fn)15μg/ml、玻连蛋白(Vn)15μg/ml。此外，rLm5(Lm5)调制成3.75μg/ml、7.5μg/ml及15μg/ml的3个等级的2倍稀释系列。
用无血清培养基洗涤EB3细胞后，以30000个/孔接种到培养板上，在37℃、5％CO2、95％空气的气相条件下培养30分钟及 60分钟。培养后，用涡旋混合器(vortex mixer)轻微振荡，使粘附弱的细胞从培养板表面浮起，用Percoll(GE healthcare)处理除去该细胞。将粘附的细胞用25％戊二醛(Nacalai)固定化，用2.5％结晶紫(Nacalai)染色，比较相对细胞数。
图2示出通过在培养30分钟及60分钟后测定OD595来评价各种胞外基质蛋白给EB3细胞的粘附所带来的影响的结果。由图2的结果可知，rLm5与包括Lm-Mix在内的其他各种胞外基质蛋白相比，表现出对EB3细胞较强的粘附活性。
另外，在粘附效率差的人ES细胞中，使用EHS来源层粘连蛋白时的粘附效率不足1％，在现在最广泛使用的Matrigel(50～60％EHS来源层粘连蛋白、30％IV型胶原蛋白、10％巢蛋白)中，粘附效率也只有3％。在本实施例中，使用小鼠ES细胞时，与以EHS层粘连蛋白为主要构成成分的Matrigel、层粘连蛋白-2、大量含有层粘连蛋白-10/11的胎盘来源的层粘连蛋白(Lm-Mix)相比，显示出更强的粘附活性。这认为是本发明中使用的层粘连蛋白-5的显著的效果。
实施例3使用了小鼠ES细胞株EB3的增殖检测
本实施例中示出使用各种细胞支持材料时使用了小鼠ES细胞株EB3的增殖检测的结果。
EB3细胞的维持培养基使用与实施例2相同的培养基。在增殖检测中使用添加了10％KNOCKOUTTM血清替代品(KSR)(Invitrogen)的培养基(KSR-GMEM)来代替10％FBS。在用调整浓度后的各种胞外基质蛋白处理后的12孔板(NUNC)上，以40000个/孔接种EB3细胞。在37℃、5％CO2、95％空气的气相条件下培养2天后，通过酶处理回收细胞，用计数板计量细胞数。
再次，在用浓度调整后的各种胞外基质蛋白处理后的12孔板上以40000个/孔接种EB3细胞。通过重复该操作，比较各种胞 外基质对EB3细胞的增殖效果。作为培养基使用维持培养基(S)和KSR-GMEM(K)。细胞支持材料分别调制成1mg/ml的G1、4μg/ml的rLm5(Lm5-4)、2μg/ml的rLm5(Lm5-2)、4μg/ml的Lm-Mix、150μg/ml的Mg。此外在该实验区内，使用预先以KSR-GMEM数次传代培养而驯化的EB3细胞。
图3示出对在支持细胞的非存在下在维持培养基(S)或KSR-GMEM(K)中培养时各种胞外基质给EB3细胞的增殖所带来的效果进行研究的结果。由图3的结果可确认，在起初的2～3次的传代中，K+Lm-Mix和K+Mg与其他实验区相比，增殖迟缓。
因此，对于K+Lm-Mix和K+Mg以外的实验区进一步持续传代。对胞外基质在支持细胞的非存在下对于EB3细胞的长期传代培养时的细胞增殖所带来的效果进行了研究。图4示出理论上计算出最终细胞增殖为几倍的结果。由图4的结果可知，rLm5表现出与以往作为ES细胞的维持培养体系而广泛使用的对照区(S+G1)同样的对于EB3细胞的增殖效果。
图5示出在维持培养的体系(S+G1)、rLm5的体系(K+Lm5)、及从rLm5恢复至维持培养体系的体系(K+Lm5-4→S+G1)中长期传代培养的EB3细胞的形态。如图5所示，K+Lm5的实验区的形态渐渐地变化为上皮细胞样，当恢复至通常的维持培养的体系时可确认到(K+Lm5-4→S+G1)再度形成集落。一般认为未分化的ES细胞形成集落，由上述结果得出如下启示：通过在K+Lm5的实验条件下长期传代培养，即使EB3细胞的形态变成上皮细胞样，也能够保持未分化性。
实施例4未分化性标记的检测
本实施例中，对已知的小鼠ES细胞未分化标记Ecat1、ERas、Nanog、Oct4、Rex1、Sox2、Utf1的基因用RT-PCR来测定这些 未分化标记，从而研究了rLm5是否对于EB3细胞具有维持未分化性的效果。
使用TRIZOL(Invitrogen)从实施例3中传代10次以上而培养的EB3细胞中提取总RNA。提取后，使用Thermo Script RT-PCR System(Invitrogen)通过逆转录反应合成cDNA。以合成的cDNA为模板使用表2所示的引物进行PCR反应。各基因的变性反应在94℃下进行30秒，退火反应进行30秒，伸长反应在72℃下进行20秒。有关退火反应，Ecat1在64℃的温度下进行，Eras、Oct4、Utf1在61℃的温度下进行，Rex1在59℃的温度下进行，Nanog、Sox2在54℃的温度下进行。
图6示出在各培养下对各种未分化标记的表达进行研究的结果。由该结果可知，与通常能够维持的实验条件(S+G1)同样，在rLm5包被且用KSR培养的实验条件下(K+Lm5-4，K+Lm5-2)，EB3细胞也表达出所解析的所有未分化标记。此外，可见，当恢复至通常的维持培养的体系(K+Lm5-4→S+G1)时，这些未分化标记的表达恢复至与用通常的维持培养体系(S+G1)持续培养时没有区别的程度。综上得出如下启示：即使用K+Lm5传代培养10次以上，EB3细胞也能够维持未分化性。
表2 RT-PCR引物
Ecat1
5’-TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT-3’(序列号7)
5’-ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT-3’(序列号8)
ERas
5’-ACTGCCCCTCATCAGACTGCTACT-3’(序列号9)
5’-CACTGCCTTGTACTCGGGTAGCTG-3’(序列号10)
Nanog
5’-AAGCAGAAGATGCGGACTGT-3’(序列号11)
5’-ACCACTGGTTTTTCTGCCAC-3’(序列号12)
Oct4
5’-TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC-3’(序列号13)
5’-TGCGGGCGGACATGGGGAGATCC-3’(序列号14)
Rex1
5’-ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA-3’(序列号15)
5’-TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT-3’(序列号16)
Sox2
5’-TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA-3’(序列号17)
5’-TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA-3’(序列号18)
Utf1
5’-GGATGTCCCGGTGACTACGTCTG-3’(序列号19)
5’-GGCGGATCTGGTTATCGAAGGGT-3’(序列号20)
Gapdh
5’-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3’(序列号21)
5’-GACGGACACATTGGGGGTAG-3’(序列号22)
实施例5 分化成3胚层系的分化能力的研究
本实施例中示出对使用各种细胞支持材料培养小鼠细胞株EB3时的分化能力的维持进行研究的结果。
在实施例3中添加了KSR的无血清条件化下培养EB3细胞后，在维持培养(S+G1)的条件下进一步传代5次，在血清条件下重新驯化后，进行分化诱导试验。作为无血清培养基中的培养条件，使用了明胶包被培养板的体系(K+G1)和重组人层粘连蛋白-5包被培养板的体系(K+Lm5-4、K+Lm5-2)。将它们在血清条件下驯化后的实验区标记为
分化诱导按以下步骤进行。在不含LIF(ESGRO)的维持培养基中悬浮细胞，制作1000个/滴的悬滴，2天形成胚状体。将所形成的胚状体转移到细菌培养板中，在不含有LIF的维持培养基中进一步悬浮培养5天。此时的胚状体的状态如图7所示。
将悬浮培养的胚状体转移到用1mg/ml的G1包被后的腔室玻片(chamber slide)(NUNC)上粘附培养3天后，用免疫染色检测分化标记，对ES细胞的分化能力(向内胚层系、中胚层系、外胚层系的细胞的分化)进行了研究。
此时，作为内胚层系的细胞的标记使用甲胎蛋白(AFP)，作为中胚层系的细胞的标记使用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，作为外胚层系的细胞的标记使用β-III微管蛋白(tubulin)。免疫染色如下实施：用4％甲醛将细胞固定化后，用添加了0.1％Triton-X100(Nacalai)的5％FBS溶液进行封闭。封闭后，用第一抗体和第二抗体处理，进一步进行DAPI(Nacalai)染色，用VECTASHIELD(VECTOR Laboratories)封片并用荧光显微镜进行观察，从而检测标记的表达。
作为免疫染色中的第一抗体，在检测甲胎蛋白时使用抗AFP多克隆抗体(DAKO)；在检测α-平滑肌肌动蛋白时使用抗α-SMA单克隆抗体(DAKO)；在检测β-III微管蛋白时使用抗β-III微管蛋白单克隆抗体(Chemicon)。第二抗体使用抗家兔IgG 多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology)和抗小鼠IgG多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)。
此外，一方面，对于S+G1、 的实验区按照上述的步骤进行分化诱导，另一方面制作成阴性对照。阴性对照对于S+G1、 的实验区，并不进行形成胚状体等一系列的分化诱导操作而是用LIF存在下的通常的维持培养体系(S+G1)进行培养，同样地进行免疫染色。
有关4个实验区示出了：在进行分化诱导操作的实验区和未进行分化诱导操作的阴性对照的实验区之间，比较作为分化标记的AFP、α-SMA、β-III微管蛋白的表达的结果(图8～图11)。另外，图8表示S+G1的实验区的结果，图9表示 的实验区的结果，图10表示的实验区的结果，图11表示的实验区的结果。
其结果，在所有的实验区中，进行分化诱导操作的实验区全部确认到AFP、α-SMA、β-III微管蛋白3个信号(图8下段、图9下段、图10下段、图11下段)。另一方面，用通常的维持培养体系培养的阴性对照的实验区并未确认到AFP、α-SMA、β-III微管蛋白3个信号，细胞分化的诱导并未发生(图8上段、图9上段、图10上段、图11上段)。
该结果意味着通过一系列的分化诱导操作起初可诱导细胞的分化，EB 3细胞成为表达AFP、αSMA、β-III微管蛋白等标记的3胚层系的分化细胞。由实施例4的结果和本实施例的结果可得到如下启示：用Lm5维持的ES细胞在维持未分化状态的同时，还可维持通过诱导而分化成多种细胞的分化多能性。
实施例6 与KSR不同的其他组成的血清替代品的调制
调制出与上述的KSR不同的其他组成的血清替代品。本实施例的血清替代品的组成如表3所示。
表3 成分已知的血清替代品的组成
甘氨酸(Nacalai) 150mg/l
组氨酸(Nacalai) 940mg/l
异亮氨酸(Nacalai) 3400mg/l
蛋氨酸(Nacalai) 90mg/l
苯丙氨酸(Nacalai) 1800mg/l
脯氨酸(Nacalai) 4000mg/l
羟基脯氨酸(Nacalai) 100mg/l
丝氨酸(Nacalai) 800mg/l
苏氨酸(Nacalai) 2200mg/l
色氨酸(Nacalai) 440mg/l
酪氨酸(SIGMA) 77mg/l
缬氨酸(Nacalai) 2400mg/l
硫胺素(Nacalai) 33mg/l
抗坏血酸(SIGMA) 330mg/l
还原型谷胱甘肽(SIGMA) 10mg/l
人转铁蛋白(Nacalai) 55mg/l
牛胰岛素(SIGMA) 100mg/l
亚硒酸钠(SIGMA) 0.07mg/l
BSA(Invitrogen) 83000mg/l
AgNO3(Mediatech Inc.) 0.0017mg/l
AlCl3·6H2O(Mediatech Inc.) 0.012mg/l
Ba(C2H3O2)2(Mediatech Inc.) 0.0255mg/l
CdCl2(Mediatech Inc.) 0.0228mg/l
CoCl2·6H2O(Mediatech Inc.) 0.0238mg/l
Cr2Cl3(Mediatech Inc.) 0.0032mg/l
GeO2(Mediatech Inc.) 0.0053mg/l
KBr(Mediatech Inc.) 0.0012mg/l
KI(Mediatech Inc.) 0.0017mg/l
MnSO4·H2O(Mediatech Inc.) 0.0017mg/l
NaF(Mediatech Inc.) 0.042mg/l
Na2SiO3·9H2O(Mediatech Inc.) 1.4mg/l
NH4VO3(Mediatech Inc.) 0.0065mg/l
(NH4)6Mo7O24·4H2O(Mediatech Inc.) 0.0124mg/l
NiSO4·6H2O(Mediatech Inc.) 0.0013mg/l
RbCl(Mediatech Inc.) 0.0121mg/l
SnCl2(Mediatech Inc.) 0.0012mg/l
ZrOCl2·8H2O(Mediatech Inc.) 0.0322mg/l
在蒸馏水中溶解表3所述的各种氨基酸(甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)使其成为3倍浓度，调制成3倍浓缩氨基酸溶液。在该3倍浓缩氨基酸溶液中加入构成3倍浓度所需用量的硫胺素、抗坏血酸、还原型谷胱甘肽。以该溶液为溶液A。接着，在蒸馏水中溶解人转铁蛋白和BSA使其成为2倍浓度，调制成2倍浓缩BSA溶液。以该溶液为溶液B。进而在蒸馏水中溶解所需用量的亚硒酸钠，调制成7％亚硒酸钠溶液。以该溶液为溶液C。在所调制的溶液A、B、C中添加牛胰岛素溶液(SIGMA)和微量金属元素，调制成本实施例的血清替代品。另外这里所添加的微量金属元素为组成已知的市售的Trace ElementB和C(MediatechInc.)。本实施例中调制出的血清替代品并非市售品，只是组成已知。
实施例7 使用添加有实施例6的血清替代品的培养基的研究
本实施例中，在GMEM中添加实施例6中所调制出的血清替代品作为与KSR同样的血清代替物，将其作为维持培养基用于小鼠ES细胞的培养。以下以这样调制出的培养基为培养基Y。然后，使用培养基Y，按照实施例3进行了增殖检测。进而按照实施例4进行了未分化标记的检测。进而按照实施例5进行了分化成3胚层系的分化能力的研究。
(1)增殖检测
使用了培养基Y的增殖检测的结果如图12所示。使用培养基Y作为维持培养基，除此以外，完全与实施例3同样地进行了实验。由使用了小鼠ES细胞株EB3的增殖检测的结果可知，以rLm5包被后用培养基Y进行培养的实验区(Y+Lm5-4、Y+Lm5-2)显示出对小鼠ES细胞的增殖效果。此外，与使用其他胞外基质(G1、Lm-Mix、Mg)的实验区相比，使用Lm5的情况可确认到更好的增殖。
(2)未分化标记的检测
进行上述的增殖检测后，通过RT-PCR对各实验区的未分化标记的表达进行了研究。使用培养基Y作为维持培养基，除此以外，完全与实施例4同样地进行了实验。与实施例4同样地检测7种未分化标记的结果如图13所示。即使在使用培养基Y培养小鼠ES细胞的情况下，以rLm5包被的实验区(Y+Lm5)也确认到所有的未分化标记的表达。由此得出如下启示：即使使用培养基Y对rLm5的体系传代培养10次以上，EB3细胞也能够维持未分化性。
(3)分化成3胚层系的分化能力的研究
此外，使用培养基Y作为维持培养基，除此以外，通过与实施例5完全相同的方法进行了分化诱导试验。进行了分化诱导 操作的所有的实验区，均形成了与对照区(S+G1)形态酷似的胚状体。其结果如图14所示。
检测在进行分化诱导后分化成3胚层系的标记(AFP、α-SMA、β-III微管蛋白)。有关S+G1(图15)、 (图16)、 (图17)、 (图18)、 (图19)、 (图20)、 (图21)的实验区，显示出在进行分化诱导操作的实验区(下段，LIF-)与未进行分化诱导操作的阴性对照的实验区(上段，LIF+)之间检测分化标记表达的结果。
由图15～图21的下段(LIF-)可见，有关在分化诱导后进行免疫染色的体系，所有的实验区中AFP、α-SMA、β-III微管蛋白3个标记均完全表达。另一方面，由图15～图21的上段(LIF+)可见，未进行分化诱导的用通常的维持培养体系培养的阴性对照的实验区，未出现AFP、α-SMA、β-III微管蛋白的表达，细胞的分化的诱导并未发生。
由以上得出如下启示：在使用培养基Y时rLm5也能够维持小鼠ES细胞的增殖，同时所增殖的小鼠ES细胞保持未分化性。由此可见，rLm5在不存在饲养细胞和血清的条件下能够成为小鼠ES细胞的有用的支持材料。
实施例8 使用了人iPS细胞的粘附实验
本实施例中示出了在使用各种细胞支持材料时使用了人iPS细胞的粘附实验的结果。
人iPS细胞使用在京都大学再生医科学研究所再生诱导研究领域所建立的细胞株201B2或201B7。图22中，左侧表示细胞株201B2的形态，右侧表示细胞株201B7的形态。
在将人iPS细胞从培养盘剥离之前在10μM Y-27632(WAKO)存在下培养1小时，然后将人iPS细胞用于实验。另 外，在实施例8以后的人iPS细胞的实验中也进行同样的处理。
在人iPS细胞的维持中，用在DMEM/F12中添加有20％KSR、2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、及10-4M 2-巯基乙醇的培养基调制出小鼠胚胎性成纤维细胞的培养上清，在该培养上清中添加4ng/ml bFGF(WAKO)后用作维持培养基(MEF-CM)。
细胞支持材料使用用丝裂霉素C处理后的SNL饲养细胞(Fd)或各种胞外基质(G1、Lm5、Mg、Vn、Co、Fn、Lm2、Lm-Mix)。然后按下述所示制作用各种细胞支持材料进行处理后的培养板，对于各细胞支持材料使用人iPS细胞株201B7进行了粘附实验。
用调整浓度后的各种胞外基质蛋白处理96孔培养板(Corning)，用1.2％BSA(SIGMA)溶液在37℃下封闭处理1小时。将各种胞外基质蛋白的浓度调制成以下浓度。即，将G1调制成5mg/ml及1.25mg/ml。将Lm2调制成50μg/ml及12.5μg/ml。将Lm-Mix调制成50μg/ml及12.5μg/ml。将Mg调制成500μg/ml及125μg/ml。将Co调制成50μg/ml及12.5μg/ml。将Fn调制成50μg/ml及12.5μg/ml。将Vn调制成50μg/ml及12.5μg/ml。将rLm5调制成50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml及3.125μg/ml的5等级的2倍稀释系列。此外，还调制了用25μg/ml的Lm5和50μg/ml的Co同时处理后的实验区(Lm5+Co)。
用胰蛋白酶处理人iPS细胞，使其分散直到成为单个细胞，以20000个/孔接种到培养板上，在37℃、5％CO2、95％空气的气相条件下培养60分钟。培养后，通过轻微敲打(tapping)使粘附弱的细胞从培养板表面浮起，用percoll(GE healthcare)处理除去该细胞。将粘附后的细胞用25％戊二醛(Nacalai)固定化，用2.5％结晶紫(Nacalai)染色后比较相对细胞数。
图23示出通过在培养60分钟后测定OD595来评价各种胞外 基质蛋白给人iPS细胞的粘附所带来的影响的结果。此外，图24示出各实验区中的进行检测后的细胞的形态。
由图23中可知，rLm5的实验区与其他胞外基质蛋白的实验区相比，表现出较高的OD595的值，表现出对人iPS细胞的较强的粘附活性。图24中，也在rLm5的实验区观察到大多细胞发生粘附。此外，还可知，rLm5通过与Co组合(rLm5+Co)，表现出比rLm5单独时更强的粘附活性。
实施例9 使用了人iPS细胞的集落检测
本实施例中示出使用人iPS细胞株201B2时使用各种细胞支持材料进行集落检测的结果。
作为细胞支持材料，使用G1、Lm5、Mg、Vn、Co、Fn、Lm2及Lm-Mix。而且如下述那样制作用各种细胞支持材料进行处理后的60mm培养盘(IWAKI)，对各细胞支持材料进行了集落检测。
将各种胞外基质蛋白的浓度调制成以下浓度。即，将G1调制成1mg/ml。将Lm5调制成30μg/ml、15μg/ml、8μg/ml、4μg/ml及2μg/ml。将Lm2调制成30μg/ml、15μg/ml、8μg/ml、4μg/ml及2μg/ml。将Lm-Mix调制成30μg/ml、15μg/ml、8μg/ml、4μg/ml及2μg/ml。将Mg调制成300μg/ml。将Co调制成30μg/ml。将Fn调制成30μg/ml。将Vn调制成10μg/ml。
本实施例中，将人iPS细胞，通过胰蛋白酶处理将集落调制成分散为单个细胞的状态(以下，称作“单个”)、和通过轻微吹打(pipetting)抑制分散而调制成细胞块的状态(以下，称作“团块”)，用两者进行了检测。即，使人iPS细胞在“单个”或“团块”下以相当于1000个/60mm盘接种到培养盘中。在37℃、5％CO2、95％空气的气相条件下，“单个”培养13天，“团块”培养6天。培养后，计算所形成的集落数。
其结果如图25所示。图25中上段表示“单个”的结果，下段表示“团块”的结果。
“单个”时，在rLm5、Lm-Mix、Vn、Mg的实验区可确认到集落形成，在8μg/ml Lm5及30μg/ml Lm-Mix的实验区形成与阳性对照即SNL饲养细胞(Fd)存在的实验区接近的集落数。另一方面，“团块”时，在rLm5、Lm2、Lm-Mix、Vn、Mg、Co的实验区确认到集落形成，在rLm5的实验区确认到与Fd相比同等以上的集落形成。
此外，通过对所形成的集落进行免疫染色而检测人多能性干细胞标记，从而评价了所培养的人iPS细胞是否为未分化状态。作为此处的人多能性干细胞的标记，使用了细胞表面抗原标记即SSEA3。
用4％甲醛将细胞固定化后，用添加有1％BSA的PBS进行封闭，从而实施了免疫染色。封闭后，用第一抗体和第二抗体进行处理，进而用Hoechist33342(Invitrogen)进行染色，通过荧光显微镜进行观察，检测标记的表达。免疫染色中，第一抗体使用抗SSEA3单克隆抗体，第二抗体使用抗大鼠IgM抗体(Jackson Immuno Research)。
免疫染色的结果如图26所示。图26A为“单个”的结果，图26B为“团块”的结果。在由“单个”所形成的集落中和由“团块”所形成的集落中均检测出ES细胞标记即SSEA3。由此得出如下启示：由人iPS细胞所形成的集落维持了未分化性。
由以上结果得出以下启示：rLm5维持了与其他胞外基质相比同等或其以上的人iPS细胞的集落形成，同时所形成的集落保持了未分化性。
实施例10 使用了人iPS细胞的维持培养试验
本实施例中示出了在使用各种细胞支持材料时使用了人 iPS细胞株201B7的维持培养试验的结果。
作为细胞支持材料，使用了G1、Lm5、Lm2、Vn、Co及Fn。而且按下述那样制作用各种细胞支持材料进行处理后的6孔板(Falcon)，对各细胞支持材料进行了集落检测。作为维持培养基，使用实施例8所述的MEF-CM。
将各种胞外基质蛋白的浓度调制成G1 1mg/ml、Lm5 2μg/ml、Lm2 30μg/ml、Co 30μg/ml、Fn 30μg/ml、Vn 10μg/ml。
本实施例中仅对人iPS细胞的“团块”的状态进行了检测。细胞以1周1次用各种胞外基质处理全部细胞的九分之一，重播种到新准备的6孔板中。细胞在37℃、5％CO2、95％空气的气相条件下培养5周。培养5周后的细胞的形态如图27所示。
其结果为，在所研究的各种胞外基质蛋白的实验区中，在传代后培养1周时观察到与阳性对照即SNL饲养细胞(Fd)的实验区同等程度的细胞增殖。如图27所示，在培养5周后也观察到该倾向。由该结果可知，rLm5能够维持与Fd大致同等的人iPS细胞的增殖。另外，Lm2在培养中并未确认到集落形成。
实施例11 人iPS细胞的未分化标记的检测
本实施例中，对已知的人多能性干细胞的未分化标记NANOG、OCT4、SOX2的基因通过RT-PCR检测上述未分化标记，从而对rLm5对于人iPS细胞是否具有维持未分化性的效果进行了研究。
使用TRIZOL(Invitrogen)从实施例10中传代培养5周后的人iPS细胞提取总RNA。提取后，使用Thermo Script RT-PCR System(Invitrogen)通过逆转录反应合成了cDNA。以所合成的cDNA为模板使用表4所示的引物进行了PCR反应。各基因的变性反应在94℃下进行10秒，退火反应进行15秒，伸长反应在72℃进行30秒。有关退火反应，OCT4和GAPDH在60℃的温度下 进行，NANOG和SOX2在55℃的温度下进行。
表4 RT-PCR引物
OCT4
5’-GACAGGGGGAGGGGAGGAGCTAGG-3’(序列号23)
5’-CTTCCCTCCAACCAGTTGCCCCAAAC-3’(序列号24)
NANOG
5’-CAGCCCTGATTCTTCCACCAGTCCC-3’(序列号25)
5’-TGGAAGGTTCCCAGTCGGGTTCACC-3’(序列号26)
SOX2
5’-GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG-3’(序列号27)
5’-TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG-3’(序列号28)
GAPDH
5’-GTGGACCTGACCTGCCGTCT-3’(序列号29)
5’-GGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’(序列号30)
RT-PCR的结果如图28所示。在所有的实验区确认到所研究的3个因子的表达。由此得到启示：使用rLm5作为细胞支持材料培养人iPS细胞时，人iPS细胞维持了未分化性。
实施例12 人iPS细胞的分化诱导试验
本实施例中示出对使用各种细胞支持材料培养人iPS细胞时的分化能力的维持进行研究的结果。通过RT-PCR从诱导分化后的人iPS细胞检测分化标记，从而对使用各种细胞支持材料所培养的人iPS细胞是否能够维持分化能力进行了研究。
在实施例10中培养3周后、即第3次传代时收集一部分细胞，使用其进行了分化诱导试验。分化诱导按以下步骤进行。
在DMEM/F12中添加20％KSR、2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸及10-4M 2-巯基乙醇调制成培养基，将培养中的人iPS细胞从培养板剥离而制作“团块”，使用低吸附培养板(NUNC)在 该培养基中对上述团块”悬浮培养8天。将由此所形成的胚状体重新播种到以1mg/ml的G1包被的6孔板(Falcon)中，进一步粘附培养8天。
粘附培养后的细胞的形态如图29所示。在不存在bFGF的培养基中进行分化诱导后的细胞中混杂有各种形态的细胞，这意味着细胞发生了分化。这里的细胞形态与图27那样的在bFGF存在下进行通常的维持培养时是明显不同的。
从进行分化诱导操作后的人iPS细胞，按照与实施例11相同的步骤，进行RNA提取和cDNA合成，以所合成的cDNA为模板，使用表5所示的引物进行PCR反应。作为内胚层标记，使用SOX17和AFP；作为中胚层标记，使用BRACHYURY和MSX1；作为外胚层标记，使用PAX6；作为滋养外胚层(trophectodermal)标记，使用CDX2。各基因的变性反应在94℃下进行10秒，退火反应进行10秒，伸长反应在72℃下进行30秒。有关退火反应，SOX17、BRACHYURY、MSX1、PAX6在63℃的温度下进行，AFP在65℃的温度下进行，CDX2在55℃的温度下进行。此外，仅CDX2的伸长反应在72℃下进行15秒。
RT-PCR的结果如图30所示。在rLm5的实验区确认到与阳性对照即Fd的实验区同样地表达了所研究的全部6个因子。由此得到以下启示：rLm5对人iPS细胞具有维持分化多能性的效果。另一方面可知，在rLm5以外的几个胞外基质(Vn、Co等)的实验区，中胚层标记即MSX1的表达非常弱。由此可知，这些胞外基质的情况下，可能会部分丧失人iPS细胞的分化能力、或对分化产生抵抗性。
表5 RT-PCR引物
SOX17
5’-CGCTTTCATGGTGTGGGCTAAGGACG-3’(序列号31)
5’-TAGTTGGGGTGGTCCTGCATGTGCTG-3’(序列号32)
AFP
5’-GAATGCTGCAAACTGACCACGCTGGAAC-3’(序列号33)
5’-TGGCATTCAAGAGGGTTTTCAGTCTGGA-3’(序列号34)
BRACHYURY
5’-GCCCTCTCCCTCCCCTCCACGCACAG-3’(序列号35)
5’-CGGCGCCGTTGCTCACAGACCACAGG-3’(序列号36)
MSX1
5’-CGAGAGGACCCCGTGGATGCAGAG-3’(序列号37)
5’-GGCGGCCATCTTCAGCTTCTCCAG-3’(序列号38)
PAX6
5’-ACCCATTATCCAGATGTGTTTGCCCGAG-3’(序列号39)
5’-ATGGTGAAGCTGGGCATAGGCGGCAG-3’(序列号40)
CDX2
5’-GCAGAGCAAAGGAGAGGAAA-3’(序列号41)
5’-CAGGGACAGAGCCAGACACT-3’(序列号42)
本发明通过在含有胞外基质分子中的层粘连蛋白-5的体系中进行培养，即使不使用支持细胞和血清，也能够使多能性干细胞以未分化状态进行增殖。根据本发明的方法，不使用支持细胞、血清等动物来源的材料也能够培养多能性干细胞，因此不存在免疫排斥、病毒感染等的危险性。人来源的多能性干细胞根据其分化全能性具有作为再生医疗的细胞材料的较大的利用可能性，尤其人诱导多能性干细胞(iPS细胞)不存在伦理性的问题，并且由于能够从患者本人的细胞来进行调制因而不存 在免疫排斥的问题。
[序列表自由文本]
<序列号1>
序列号1表示人层粘连蛋白α3链的碱基序列。
<序列号2>
序列号2表示人层粘连蛋白α3链的氨基酸序列。
<序列号3>
序列号3表示人层粘连蛋白β3链的碱基序列。
<序列号4>
序列号4表示人层粘连蛋白β3链的氨基酸序列。
<序列号5>
序列号5表示人层粘连蛋白γ2链的碱基序列。
<序列号6>
序列号6表示人层粘连蛋白γ2链的氨基酸序列。
<序列号7-22>
序列号7-22表示用于检测ES细胞的未分化性标记的、RT-PCR用引物的碱基序列。
<序列号23-30>
序列号23-30表示用于检测人iPS细胞的未分化性标记的、RT-PCR用引物的碱基序列。
<序列号31-42>
序列号31-42表示用于检测人iPS细胞的分化标记的、RT-PCR用引物的碱基序列。
[序列表] 。

Claims (9)

1.一种增殖多能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的培养基中、且在由人层粘连蛋白-5或由人层粘连蛋白-5和胶原蛋白处理过的培养容器中培养该多能性干细胞的工序，所述多能性干细胞为诱导多能性干细胞，所述人层粘连蛋白-5的浓度为0.5～15μg/ml。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述诱导多能性干细胞为人的诱导多能性干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在培养基中含有血清替代品。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述血清替代品含有：选自由甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸组成的组中的1种或多种氨基酸；由硫胺素和/或抗坏血酸组成的维生素；选自由银、铝、钡、镉、钴、铬、锗、锰、硅、钒、钼、镍、铷、锡和锆组成的组中的1种或多种微量金属元素；选自由溴、碘和氟组成的组中的1种或多种卤素；以及选自由白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素和亚硒酸钠组成的组中的1种或多种成分。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述多能性干细胞在培养中不发生分化。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述多能性干细胞在培养中不发生分化。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，所述多能性干细胞在培养中不发生分化。
8.人层粘连蛋白-5作为细胞支持材料用于根据权利要求1所述的方法的用途，所述培养容器用浓度为0.5～15μg/ml的人层粘连蛋白-5处理。
9.用于根据权利要求1所述的方法的试剂盒，其包含用人层粘连蛋白-5处理过的培养容器和血清替代品，所述培养容器用浓度为0.5～15μg/ml的人层粘连蛋白-5处理。
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