WO2018021543A1 - 幹細胞の製造に用いられるフィブロネクチンフラグメント - Google Patents

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seq
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智美 尾辻
敏和 西江
梨沙 加藤
幸子 岡本
榎　竜嗣
峰野　純一
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タカラバイオ株式会社
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    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing stem cells having the ability to differentiate into various cells.
  • Stem cells are defined as cells that have the ability to divide and produce the same cells as themselves (self-renewal ability) and the ability to differentiate into different types of cells and can proliferate indefinitely. Differentiated cells can be supplied by continuing at least one of the two daughter cells generated from the stem cells to be the same stem cell.
  • mouse-derived feeder cells extracellular matrix (Extracellular Matrix) such as laminin and fibronectin, and the like can be used as a substrate for culturing stem cells.
  • Extracellular matrix Extracellular Matrix
  • laminin and fibronectin and the like can be used as a substrate for culturing stem cells.
  • Non-patent document 1 is an example of research on a method for producing stem cells using fibronectin or fibronectin fragments.
  • Non-Patent Document 1 discloses that human embryonic stem cells (ES cells) are cultured on a 120 kDa fibronectin fragment (hereinafter referred to as 120 k-fr), thereby maintaining human pluripotency.
  • ES cells human embryonic stem cells
  • 120 k-fr 120 kDa fibronectin fragment
  • a method for growing ES cells is disclosed.
  • the growth rate of cells on 120 k-fr was slow compared to the growth rate on full-length fibronectin.
  • full-length fibronectin and commercially available 120 k-fr are derived from natural fibronectin, viruses possessed by the organism of origin There is a high risk of being brought in.
  • the present invention is intended to solve the problems of conventional methods for producing stem cells, and an object thereof is to provide a method for producing a large amount of stem cells in a short period of time using a fibronectin fragment.
  • stem cells can be efficiently proliferated by culturing stem cells in the presence of a novel recombinant fibronectin fragment, and the present invention has been completed. I let you.
  • the present invention [1] Stem cells (A) a recombinant polypeptide containing a repeat selected from the group consisting of human fibronectin III-1-7, or one or several amino acids in the amino acid sequence of a repeat selected from the group consisting of III-1-7 above A recombinant polypeptide comprising an amino acid sequence in which the amino acids are substituted, deleted, inserted or added, (B) A recombinant polypeptide comprising III-8 to 10 repeats of human fibronectin, or an amino acid wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of III-8 to 10 repeats described above A recombinant polypeptide comprising a sequence, and (c) a recombinant polypeptide comprising a III-12-14 repeat of human fibronectin, or one or several amino acids in the amino acid sequence of said III-12-14 repeat, A recombinant polypeptide comprising a deleted, inserted or added amino acid sequence, A method for producing stem cells (
  • the recombinant polypeptide of (a) is a recombinant polypeptide containing III-1 to 3 repeats or III-4 to 6 repeats of human fibronectin, or the aforementioned III-1 to 3 repeats or III-4 to The production method according to [1] or [2], which is a recombinant polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in an amino acid sequence of 6 repeats, [4]
  • the recombinant polypeptide is a recombinant polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20, or one or several amino acids are substituted in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20.
  • the production method according to [6] The production method according to [5], wherein the solid phase is a cell culture equipment or a cell culture support, [7] The production method according to [5], wherein the solid phase is a dish, plate, flask, bag, bead, membrane or slide glass, [8] The production method according to any one of [1] to [7], wherein the stem cells are human-derived pluripotent stem cells or neural stem cells.
  • the present invention provides a method for producing stem cells. According to the method of the present invention, it is possible to efficiently proliferate stem cells, maintain the undifferentiated state of stem cells, and efficiently induce stem cells. Since the method has a high cell proliferation rate and the stem cells obtained by the present invention have the ability to differentiate into desired cells, they are preferably used for regenerative medicine, for example. Therefore, the method of the present invention is expected to make a great contribution to the medical field.
  • the present invention also provides a novel recombinant fibronectin fragment.
  • FIG. It is a schematic diagram which shows the domain structure of fibronectin. It is a figure which shows cell proliferation in Example 5. FIG. It is a figure which shows cell proliferation in Example 6. FIG. It is a figure which shows cell proliferation in Example 7. FIG. It is a figure which shows cell proliferation in Example 8. FIG. It is a schematic diagram which shows the domain structure of a fibronectin fragment.
  • Fibronectin is a huge glycoprotein having a molecular weight of about 250 kDa (monomer) existing in blood, cell surface, extracellular matrix and the like, and is known to have various functions such as cell adhesion.
  • Fibronectin is composed of a domain structure (see FIG. 1 below), and the amino acid sequence includes three similar sequences. Three types of similar sequences are called type I repeat, type II repeat, and type III repeat, respectively. Of these, type III repeat is composed of 87 to 96 amino acid residues, Amino acid sequence homology is 17-40%. There are 15 type III repeats in fibronectin, of which the first, second and third (hereinafter referred to as III-1, III-2 and III-3, respectively) are self-association domains.
  • III-4, III-5 and III-6 are the 8th, 9th and 10th (hereinafter referred to as III-8 and III-9, respectively) DNA binding domains.
  • III-10) is contained in the cell binding domain
  • the 12th, 13th and 14th (hereinafter referred to as III-12, III-13 and III-14, respectively) are contained in the heparin binding domain.
  • III-10 contains a region having binding activity to integrin ⁇ 5 ⁇ 1 (also referred to as VLA-5), and this core sequence is RGD.
  • a region called IIICS exists at a site near the C-terminal side of fibronectin.
  • IIICS includes a sequence consisting of 25 amino acids called CS-1, and this sequence exhibits binding activity to integrin ⁇ 4 ⁇ 1 (also referred to as VLA-4).
  • amino acid sequences of human fibronectin III-1 to 14 and CS-1 are shown in the sequence listing of the present specification as SEQ ID NOS: 1 to 14 and 15, respectively.
  • the stem cell production method of the present invention includes a step of culturing a stem cell in the presence of a polypeptide that is a recombinant fibronectin fragment.
  • the stem cell used in the present invention is not limited as long as it has the ability to divide and produce the same cell as itself (self-replicating ability) and the ability to differentiate into another type of cell.
  • Stem cells are classified as follows according to the difference in differentiation ability, but any stem cells may be used in the present invention.
  • Totipotent stem cells Stem cells that can differentiate into all cell types that form one individual, including ex vivo tissues such as placenta. Fertilized eggs (and up to 4-8 splits) are illustrated.
  • Pluripotent stem cell A stem cell that does not form an individual but can differentiate into all cell lines belonging to the three germ layers (endoderm, mesoderm, ectoderm). Although not particularly limited, for example, internal cell folds at the blastocyst stage, embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic tumor cells (EC cells), embryos Sexual reproductive stem cells (EG cells), nuclear transfer ES cells (ntES cells) and the like can be mentioned.
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • EC cells embryonic tumor cells
  • EG cells embryos Sexual reproductive stem cells
  • ntES cells nuclear transfer ES cells
  • Multipotent stem cell refers to a stem cell that is capable of differentiating into various cell types, although the cell line that can be differentiated is limited. Although not particularly limited, for example, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, hepatic stem cells, pancreatic stem cells, skin stem cells and the like can be mentioned. In general, differentiation beyond the germ layer is not possible, but there are exceptions.
  • Oligopotent stem cell A stem cell that can be differentiated only into several cell types. Although it does not specifically limit, For example, a neural stem cell etc. are mentioned.
  • Unipotent stem cell refers to a stem cell that is limited to one type of cell type that can be differentiated. It can divide and proliferate as a stem cell, or can differentiate and change to another cell type other than the stem cell. Although not particularly limited, for example, muscle stem cells, germ stem cells (egg cells, spermatogonia) and the like can be mentioned. Unipotent stem cells are sometimes called progenitor cells.
  • the origin of the stem cells used in the present invention is not particularly limited, and stem cells derived from any organism, preferably a mammal, can be used.
  • the age and sex of the organism are not particularly limited.
  • cells from primates eg, chimpanzees, Japanese monkeys, humans
  • Most preferably, human-derived cells are used, but the invention is not so limited.
  • the stem cell is preferably a pluripotent stem cell, more preferably an iPS cell, and still more preferably a human iPS cell.
  • iPS cells a pluripotent stem cell
  • iPS cell line 253G1 strain
  • stem cells are produced by the method of the present invention for the purpose of administration to humans
  • cells collected from a donor preferably having the same or similar type of histocompatibility antigen as that of the recipient are used for the production of stem cells.
  • cells collected from the recipient themselves are used for the production of stem cells.
  • the method for producing stem cells of the present invention is a method for producing stem cells, comprising a culture step in the presence of a polypeptide described below (hereinafter sometimes referred to as the culture step of the present invention).
  • the stem cells are cultured in the presence of the polypeptide (a), the polypeptide (b), and the polypeptide (c).
  • the method of the present invention can be carried out in the presence of polypeptide (a), polypeptide (b), and polypeptide (c).
  • polypeptide (a) and (b) in the same molecule and a polypeptide (c)
  • a poly ((b)) and (c) are contained in the same molecule.
  • a peptide and a polypeptide In the presence of a mixture of two types of polypeptides, a peptide and a polypeptide (a), a polypeptide containing (a) and (b) in the same molecule and a poly (polypeptide) containing (b) and (c) in the same molecule Culturing stem cells in the presence of a mixture of two polypeptides of the peptide or in the presence of a single polypeptide comprising (a), (b), and (c) in the same molecule Also good.
  • one kind of polypeptide containing (a), (b), and (c) in the same molecule is different from full-length fibronectin.
  • Polypeptide (a) is a recombinant polypeptide comprising a repeat selected from the group consisting of human fibronectin III-1-7, or an amino acid sequence of a repeat selected from the group consisting of III-1-7 above
  • the “repeat selected from the group consisting of human fibronectin III-1-7” may be at least one repeat, preferably three repeats, and all seven repeats. There may be.
  • the polypeptide (a) is particularly preferably a polypeptide comprising III-1, III-2 and III-3 repeats, or a polypeptide comprising III-4, III-5 and III-6 repeats, or A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of III-1 to 3 repeats or III-4 to 6 repeats.
  • Polypeptide (b) is a recombinant polypeptide containing III-8-10 repeat of human fibronectin, or one or several amino acids in the amino acid sequence of III-8-10 repeat as described above.
  • Polypeptide (c) is a recombinant polypeptide containing III-12-14 repeat of human fibronectin, or a substitution, deletion, insertion or substitution of one or several amino acids in the amino acid sequence of said III-12-14 repeat.
  • a 120 kDa fibronectin fragment (120 k-fr) is exemplified.
  • 120k-fr represents III-1, III-2, III-3, III-4, III-5, III-6, III-7, III-8, III-9, III-10 in this order from the N-terminal side. It is a protein with a molecular weight of about 120 kDa.
  • the predicted amino acid sequence of 120 k-fr (932 amino acid residues) is shown as SEQ ID NO: 16 in the sequence listing herein.
  • 120 k-fr By preparing DNA encoding the 120 k-fr amino acid sequence and combining it with an appropriate host-vector system, 120 k-fr can be produced as a recombinant polypeptide. Commercially available 120k-fr may also be used.
  • polypeptides containing (b) and (c) in the same molecule include CH-271 and CH-296.
  • CH-271 is a recombinant protein having a molecular weight of about 60 kDa (549 amino acid residues) including III-8, III-9, III-10, III-12, III-13, and III-14 in this order from the N-terminal side. is there.
  • the amino acid sequence of CH-271 is shown in the sequence listing of the present specification as SEQ ID NO: 17.
  • CH-296 has a molecular weight of about 63 kDa (574 amino acid residues) including III-8, III-9, III-10, III-12, III-13, III-14, and CS-1 in this order from the N-terminal side. It is a recombinant protein.
  • the amino acid sequence of CH-296 is shown in the sequence listing of the present specification as SEQ ID NO: 18.
  • CH-296 is commercially available as RetroNectin (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.).
  • the stem cell production method of the present invention can be carried out by using the above-mentioned 120 k-fr in combination with CH-271 or CH-296.
  • Polypeptides having (a), (b) and (c) in the same molecule can also be used in the method for producing stem cells of the present invention.
  • the present invention is not particularly limited, the following FCH-296 and DCH-296 are exemplified as polypeptides containing (a), (b) and (c) in the same molecule.
  • FCH-296 comprises III-1, III-2, III-3, III-8, III-9, III-10, III-12, III-13, III-14, CS-1 in this order from the N-terminal side.
  • the amino acid sequence of FCH-296 is shown in the sequence listing of this specification as SEQ ID NO: 19.
  • amino acid numbers 1 to 298 correspond to (a)
  • amino acid numbers 299 to 307 correspond to GS linker
  • amino acid numbers 308 to 585 correspond to (b)
  • amino acid numbers 586 to 856 This corresponds to (c)
  • amino acid numbers 857 to 881 correspond to CS-1.
  • Amino acid numbers 94 to 111 of SEQ ID NO: 19 are regions other than type III repeats existing between III-1 and III-2.
  • FCH-296 is a novel polypeptide produced for the first time in the present invention.
  • DCH-296 comprises III-4, III-5, III-6, III-8, III-9, III-10, III-12, III-13, III-14 and CS-1 in this order from the N-terminal side.
  • the amino acid sequence of DCH-296 is shown in the sequence listing of this specification as SEQ ID NO: 20.
  • amino acid numbers 1 to 268 correspond to (a)
  • amino acid numbers 269 to 277 correspond to GS linker
  • amino acid numbers 278 to 555 correspond to (b)
  • amino acid numbers 556 to 826 This corresponds to (c)
  • amino acid numbers 827 to 851 correspond to CS-1.
  • DCH-296 is a novel polypeptide produced for the first time in the present invention.
  • Polypeptides (a) to (c) used in the present invention are functionally equivalent or retain the function of proliferating stem cells, maintaining the undifferentiated state of stem cells, or inducing stem cells.
  • one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in a repeat, III-8-10 repeat, or III-12-14 repeat amino acid sequence selected from the group consisting of III-1-7
  • the amino acid sequence thus prepared may be included.
  • “one or several” is not particularly limited, but is in the range of 1 to 15, preferably in the range of 1 to 10, more preferably in the range of 1 to 5, particularly preferably 1. It is in the range of ⁇ 3.
  • III-1 an amino acid sequence in which the N-terminal 9 amino acids of III-1 are deleted (SEQ ID NO: 23)
  • the N-terminal 5 amino acids of III-1 is Polypeptides containing a deleted amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) or an amino acid sequence in which the N-terminal 3 amino acids of III-1 have been deleted (SEQ ID NO: 25) are also included in the polypeptide.
  • a polypeptide comprising (a) to (c) one or several amino acids are substituted or deleted in the amino acid sequence of FCH-296 (SEQ ID NO: 19) or the amino acid sequence of DCH-296 (SEQ ID NO: 20).
  • polypeptide comprising an inserted or added amino acid sequence, and more specifically, but not limited to, N-terminal 9 amino acid deletion FCH-296 (SEQ ID NO: 29), N-terminal 6 amino acid deletion FCH-296 (SEQ ID NO: 30), FCH-296 (SEQ ID NO: 31) lacking N-terminal 5 amino acids, FCH-296 (SEQ ID NO: 32) lacking N-terminal 3 amino acids, FCH-296 (SEQ ID NO: 32) containing N-terminal 3 amino acids No.
  • FCH-296 with an N-terminal 6 amino acid insertion (SEQ ID NO: 34), FCH-296 with an N-terminal 9 amino acid insertion (SEQ ID NO: 35), N-terminal 11 amino acid Inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 36), N-terminal 12 amino acid inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 37), N-terminal 14 amino acid inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 38), N-terminal 15 amino acid inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 39), FCH-296 (SEQ ID NO: 40) with N-terminal HKRHEEEGH insertion, FCH-296 (SEQ ID NO: 41) with N-terminal HKRH insertion, FCH-296 (SEQ ID NO: 42) with N-terminal HH insertion, N-terminal Examples include HCH-inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 43), FCH-296 (SEQ ID NO: 21) with His-tag at the N-terminus, and DCH-296
  • the polypeptides (a) to (c) used in the present invention are functionally equivalent, or have a function of proliferating stem cells, a function of maintaining an undifferentiated state of stem cells, or a function of inducing stem cells
  • the amino acid sequence may include an amino acid sequence having identity with a repeat selected from the group consisting of III-1 to 7, III-8 to 10 repeat, or III-12 to 14 repeat.
  • amino acid substitution refers to the physicochemical properties of the polypeptide within a range in which the function of the original polypeptide can be maintained.
  • the degree that can be changed is preferable.
  • amino acid substitution is preferably conservative within a range that does not substantially change the properties of the original polypeptide (eg, hydrophobicity, hydrophilicity, charge, pK, etc.).
  • amino acid substitutions are: 1. glycine, alanine; 2. valine, isoleucine, leucine; 3. Aspartic acid, glutamic acid, asparagine, glutamine; 4. serine, threonine; 5.
  • the amino acid substitution or the like may occur naturally due to species differences or individual differences, or may be artificially introduced. Artificial introduction may be performed by a known method, and is not particularly limited.
  • a nucleic acid in which base substitution, deletion, addition or insertion is introduced into a nucleic acid encoding the aforementioned polypeptide by a known method.
  • a polypeptide containing an amino acid sequence having one or several amino acid substitutions in the amino acid sequence of the polypeptide can be produced.
  • “functionally equivalent” or “equivalent function” means a function that is functionally equivalent or equivalent to a corresponding polypeptide into which no amino acid substitution or the like has been introduced, ie, is a comparison target.
  • stem cell production is performed using a polypeptide
  • the same cell proliferation rate as that obtained when the corresponding polypeptide into which amino acid substitution or the like has not been introduced is used can be obtained. It means that the differentiation state is maintained, or an equivalent stem cell induction rate is obtained. That is, the function of the polypeptide can be confirmed as appropriate by evaluating its properties in accordance with the method described in the Examples described later.
  • the polypeptide used in the present invention is present in peptides and amino acid residues other than the above-mentioned type III repeat and / or fibronectin other than the above-mentioned type III repeat, as long as the usefulness in culturing stem cells is not lost. It may include a region, such as CS-1.
  • an arbitrary peptide or amino acid residue can be introduced into a region other than the above type III repeat, and the polypeptide of the present invention in which an amino acid residue or peptide is inserted as a linker between the repeats, Examples of the polypeptide of the present invention to which a peptide (tag) useful for purification of a recombinant polypeptide is added.
  • linker examples include, but are not limited to, a glycine-serine linker (GS linker).
  • tags include polyhistidine-tag (His-tag), Flag-tag, and Glutathione S-Transferase tag (GST-tag), but are not limited thereto.
  • GST linker examples include polyhistidine-tag (His-tag), Flag-tag, and Glutathione S-Transferase tag (GST-tag), but are not limited thereto.
  • GST-tag Glutathione S-Transferase tag
  • an FCH-296 polypeptide having a His-tag at the N-terminus SEQ ID NO: 21
  • DCH-296 polypeptide having a His-tag at the N-terminus SEQ ID NO: 22
  • stem cells are cultured at a high cell growth rate while maintaining an undifferentiated state.
  • the method for producing stem cells of the present invention is clearly compared with the method using 120 k-fr, CH-271 or CH-296, which are known fibronectin fragments, respectively. It is very useful because it has a high cell growth rate and can maintain a high undifferentiated state. Furthermore, by using the above method for expansion of stem cells, there is a great advantage that a high cell proliferation rate and maintenance of an undifferentiated state can be realized without using feeder cells.
  • the polypeptide used in the present invention is produced by recombinant DNA technology.
  • the molecular weight of the polypeptide used in the present invention is preferably 100 kDa or less.
  • the polypeptide herein includes chemical modifications such as acetylation.
  • the stem cell culture is performed in a state where the solid phase coated with the polypeptide is in contact with the stem cell.
  • the solid phase include containers or carriers (such as microbeads) used for cell culture.
  • the solid phase coated with the polypeptide has the ability to stably hold stem cells and is useful for culturing the cells.
  • the culture vessel may be of any material and shape as long as it does not inhibit cell maintenance, survival, differentiation, maturation, or self-replication. Examples of the material for the culture vessel include synthetic resins, natural resins, and metals including glass and nonwoven fabric.
  • the shape of the culture vessel may be a polygonal column such as a triangular prism, a cube, a rectangular parallelepiped, a cylinder, a polygonal pyramid such as a triangular pyramid, a quadrangular pyramid, a cone, or an arbitrary shape such as a gourd, spherical, hemispherical, circular, elliptical , Semicircular etc.
  • Cell culture equipment used for stem cell culture is not particularly limited. For example, dishes, plates, flasks, bags, membranes, glass slides, large culture tanks, bioreactors, hollow fiber culture devices, etc. Can be used. Preferably, a plate is used, and more preferably, a texture culture treated plate is used.
  • the bag for example, can be used CO 2 gas-permeable cell culture bag.
  • a large culture tank can be used.
  • cultivation can be implemented by any of an open system and a closed system, it is preferable to culture
  • the solid phase coating that is, the immobilization of the polypeptide on the solid phase surface may be performed by a known method.
  • fibronectin described in WO 97/18318 and WO 00/09168. It can be performed by the same method as the immobilization of fragments.
  • stem cells can be obtained by the method of the present invention, and then the cells and the polypeptide of the present invention can be easily separated only by separating the cells from the solid phase. And contamination of the stem cells with a polypeptide or the like can be prevented.
  • a coating solution in which the polypeptide is dissolved in sterilized distilled water, buffer solution, physiological saline or the like can be prepared and used for immobilization.
  • a phosphate buffered saline (PBS) is used, and particularly preferably, a coating solution in which a polypeptide is Dulbecco's PBS (D-PBS) is used as a solvent.
  • D-PBS Dulbecco's PBS
  • the molar concentration of the polypeptide in the coating solution is not particularly limited, and examples thereof include 1 to 100,000 nM, preferably 10 to 2000 nM, and more preferably 30 to 1000 nM.
  • the molar concentration is 0.1 to 1000 ⁇ g / mL, preferably 1 to 200 ⁇ g / mL, more preferably 3 to 100 ⁇ g / mL when expressed in terms of weight concentration.
  • Coating can be carried out by adding the above coating solution to the culture vessel and holding it for an appropriate time.
  • Conditions for holding the coating solution may be set as appropriate, and examples include conditions such as 1 hour at room temperature or overnight at 4 ° C.
  • the container coated with the fibronectin fragment can be used as it is or stored at a low temperature, for example, 0 to 10 ° C. until use. Immediately before use, the coating solution is removed from these culture equipments, for example, washed twice with D-PBS, and then once with a cell culture medium as necessary, and then used for cell culture.
  • the method for producing stem cells of the present invention is performed by carrying out the step of culturing in the presence of the polypeptide for the entire period of culture in stem cell production or for any part of the period. That is, the present invention includes any culture cells that include the culture step as part of the stem cell production process.
  • the culture process of the present invention includes stem cell induction, stem cell maintenance, and stem cell expansion culture, or stem cell maintenance and stem cell expansion culture. Therefore, the present invention provides a method for producing a stem cell, which comprises inducing, maintaining and expanding the stem cell in the presence of the above-mentioned recombinant polypeptides (a), (b) and (c), and Provided is a method for producing a stem cell, comprising maintaining and expanding the stem cell in the presence of the recombinant polypeptides (a), (b) and (c).
  • a stem cell useful for regenerative medicine or the like can be produced by appropriately culturing the stem cell by appropriately adjusting the kind of cell to be used in the method, the culture conditions and the like.
  • a stem cell means the cell population containing a stem cell.
  • stem cell induction there are no particular limitations on the type of cells at the start of culture and the method for inducing stem cells in the culture process of the present invention.
  • Cells at the start of culture may be differentiated cells (also referred to as somatic cells) such as fibroblasts, hepatocytes, adipocytes, cardiomyocytes, blood cells (T cells, B cells, hematopoietic stem cells, etc.).
  • somatic cells such as fibroblasts, hepatocytes, adipocytes, cardiomyocytes, blood cells (T cells, B cells, hematopoietic stem cells, etc.
  • T cells T cells
  • B cells hematopoietic stem cells, etc.
  • the stem cell induction method is not particularly limited as long as it is a known method.
  • a reprogramming factor can be introduced into a cell as a protein, or a nucleic acid (RNA, DNA) encoding the reprogramming factor can be introduced into a cell directly or using a vector.
  • the vector include retrovirus vectors, lentivirus vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, Sendai virus vectors, measles virus vectors, episomal vectors, and the like.
  • the cell concentration at the start of the culture in the culture process of the present invention is not particularly limited, but for example 0.005 to 20 ⁇ 10 5 cells / mL, preferably Examples include 0.02 to 5 ⁇ 10 5 cells / mL, and more preferably 0.05 to 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • various media used for culturing stem cells can be used.
  • Cellartis registered trademark
  • DEF-CS medium manufactured by Takara Bio Inc.
  • a medium that does not contain heterogeneous components such as fetal bovine serum (FBS or fetal calf serum: FCS), sheep serum, a medium without serum, and a medium that does not contain unknown components. It is done.
  • FBS fetal bovine serum
  • FCS fetal calf serum
  • sheep serum fetal bovine serum
  • a medium without serum a medium without serum
  • a medium that does not contain unknown components It is done.
  • Such a xeno-free medium can be appropriately prepared, but a known medium or a commercially available medium may be used as it is or after modification.
  • the commercially available medium containing no heterogeneous components for example, Cellartis (registered trademark) DEF-CS xeno-free medium (Takara Bio), DXF (PromoCell), TeSR-E8 medium (Stemcell Technologies) is used. can do.
  • DEF-CS xeno-free medium Tekara Bio
  • DXF PromoCell
  • TeSR-E8 medium TeSR-E8 medium
  • RHB-A medium manufactured by Takara Bio Inc.
  • Cell culture conditions are not particularly limited, and normal cell culture conditions can be employed.
  • the culture conditions include culture at a temperature of 37 ° C., a humidity of 95%, and a CO 2 concentration of 5%, but the present invention is not limited to such conditions.
  • culturing is performed at a temperature of 30 to 40 ° C., a humidity of 90 to 98%, and a CO 2 concentration of 3 to 7%. humidity, may be carried out in CO 2 concentration.
  • the culture medium used and other components used at the same time can be appropriately set.
  • the stem cells when aiming at maintenance and expansion culture of stem cells, use an appropriate medium in a container coated with the polypeptide used in the present invention, and medium exchange and passage are performed.
  • the culture is performed for 5 days or longer, preferably 10 days or longer.
  • stem cells can be grown. That is, 80% or more, preferably 90% or more of the cell population obtained by this culture is stem cells.
  • the serially diluted stem cells are seeded in a container coated with the polypeptide used in the present invention. Thereafter, using an appropriate medium, the medium is exchanged, for example, for 5 days or longer, preferably 10 days or longer until colonies appear.
  • the medium is exchanged, for example, for 5 days or longer, preferably 10 days or longer until colonies appear.
  • single cell cloning of stem cells can be performed. That is, 80% or more, preferably 90% or more of the cells in the colony obtained by this culture are stem cells.
  • the stem cells obtained by the culture process of the present invention can be distinguished from other cells based on their morphological characteristics.
  • alkaline phosphatase stage-specific embryonic antigen (SSEA, such as SSEA-4), tumor rejection antigen (TRA) -1-60, TRA-
  • SSEA stage-specific embryonic antigen
  • TRA tumor rejection antigen
  • a marker molecule that serves as an indicator of an undifferentiated state such as 1-81, OCT4, or NANOG.
  • the expression of the molecule (positive marker) can be confirmed using, for example, an antibody that recognizes the molecule.
  • alkaline phosphatase the expression can also be confirmed based on the enzyme activity.
  • a neural stem cell although not particularly limited, for example, it can be confirmed based on the expression of a neural stem cell marker molecule such as Nestin.
  • the stem cells obtained by the culture process of the present invention express the positive marker in 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more.
  • stem cells isolated from other cells can be obtained by isolating stem cells from the cell population obtained by the culture process of the present invention.
  • An antibody that recognizes a molecule characteristic of a stem cell is useful for isolating and purifying the stem cell obtained by the present invention.
  • the stem cells isolated in this way can be established as a cell line by a known method. That is, as one aspect of the present invention, a method for producing a stem cell including a step of a method for producing a cell population containing the stem cell of the present invention and a step of isolating a stem cell from the obtained cell population can be mentioned. Furthermore, various differentiated cells can be produced by differentiating the stem cells thus obtained by a known method.
  • the stem cells obtained from the present invention and differentiated cells obtained from the cells can also be used for, for example, research on stem cell differentiation, drug screening for various diseases, evaluation of efficacy and safety of drug candidate compounds, and the like. According to the present invention, since many stem cells can be obtained by a single operation, it becomes possible to obtain reproducible research results without being affected by cell lot differences as in the past. .
  • the present invention provides a novel recombinant polypeptide useful for the production of stem cells.
  • the polypeptide is a recombinant polypeptide containing the polypeptides (a) to (c) described in “1. Method for Producing Stem Cell of the Present Invention” in the same molecule, and is useful for the method.
  • the polypeptide of the present invention has a function of proliferating stem cells, a function of maintaining the undifferentiated state of stem cells, and / or a function of inducing stem cells.
  • the polypeptide of the present invention has functions equivalent to full-length fibronectin or higher than existing fibronectin fragments.
  • the polypeptide of the present invention is a recombinant polypeptide comprising the following polypeptides (a) to (c) in the same molecule: (A) a recombinant polypeptide containing a repeat selected from the group consisting of human fibronectin III-1-7, or one or several amino acids in the amino acid sequence of a repeat selected from the group consisting of III-1-7 above A recombinant polypeptide comprising an amino acid sequence in which the amino acids are substituted, deleted, inserted or added, (B) A recombinant polypeptide comprising III-8 to 10 repeats of human fibronectin, or an amino acid wherein one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence of III-8 to 10 repeats described above A recombinant polypeptide comprising a sequence, and (c) a recombinant polypeptide comprising a III-12-14 repeat of human fibronectin, or one or several amino acids in the amino acid sequence of said III-12-14 repeat
  • the recombinant polypeptides (a), (b) and (c) are as described in “1. Stem cell production method of the present invention”.
  • polypeptide which has (a), (b), (c) from the N terminal side is mentioned.
  • (b) and (c) each preferably have binding activity to integrin ⁇ 5 ⁇ 1 (also referred to as VLA-5) and binding activity to heparin.
  • a particularly preferred embodiment of the polypeptide of the present invention is a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20 in the sequence listing.
  • a recombinant polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted or added in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19 or 20 in the sequence listing, and SEQ ID NO: 19 or A polypeptide having a function equivalent to that of the recombinant polypeptide comprising the amino acid sequence according to 20, or a function of proliferating stem cells, a function of maintaining an undifferentiated state of stem cells, and / or a function of inducing stem cells Included in the present invention.
  • III-1 an amino acid sequence in which the N-terminal 9 amino acids of III-1 are deleted (SEQ ID NO: 23)
  • the N-terminal 5 amino acids of III-1 is Polypeptides containing a deleted amino acid sequence (SEQ ID NO: 24) or an amino acid sequence in which the N-terminal 3 amino acids of III-1 have been deleted (SEQ ID NO: 25) are also included in the polypeptide.
  • FCH-296 lacking the N-terminal 9 amino acids SEQ ID NO: 29
  • FCH-296 missing the N-terminal 6 amino acids SEQ ID NO: 30
  • FCH-296 lacking the N-terminal 5 amino acids SEQ ID NO: 31
  • N-terminal 3 amino acid deletion FCH-296 SEQ ID NO: 32
  • N-terminal 3 amino acid insertion FCH-296 SEQ ID NO: 33
  • N-terminal 6 amino acid insertion FCH-296 SEQ ID NO: 34
  • N-terminal 9 amino acids Inserted FCH-296 SEQ ID NO: 35
  • N-terminal 11 amino acid inserted FCH-296 SEQ ID NO: 36
  • N-terminal 12 amino acid inserted FCH-296 SEQ ID NO: 37
  • N-terminal 14 amino acid inserted FCH-296 SEQ ID NO: 38
  • FCH-296 with N-terminal 15 amino acid insertion SEQ ID NO: 39
  • FCH-296 with N-terminal HKRHEEGH insertion SEQ ID NO:
  • the polypeptide of the present invention can be produced using a known recombinant DNA technique.
  • Known hosts and vectors can be used.
  • bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • yeast filamentous fungi
  • insect cells such as mammalian cells including human cells
  • animal cells such as mammalian cells including human cells
  • the vector carries a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention.
  • the nucleic acid can be produced by modifying a natural nucleic acid (for example, DNA encoding human fibronectin) or by chemical synthesis.
  • the polypeptide of the present invention expressed in a host into which a vector carrying the nucleic acid is introduced or secreted into the culture supernatant of the host can be purified to a desired purity by a known protein purification method. .
  • the present invention provides a solid phase coated with the polypeptide of the present invention.
  • the solid phase is a solid phase described in “1. Stem cell production method of the present invention” and is useful for the method.
  • the solid phase of the present invention is obtained by immobilizing the above-mentioned polypeptide on the surface of an appropriate solid phase.
  • the solid phase include cell culture equipment or cell culture carriers, specifically dishes, plates, flasks, bags, beads, membranes, and glass slides. These are not particularly limited as long as they can be used in the method for producing stem cells of the present invention.
  • immobilization of the polypeptide to the solid phase can utilize the method described for the method for producing stem cells of the present invention.
  • the solid phase of the present invention can stably maintain stem cells on the surface of the solid phase, it is possible to improve the efficiency of culture operations such as medium exchange. Moreover, by preparing the solid phase of the present invention in advance, the method for producing stem cells of the present invention can be immediately implemented.
  • FCH-296 polypeptide SEQ ID NO: 21 having a His-tag consisting of a methionine residue and 6 histidine residues at the N-terminus was prepared by the following procedure.
  • DNA encoding the polypeptide was artificially synthesized and incorporated into an expression plasmid.
  • Escherichia coli was transformed with the plasmid, and the resulting transformant was cultured under conditions for expressing the polypeptide.
  • the cells collected from the culture were crushed with an ultrasonic crusher (manufactured by Kubota) to obtain a cell-free extract.
  • an ultrasonic crusher manufactured by Kubota
  • a series of column chromatography of Ni-Chelating Sepharose manufactured by GE Healthcare
  • Hydroxyapatite 40 ⁇ m, manufactured by Bio-Rad
  • SP-Sepharose manufactured by GE Healthcare
  • the FCH-296 sample showed a single band by SDS-PAGE / CBB staining.
  • the protein concentration of the FCH-296 sample was measured using a BCA protein quantification kit (Pierce), it was 1.21 mg / mL (12.4 ⁇ M calculated from the molecular weight).
  • DCH-296 polypeptide (SEQ ID NO: 22) having a His-tag consisting of a methionine residue and 6 histidine residues at the N-terminus was prepared by the following procedure.
  • DNA encoding the polypeptide was artificially synthesized and incorporated into an expression plasmid.
  • Escherichia coli was transformed with the plasmid, and the resulting transformant was cultured under conditions for expressing the polypeptide.
  • the cells collected from the culture were crushed with an ultrasonic crusher to obtain a cell-free extract.
  • DCH-296 was purified by a series of column chromatography using Ni-Chelating Sepharose, Hydroxyapatite, and SP-Sepharose. Confirmation of DCH-296 in the purification process was performed by SDS-PAGE / CBB staining.
  • the buffer of the obtained sample was replaced with [0.2 g / L KCl, 0.2 g / L KH 2 PO 4 , 8 g / L NaCl, 1.15 g / L Na 2 HPO 4 ], and 3 mL of DCH-296 standard was obtained.
  • the DCH-296 sample showed a single band by SDS-PAGE / CBB staining.
  • the protein concentration of the DCH-296 sample was measured using the BCA protein quantification kit, it was 1.03 mg / mL (11.0 ⁇ M calculated from the molecular weight).
  • Example 3 Evaluation of Adhesion of Various Fibronectin Fragments to Human iPS Cells Full-length fibronectin (derived from human plasma; SIGMA, F0895, final concentration 50 ⁇ g / ml), 120 k-fr (Millipore, F1904, final concentration 40 ⁇ g / ml) ), CH-271 (J. Biochem., Vol. 110, p284-291 (1991), final concentration of 25 ⁇ g / ml) and CH-296 (RetroNectin: manufactured by Takara Bio Inc., final concentration of 20 ⁇ g / ml) are each D- Dissolved in PBS (Procell, C-40232) to prepare a coating solution.
  • PBS Procell, C-40232
  • the coating solution was added to 12 well Tissue Culture Treated Plate (Corning Co., 3513) at 0.4 mL / well, then the plate was covered and left at 4 ° C. overnight. The next day, the plate from which the coating solution had been removed was washed twice with 1 mL / well of D-PBS to obtain a plate coated with each polypeptide.
  • the second coating solution When coating with two types of fibronectin fragments, add the second coating solution at 0.4 mL / well to the plate after the first coating, and leave at 4 ° C. overnight as in the first coating. And washed. The prepared plate was capped and stored at 4 ° C. until use.
  • FCH-296 has cell adhesion equivalent to that of full-length fibronectin in the culture of human iPS cells.
  • Example 5 Long-term culture of human iPS cells (DEF-CS medium) Full-length fibronectin or FCH-296 was dissolved in D-PBS, respectively, to prepare coating solutions of various concentrations. Using these coating solutions, coating of 24 well Tissue Culture Treated Plate (Corning) was performed in the same manner as in Example 3.
  • TRA-1-60 positive cell rate and SSEA4 positive cell rate were measured by flow cytometry. The results are shown in Table 3.
  • TRA-1-60 and SSEA4 are pluripotent stem cell markers.
  • human iPS cells proliferated while retaining pluripotency, similar to the plate coated with fibronectin. From the above, it was shown that human iPS cells can be cultured for a long time on a plate coated with FCH-296.
  • Example 6 Long-term culture of human iPS cells (DEF-CS xenofree medium) It was examined whether human iPS cells can be cultured for a long time on a plate coated with FCH-296 even in a medium containing no animal or human component, ie, a xeno-free medium.
  • Full length fibronectin or FCH-296 was dissolved in D-PBS, respectively, to prepare coating solutions of various concentrations. Using these coating solutions, coating of 24 well Tissue Culture Treated Plate was performed in the same manner as in Example 3. In addition, coating was performed using Synthemax (registered trademark) II-SC Substrate (manufactured by Corning) recommended in DEF-CS xenofree medium (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • TRA-1-60 positive cell rate and SSEA4 positive cell rate were measured by flow cytometry. The results are shown in Table 4.
  • TRA-1-60 and SSEA4 are pluripotent stem cell markers.
  • human iPS cells proliferated while retaining pluripotency, similar to the plate coated with fibronectin or Synthemax. From the above, it was shown that human iPS cells can be cultured for a long time on a plate coated with FCH-296 even in a DEF-CS xeno-free medium.
  • TeSR-E8 medium Long-term culture of human iPS cells (TeSR-E8 medium) TeSR-E8 medium is a xeno-free medium containing only the minimum 8 elements necessary for the maintenance of human iPS / ES cells. It was examined whether human iPS cells could be cultured for a long time on a plate coated with FCH-296 even in TeSR-E8 medium.
  • fibronectin or FCH-296 was dissolved in D-PBS, respectively, to prepare coating solutions of various concentrations. Using these coating solutions, coating of 24 well Tissue Culture Treated Plate was performed in the same manner as in Example 3. In addition, coating was performed using Vitronectin XF (manufactured by Corning) recommended in TeSR-E8 medium (manufactured by Stemcell Technologies).
  • TRA-1-60 positive cell rate and SSEA4 positive cell rate were measured by flow cytometry. The results are shown in Table 5.
  • TRA-1-60 and SSEA4 are pluripotent stem cell markers.
  • human iPS cells proliferated while retaining pluripotency, similar to the plate coated with fibronectin or Vitronectin. From the above, it was shown that human iPS cells can be cultured for a long time on a plate coated with FCH-296 even in TeSR-E8 medium.
  • Example 8 Long-term culture of human neural stem cells It was examined whether human neural stem cells could be cultured for a long time on a plate coated with FCH-296.
  • FCH-296 was dissolved in D-PBS to prepare a 30 ⁇ g / ml coating solution. Using this coating solution, coating of 12 well Tissue Culture Treated Plate was performed in the same manner as in Example 3. Further, laminin (manufactured by gibco, 10 ⁇ g / ml) recommended for RHB-A medium (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for coating. Human neural stem cells were seeded on the coated plate at 1.5 to 2.0 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 . From the next day, the medium was changed every 2 days, and the cells were passaged every 4-8 days. The results of cell proliferation are shown in FIG.
  • Example 9 Single-cell cloning of human iPS cells Full-length fibronectin or FCH-296 was dissolved in D-PBS to prepare coating solutions of various concentrations. Using these coating solutions, coating of 96 well Half area Tissue Cultured Plated (Corning) was performed in the same manner as in Example 3.
  • Example 10 Evaluation of adhesion to human iPS cells (F1CH-296, F2CH-296, F3CH-296)
  • three polypeptides F1CH-296, F2CH-296, and F3CH-) as shown in FIG. 296) was prepared. That is, in the same manner as in Example 1, F1CH-296 (SEQ ID NO: 26), F2CH-296 (SEQ ID NO: 27) having a His-tag consisting of a methionine residue and 6 histidine residues at the N-terminus, And F3CH-296 (SEQ ID NO: 28) were prepared.
  • Full length fibronectin, CH-296, FCH-296, F1CH-296, F2CH-296 or F3CH-296 was dissolved in D-PBS to prepare coating solutions of various concentrations. Using these coating solutions, coating of 24 well Tissue Culture Treated Plate was performed in the same manner as in Example 3. 50 ⁇ g / ml fibronectin is about 200 nM, 20 ⁇ g / ml CH-296, 30 ⁇ g / ml FCH-296, and 24 ⁇ g / ml F1CH-296 is about 320 nM.
  • the three polypeptides (F1CH-296, F2CH-296, and F3CH-296) showed the same tendency. That is, for example, cell detachment is observed on the 8th day under the condition of 24 ⁇ g / ml. On the other hand, cell detachment was observed on the third day with CH-296, and no cell detachment was observed with FCH-296. This indicates that the adhesion activity of the three polypeptides (F1CH-296, F2CH-296, and F3CH-296) is higher than that of CH-296 and lower than that of FCH-296. As described above, the three type III repeats (III-1, III-2, III-3) have the same cell adhesion and the highest cell adhesion activity when all three type III repeats are contained. It was shown that.
  • FCH-296 having various N-terminal sequences were prepared. That is, FCH-296 lacking N-terminal 9 amino acids (SEQ ID NO: 29), FCH-296 missing SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 30), FCH-296 missing N-terminal 5 amino acids (SEQ ID NO: 31), N-terminal 3 Amino acid-deficient FCH-296 (SEQ ID NO: 32), FCH-296 (SEQ ID NO: 19), N-terminal 3 amino acid insertion FCH-296 (SEQ ID NO: 33), N-terminal 6 amino acid insertion FCH-296 (SEQ ID NO: 34) N-terminal 9 amino acid inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 35), N-terminal 11 amino acid inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 36), N-terminal 12 amino acid inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 37), N-terminal 14 amino acids Inserted FCH-296 (SEQ ID NO: 38
  • FCH-296 (SEQ ID NO: 41 N-terminal HKRH insertion), FCH-296 (SEQ ID NO: 42 N-terminal HH insertion), and FCH-296 (SEQ ID NO: 43 N-terminal HHH insertion) was prepared.
  • FCH-296 (with His-tag, SEQ ID NO: 21) used in Examples 5 to 9
  • any of FCH-296 having various N-terminal sequences described above was used.
  • Implement the contents described in. FCH-296 having various N-terminal sequences has the same effect as FCH-296.
  • the present invention provides a method for producing a large amount of stem cells in a short period of time and a polypeptide used for the method.

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Abstract

幹細胞を新規の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養することにより、幹細胞が効率的に増殖する。

Description

幹細胞の製造に用いられるフィブロネクチンフラグメント
　本発明は、種々の細胞への分化能力を保持した幹細胞の製造方法に関する。
　幹細胞は、分裂して自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力を持ち、際限なく増殖できる細胞と定義されている。幹細胞から生じた二つの娘細胞のうち、少なくとも一方が同じ幹細胞でありつづけることによって分化細胞を供給することができる。
　現在、幹細胞の作製方法に関して、盛んに研究が進められている。例えば、幹細胞の培養用基材として、マウス由来のフィーダー細胞、マトリゲル、ラミニンやフィブロネクチンなどの細胞外基質（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｍａｔｒｉｘ）、などが利用できる。
　フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメントを利用した、幹細胞の作製方法の研究として、例えば、非特許文献１が挙げられる。非特許文献１には、１２０ｋＤａのフィブロネクチンフラグメント（以下、１２０ｋ－ｆｒとする）上でヒト胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）を培養することにより、多分化能を維持したままで、ヒトＥＳ細胞を増殖させる方法が開示されている。しかし、１２０ｋ－ｆｒ上での細胞の増殖速度は、全長（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ）フィブロネクチン上での増殖速度に比べると遅かった。また、幹細胞が再生医療において使用されるには、品質及び安全性が確保される必要があるが、全長フィブロネクチンや市販の１２０ｋ－ｆｒは天然のフィブロネクチン由来のため、起源生物が保有していたウイルス等が持ち込まれる危険性が高い。
　このように、フィブロネクチンやフィブロネクチンフラグメントを利用し、短期間で充分な量の幹細胞を製造する技術は未だ確立していない。
ジャーナル　オブ　ザ　ロイヤル　ソサエティー　インターフェース（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、第１０巻、第８３号、２０１３０１３９（２０１３年）
　本発明は、従来の幹細胞の製造方法が有していた問題を解決しようとするものであり、フィブロネクチンフラグメントを用いて、短期間に大量の幹細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、幹細胞を新規の組換えフィブロネクチンフラグメントの存在下で培養することにより、幹細胞が効率的に増殖することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
［１］　幹細胞を、
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－８～１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－８～１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１２～１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
の存在下で培養する工程を包含する、幹細胞の製造方法、
［２］　幹細胞を、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組換えポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドの存在下で培養する工程を包含する、［１］に記載の製造方法、
［３］　（ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［１］又は［２］に記載の製造方法、
［４］　組換えポリペプチドが、配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［３］に記載の製造方法、
［５］　組換えポリペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程が、組換えポリペプチドがコートされた固相と幹細胞とが接触した状態で実施される、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法、
［６］　固相が、細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、［５］に記載の製造方法、
［７］　固相が、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、［５］に記載の製造方法、
［８］　幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞又は神経幹細胞である、［１］～［７］のいずれかに記載の製造方法、
［９］　幹細胞が、人工多能性幹細胞である、［８］に記載の製造方法、
［１０］　（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－８～１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－８～１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１２～１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
を同一分子内に含む組換えポリペプチド、
［１１］　（ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、［１０］に記載のポリペプチド、
［１２］　配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドでる、［１０］に記載の組換えポリペプチド、
［１３］　［１０］～［１２］のいずれかに記載の組換えポリペプチドがコートされた固相、
［１４］　組換えポリペプチドがコートされた細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、［１３］に記載の固相、
［１５］　組換えポリペプチドがコートされたディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、［１３］に記載の固相、
に関する。
　本発明により、幹細胞の製造方法が提供される。本発明の方法によれば、幹細胞を効率よく増殖させること、幹細胞の未分化状態を維持すること、及び幹細胞を効率よく誘導することができる。当該方法は細胞増殖率が高く、本発明により得られる幹細胞は所望の細胞への分化能を有していることから、例えば、再生医療に好適に使用される。従って、本発明の方法は、医療分野への多大な貢献が期待される。また、本発明により、新規の組換えフィブロネクチンフラグメントが提供される。
フィブロネクチンのドメイン構造を示す模式図である。 実施例５における、細胞増殖を示す図である。 実施例６における、細胞増殖を示す図である。 実施例７における、細胞増殖を示す図である。 実施例８における、細胞増殖を示す図である。 フィブロネクチンフラグメントのドメイン構造を示す模式図である。
　以下に本発明について詳細に説明する。
＜フィブロネクチン＞
　ヒト由来や哺乳動物由来のフィブロネクチンがよく研究されており、以下は、主にヒト由来血漿フィブロネクチンについての知見である。
　フィブロネクチンは血液中、細胞表面、細胞外マトリックスなどに存在する分子量約２５０ｋＤａ（単量体）の巨大な糖タンパク質で、細胞接着などの多彩な機能を持つことが知られている。フィブロネクチンはドメイン構造から成り（以下、図１参照）、またそのアミノ酸配列中には３種類の類似の配列が含まれている。３種類の類似の配列は、それぞれＩ型リピート、ＩＩ型リピート、ＩＩＩ型リピートと呼ばれ、このうち、ＩＩＩ型リピートは８７～９６個のアミノ酸残基で構成されており、各リピート間でのアミノ酸配列の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は１７～４０％である。フィブロネクチン中には１５個のＩＩＩ型リピートが存在するが、そのうち、１番目、２番目、３番目（以下、それぞれＩＩＩ－１、ＩＩＩ－２、ＩＩＩ－３と称する）は自己会合ドメインに、４番目、５番目、６番目（以下、それぞれＩＩＩ－４、ＩＩＩ－５、ＩＩＩ－６と称する）はＤＮＡ結合ドメインに、８番目、９番目、１０番目（以下、それぞれＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０と称する）は細胞結合ドメインに、また１２番目、１３番目、１４番目（以下、それぞれＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３、ＩＩＩ－１４と称する）はヘパリン結合ドメインに含有されている。ＩＩＩ－１０にはインテグリンα５β１（ＶＬＡ－５ともいう）に対して結合活性を有する領域が含まれており、このコア配列はＲＧＤである。また、フィブロネクチンのＣ末端側寄りの部位にはＩＩＩＣＳと呼ばれる領域が存在する。ＩＩＩＣＳにはＣＳ－１と呼ばれる２５アミノ酸からなる配列が含まれており、当該配列はインテグリンα４β１（ＶＬＡ－４ともいう）に対して結合活性を示す。
　ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～１４及びＣＳ－１のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１～１４及び１５として、本明細書の配列表に示す。
１．本発明の幹細胞の製造方法
　本発明の幹細胞の製造方法は、幹細胞を組換えフィブロネクチンフラグメントであるポリペプチドの存在下で培養する工程を包含することを特徴とする。
　本発明に使用される幹細胞は、分裂して自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力を持つ細胞であれば限定されない。幹細胞は分化能力の違いによって、以下のように分類されるが、本発明に使用される幹細胞はいずれでもよい。
（１）分化全能性幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）：胎盤などの生体外組織を含む、一個体を形成するすべての細胞種への分化が可能な幹細胞を指す。受精卵（および４～８回の卵割まで）が例示される。
（２）多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）：個体は形成しないが、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に属する細胞系列すべてへ分化し得る幹細胞を指す。特に限定されないが、例えば、胚盤胞期の内部細胞隗や、そこから樹立された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、核移植ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）などが挙げられる。多能性幹細胞は万能細胞と呼称されることがある。
（３）多分化能幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）：分化可能な細胞系列が限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な幹細胞を指す。特に限定されないが、例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞などが挙げられる。一般的に胚葉を超えた分化は行えないが、例外もある。
（４）オリゴポテント幹細胞（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）：数種の細胞種にのみ分化可能な幹細胞を指す。特に限定されないが、例えば、神経幹細胞などが挙げられる。
（５）単分化能幹細胞（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）：分化可能な細胞種が一種類に限定されている幹細胞を指す。幹細胞として分裂増殖するか、分化して幹細胞以外の別の細胞種に変化することができる。特に限定されないが、例えば、筋幹細胞、生殖幹細胞（卵祖細胞、精原細胞）などが挙げられる。単分化能幹細胞は前駆細胞と呼ばれることもある。
　本発明に使用される幹細胞の起源は特に限定されず、任意の生物、好ましくは哺乳動物に由来する幹細胞を使用することができる。生物の年齢、性別は特に限定されない。１つの実施形態において、霊長目（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞が使用される。最も好ましくは、ヒト由来の細胞が使用されるが、本発明はそれに限定されない。
　本発明の好適な態様において、幹細胞は好ましくは多能性幹細胞であり、より好ましくはｉＰＳ細胞であり、さらに好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞の作製に関しては種々の方法が知られているが、本発明の方法は特定の方法で作製されたｉＰＳ細胞にのみ使用可能なものではない。株化されたｉＰＳ細胞、例えば樹立されたヒトｉＰＳ細胞株（２５３Ｇ１株）等にも適用できる。
　ヒトへの投与を目的として本発明の方法により幹細胞を製造する場合、好ましくはレシピエントと組織適合性抗原のタイプが一致又は類似したドナーより採取された細胞が、幹細胞の製造に供される。例えばレシピエント自身より採取された細胞が、幹細胞の製造に供される。
　本発明の幹細胞の製造方法は、後述のポリペプチドの存在下での培養工程（以下、本発明の培養工程と称することがある）を包含することを特徴とする、幹細胞の製造方法である。
　本発明の幹細胞の製造方法では、ポリペプチド（ａ）、ポリペプチド（ｂ）、及びポリペプチド（ｃ）の存在下に幹細胞の培養が実施される。本発明の方法は、ポリペプチド（ａ）、ポリペプチド（ｂ）、及びポリペプチド（ｃ）の存在下に実施することができる。さらに、（ａ）及び（ｂ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ｃ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ｂ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドとポリペプチド（ａ）の２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、（ａ）及び（ｂ）を同一分子内に含むポリペプチドと（ｂ）及び（ｃ）を同一分子内に含むポリペプチドの２種類のポリペプチドの混合物の存在下に、又は、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を同一分子内に含む１種のポリペプチドの存在下に幹細胞の培養を実施してもよい。ただし、前記の（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を同一分子内に含む１種のポリペプチドは、全長フィブロネクチンとは異なる。
　ポリペプチド（ａ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。当該ポリペプチド（ａ）において、「ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピート」は、少なくとも１つのリピート、好適には３つのリピートであればよく、７つすべてのリピートであってもよい。当該ポリペプチド（ａ）は、特に好適には、ＩＩＩ－１、ＩＩＩ－２及びＩＩＩ－３リピートを含むポリペプチド、又は、ＩＩＩ－４、ＩＩＩ－５及びＩＩＩ－６リピートを含むポリペプチド、あるいはＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
　ポリペプチド（ｂ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－８～１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－８～１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ｂ）は、ＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０をすべて含むポリペプチドである。
　ポリペプチド（ｃ）は、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１２～１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである。すなわち、当該ポリペプチド（ｃ）は、ＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３、ＩＩＩ－１４をすべて含むポリペプチドである。
　同一分子内に（ａ）と（ｂ）を含むポリペプチドとして、１２０ｋＤａのフィブロネクチンフラグメント（１２０ｋ－ｆｒ）が例示される。１２０ｋ－ｆｒは、Ｎ末端側から順にＩＩＩ－１、ＩＩＩ－２、ＩＩＩ－３、ＩＩＩ－４、ＩＩＩ－５、ＩＩＩ－６、ＩＩＩ－７、ＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０を含む、分子量約１２０ｋＤａのタンパク質である。１２０ｋ－ｆｒの予想されるアミノ酸配列（９３２アミノ酸残基）を、配列番号１６として、本明細書の配列表に示す。１２０ｋ－ｆｒのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを作製して適切な宿主－ベクター系と組み合わせることにより、１２０ｋ－ｆｒを組換えポリペプチドとして製造することができる。また、市販の１２０ｋ－ｆｒを使用してもよい。
　同一分子内に（ｂ）と（ｃ）を含むポリペプチドとして、ＣＨ－２７１やＣＨ－２９６が例示される。
　ＣＨ－２７１は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０、ＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３、ＩＩＩ－１４を含む、分子量約６０ｋＤａ（５４９アミノ酸残基）の組換えタンパク質である。ＣＨ－２７１のアミノ酸配列を、配列番号１７として、本明細書の配列表に示す。
　ＣＨ－２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０、ＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３、ＩＩＩ－１４、ＣＳ－１を含む、分子量約６３ｋＤａ（５７４アミノ酸残基）の組換えタンパク質である。ＣＨ－２９６のアミノ酸配列を、配列番号１８として、本明細書の配列表に示す。ＣＨ－２９６は、レトロネクチン（登録商標、タカラバイオ社製）として市販されている。
　例えば、前記の１２０ｋ－ｆｒと、ＣＨ－２７１又はＣＨ－２９６とを組み合わせて使用することにより、本発明の幹細胞の製造方法を実施することができる。
　同一分子内に（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を有するポリペプチドも本発明の幹細胞の製造方法に使用することができる。本発明を特に限定するものではないが、同一分子内に（ａ）と（ｂ）と（ｃ）を含むポリペプチドとして、下記のＦＣＨ－２９６、ＤＣＨ－２９６が例示される。
　ＦＣＨ－２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ－１、ＩＩＩ－２、ＩＩＩ－３、ＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０、ＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３、ＩＩＩ－１４、ＣＳ－１を含む、分子量約９６ｋＤａ（８８１アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＦＣＨ－２９６のアミノ酸配列を、配列番号１９として、本明細書の配列表に示す。配列番号１９のうち、アミノ酸番号１～２９８が（ａ）に該当し、アミノ酸番号２９９～３０７がＧＳ　ｌｉｎｋｅｒに該当し、アミノ酸番号３０８～５８５が（ｂ）に該当し、アミノ酸番号５８６～８５６が（ｃ）に該当し、アミノ酸番号８５７～８８１がＣＳ－１に該当する。なお、配列番号１９のアミノ酸番号９４～１１１は、ＩＩＩ－１とＩＩＩ－２との間に存在する、ＩＩＩ型リピート以外の領域である。ＦＣＨ－２９６は、本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。
　ＤＣＨ－２９６は、Ｎ末端側から順にＩＩＩ－４、ＩＩＩ－５、ＩＩＩ－６、ＩＩＩ－８、ＩＩＩ－９、ＩＩＩ－１０、ＩＩＩ－１２、ＩＩＩ－１３、ＩＩＩ－１４、ＣＳ－１を含む、分子量約９３ｋＤａ（８５１アミノ酸残基）の組換えポリペプチドである。ＤＣＨ－２９６のアミノ酸配列を、配列番号２０として、本明細書の配列表に示す。配列番号２０のうち、アミノ酸番号１～２６８が（ａ）に該当し、アミノ酸番号２６９～２７７がＧＳ　ｌｉｎｋｅｒに該当し、アミノ酸番号２７８～５５５が（ｂ）に該当し、アミノ酸番号５５６～８２６が（ｃ）に該当し、アミノ酸番号８２７～８５１がＣＳ－１に該当する。ＤＣＨ－２９６は、本発明において初めて製造された新規なポリペプチドである。
　本発明に使用されるポリペプチド（ａ）～（ｃ）は、機能的に同等であれば、あるいは幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、又は幹細胞を誘導する機能を保持するかぎり、ＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピート、ＩＩＩ－８～１０リピート、又はＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでいてもよい。本明細書において、「１もしくは数個」とは、特に限定はされないが、１～１５個の範囲、好ましくは１～１０個の範囲、更に好ましくは１～５個の範囲、特に好ましくは１～３個の範囲である。特には限定されないが、例えば、ＩＩＩ－１（配列番号１）を含む代わりに、ＩＩＩ－１のＮ末９アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２３）、ＩＩＩ－１のＮ末５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２４）、又はＩＩＩ－１のＮ末３アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２５）を含むポリペプチドも、当該ポリペプチドに含まれる。更に、（ａ）～（ｃ）を含むポリペプチドとして、ＦＣＨ－２９６のアミノ酸配列（配列番号１９）又はＤＣＨ－２９６のアミノ酸配列（配列番号２０）において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが例示され、より具体的には、限定するものではないが、Ｎ末９アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３０）、Ｎ末５アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３１）、Ｎ末３アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３２）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３３）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３４）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３５）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３６）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３７）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３８）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３９）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４０）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４１）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４２）、Ｎ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４３）、Ｎ末にＨｉｓ－ｔａｇを有するＦＣＨ－２９６（配列番号２１）、及びＮ末にＨｉｓ－ｔａｇを有するＤＣＨ－２９６（配列番号２２）が、例示される。
　また、本発明に使用されるポリペプチド（ａ）～（ｃ）は、機能的に同等であれば、あるいは幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、又は幹細胞を誘導する機能を保持するかぎり、ＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピート、ＩＩＩ－８～１０リピート、又はＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列を含んでいてもよい。特に限定はされないが、ＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピート、ＩＩＩ－８～１０リピート、又はＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが例示される。
　アミノ酸の置換、欠失、挿入または付加（以下、「アミノ酸の置換等」と称する場合がある）は、本来のポリペプチドの機能が維持され得る範囲内で該ポリペプチドの物理化学的性状等を変化させ得る程度が好ましい。例えば、アミノ酸の置換等は、本来のポリペプチドの持つ性質（例えば、疎水性、親水性、電荷、ｐＫ等）を実質的に変化させない範囲の保存的なものが好ましい。例えば、アミノ酸の置換は、１．グリシン、アラニン；２．バリン、イソロイシン、ロイシン；３．アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；４．セリン、スレオニン；５．リジン、アルギニン；６．フェニルアラニン、チロシンの各グループ内での置換であり、アミノ酸の欠失、付加、挿入は、ポリペプチドにおけるそれらの対象部位周辺の性質に類似した性質を有するアミノ酸の、対象部位周辺の性質を実質的に変化させない範囲での欠失、付加、挿入が好ましい。
　アミノ酸の置換等は種差や個体差に起因して天然に生じたものであってもよく、また、人工的に導入されたものであってもよい。人工的な導入は公知の方法により行えばよく、特に限定はないが、例えば、公知の手法により、塩基の置換、欠失、付加もしくは挿入を前述のポリペプチドをコードする核酸に導入した核酸を使用することにより、当該ポリペプチドのアミノ酸配列に１もしくは数個のアミノ酸置換等を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造することができる。
　本明細書において「機能的に同等」または「同等な機能」とは、アミノ酸置換等を導入されていない対応するポリペプチドと機能的に同等または同等な機能を意味し、すなわち、比較対象であるポリペプチドを使用して後述の幹細胞の製造を実施した場合、アミノ酸置換等を導入されていない対応するポリペプチドを使用した場合と同等の幹細胞の細胞増殖率が得られること、同等の幹細胞の未分化状態が維持されていること、又は同等の幹細胞の誘導率が得られることをいう。すなわち、後述の実施例に記載の方法に沿ってその性質の評価を実施することにより、ポリペプチドの機能を適宜確認することができる。
　本発明に使用されるポリペプチドは、幹細胞の培養における有用性を失わない範囲で、上記のＩＩＩ型リピート以外のペプチドやアミノ酸残基、及び／又は上記のＩＩＩ型リピート以外のフィブロネクチン中に存在する領域、例えば、ＣＳ－１等を含んでいてもよい。例えば、上記のＩＩＩ型リピート以外の領域に任意のペプチドやアミノ酸残基を導入することができ、各リピートの間にリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）としてアミノ酸残基やペプチドが挿入された本発明のポリペプチドや、組換えポリペプチドの精製に有用なペプチド（ｔａｇ）が付加された本発明のポリペプチドが例示される。ｌｉｎｋｅｒとして、ｇｌｙｃｉｎｅ－ｓｅｒｉｎｅ　ｌｉｎｋｅｒ（ＧＳ　ｌｉｎｋｅｒ）が例示されるが、これらに限定されない。ｔａｇとして、ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）、Ｆｌａｇ－ｔａｇやＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　Ｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｔａｇ（ＧＳＴ－ｔａｇ）が例示されるが、これらに限定されない。特に限定されないが、例えば、Ｎ末にＨｉｓ－ｔａｇを有するＦＣＨ－２９６ポリペプチド（配列番号２１）やＮ末にＨｉｓ－ｔａｇを有するＤＣＨ－２９６ポリペプチド（配列番号２２）は、本発明に使用されるポリペプチドに含まれる。
　本発明の培養工程では、幹細胞が、未分化状態を維持したままで、かつ、高い細胞増殖率で培養される。後述の実施例にも記載のとおり、本発明の幹細胞の製造方法は、公知のフィブロネクチンフラグメントである１２０ｋ－ｆｒ、ＣＨ－２７１又はＣＨ－２９６をそれぞれ単独で使用する方法と比較して、明らかに細胞増殖率が高いこと、未分化状態を高く維持できることから、非常に有用である。さらに、前記の方法を幹細胞の拡大培養に使用することにより、フィーダー細胞を使用しなくとも高い細胞増殖率、未分化状態の維持が実現できるという、大きな利点がある。
　ポリペプチドの調製に関して、フィブロネクチンに関する情報は、キミヅカ　Ｆ．ら〔Ｋｉｍｉｄｕｋａ　Ｆ．，　ｅｔ　ａｌ．、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１１０巻、２８４～２９１頁（１９９１）〕、コーンブリット　Ａ．Ｒ．ら〔Ｋｏｒｎｂｒｉｈｔｔ　Ａ．　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．、ＥＭＢＯ　ジャーナル（ＥＭＢＯ　Ｊ．）、第４巻、第７号、１７５５～１７５９（１９８５）〕、およびセキグチ　Ｋ．ら〔Ｓｅｋｉｇｕｃｈｉ　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２５巻、第１７号、４９３６～４９４１（１９８６）〕等を参照することができる。また、フィブロネクチンをコードする核酸配列又はフィブロネクチンのアミノ酸配列については、Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００２０２６、ＮＰ＿００２０１７に開示されている。
　本発明に使用されるポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により製造される。組換え体の製造、あるいは、取扱いの点で、本発明に使用されるポリペプチドの分子量は１００ｋＤａ以下が望ましい。本明細書におけるポリペプチドにはアセチル化などの化学修飾体も包含される。
　本発明の好適な態様において、幹細胞の培養は、前記のポリペプチドがコートされた固相と幹細胞とが接触した状態で実施される。前記の固相としては、例えば細胞培養に使用される容器又は担体（マイクロビーズ等）が挙げられる。前記のポリペプチドがコートされた固相は幹細胞を安定に保持する能力を有しており、当該細胞の培養に有用である。培養容器は、細胞の維持・生存・分化・成熟・自己複製を阻害するものでなければいかなる素材、形状のものを用いることが出来る。培養容器の素材としては、例えばガラス、不織布を含む合成樹脂や天然樹脂又は金属等がある。また、培養容器の形状としては、三角柱、立方体、直方体などの多角柱や円柱、三角錐、四角錐などの多角錘や円錐、ひょうたんのような任意の形状、球形、半球形、円形、楕円形、半円形等がある。
　幹細胞の培養に使用される細胞培養用器材としては、特に限定はないが、例えば、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、メンブレン、スライドガラス、大型培養槽、バイオリアクター、中空糸型の培養装置等を使用することができる。好適には、プレートが使用され、さらに好適には、Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅが使用される。
　なお、バッグとしては、例えば、細胞培養用ＣＯ２ガス透過性バッグを使用することができる。また、工業的に大量の幹細胞を製造する場合には、大型培養槽を使用することができる。また、培養は開放系、閉鎖系のいずれでも実施することができるが、好適には得られる幹細胞の安全性の観点から閉鎖系で培養を行うことが好ましい。
　固相のコーティング、すなわちポリペプチドの固相表面への固定化は、公知の手法によって実施すればよく、例えば国際公開第９７／１８３１８号パンフレット、ならびに国際公開第００／０９１６８号パンフレットに記載のフィブロネクチンフラグメントの固定化と同様の方法により実施することができる。ポリペプチドを固相に固定化しておけば、本発明の方法により幹細胞を得た後、該細胞と固相とを分離するのみで、該細胞と本発明のポリペプチドとを容易に分離することができ、幹細胞へのポリペプチド等の混入を防ぐことができる。
　より具体的には、ポリペプチドを滅菌蒸留水、緩衝液あるいは生理食塩水等に溶解したコーティング溶液を調製しておき、固定化に使用することができる。好適にはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）、特に好適には、ポリペプチドをダルベッコＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＰＢＳ：Ｄ－ＰＢＳ）を溶媒に用いたコーティング溶液が使用される。
　コーティング溶液中のポリペプチドのモル濃度としては、特に限定はないが、例えば１～１０００００ｎＭ、好適には１０～２０００ｎＭ、さらに好適には３０～１０００ｎＭが例示される。ポリペプチドとしてＦＣＨ－２９６を使用する場合、上記のモル濃度を重量濃度で表すと０．１～１０００μｇ／ｍＬ、好適には１～２００μｇ／ｍＬ、さらに好適には３～１００μｇ／ｍＬとなる。
　上記コーティング溶液を培養容器に添加し、適当な時間保持することでコーティングを実施することができる。コーティング溶液を保持する際の条件は適宜設定すればよいが、例えば室温で１時間、あるいは４℃で一晩、といった条件が挙げられる。
　フィブロネクチンフラグメントがコートされた容器は、そのまま使用するか又は使用時まで低温、例えば０～１０℃で保存することができる。使用直前にはこれらの培養器材からコーティング溶液を除去し、例えばＤ－ＰＢＳで２回、次いで、必要に応じて細胞培養用培地で１回洗浄してから細胞培養に供する。
　本発明の幹細胞の製造方法は、幹細胞製造における培養の全期間、もしくは任意の一部の期間において、前記のポリペプチドの存在下での培養の工程を実施することにより行われる。すなわち、幹細胞の製造工程の一部に前記培養工程を含むものであれば本発明に包含される。
　本発明の培養工程は、幹細胞の誘導、幹細胞の維持、及び幹細胞の拡大培養、又は幹細胞の維持及び幹細胞の拡大培養を含む。したがって、本発明は、上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下に、幹細胞を誘導し、維持し、拡大培養することを含む幹細胞の製造方法、ならびに上記の組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の存在下に、幹細胞を維持及び拡大培養することを含む幹細胞の製造方法を提供する。本発明の幹細胞の製造方法においては、該方法に供する細胞の種類や、培養の条件等を適宜調整して幹細胞の培養を行うことにより、再生医療等に有用な幹細胞を製造することができる。なお、本明細書において幹細胞とは幹細胞を含有する細胞集団を意味する。
　幹細胞の誘導を目的とする場合、本発明の培養工程において、培養開始時の細胞の種類や、幹細胞の誘導方法に特に限定はない。培養開始時の細胞は、繊維芽細胞、肝細胞、脂肪細胞、心筋細胞、血球系細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞等）などの分化した細胞（体細胞ともいう）であってもよいし、誘導後の幹細胞とは異なる種類の幹細胞であってもよい。また、幹細胞の誘導方法は、既知の方法であれば特に限定はされず、例えば、低分子化合物を細胞に接触又は導入する方法、リプログラミング因子を細胞に導入する方法、細胞に核を移植する方法、などが挙げられる。リプログラミング因子をタンパク質として細胞に導入することもできるし、リプログラミング因子をコードする核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）を直接又はベクターを利用して細胞に導入することもできる。上記ベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、センダイウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、エピソーマルベクター、などが挙げられる。
　幹細胞の維持及び拡大培養を目的とする場合、本発明の培養工程において、培養開始時の細胞濃度としては、特に限定はないが、例えば０．００５～２０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、好適には０．０２～５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好適には０．０５～２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬが例示される。
　本発明の培養工程には、幹細胞の培養に用いられる種々の培地を使用することができる。多能性幹細胞を培養する場合は、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）　ＤＥＦ－ＣＳ培地（タカラバイオ社製）を使用することができる。好適には、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ又はｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）やヒツジ血清などの異種由来成分を含まない培地、無血清培地、未知成分を含有しない培地（ｄｅｆｉｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。このような異種由来成分不含（ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ）培地は適宜調製することができるが、公知の培地や市販の培地をそのまま、あるいは改変して使用してもよい。市販の異種由来成分不含培地としては、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）　ＤＥＦ－ＣＳ　ｘｅｎｏ－ｆｒｅｅ培地（タカラバイオ社製）やＤＸＦ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用することができる。神経幹細胞を培養する場合は、例えばＲＨＢ－Ａ培地（タカラバイオ社製）を使用することができる。
　細胞の培養条件には特に限定はなく、通常の細胞培養条件を採用できる。前記培養条件として、温度３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５％での培養が例示されるが、本発明はこのような条件に限定されるものではない。例えば、温度３０～４０℃、湿度９０～９８％、ＣＯ２濃度３～７％、での培養が例示されるが、所望の細胞の増殖が達成できる温度であれば前記の範囲以外の温度、湿度、ＣＯ２濃度で実施してもよい。培養中は、適当な時間間隔で細胞培養液に新鮮な培地を加えて希釈したり、培地を新鮮なものに交換したり、細胞培養用器材を交換することが好ましい。使用される培地や、同時に使用されるその他の成分等は、適宜設定することができる。
　本発明の好適な態様において、幹細胞の維持及び拡大培養を目的とする場合、幹細胞は本発明に使用されるポリペプチドがコートされた容器中で適切な培地を使用し、培地交換と継代を行いながら、例えば５日以上、好ましくは１０日以上培養される。この培養により、幹細胞を増殖させることができる。すなわち、この培養で得られた細胞集団の８０％以上、好ましくは９０％以上が幹細胞である。
　また、本発明の好適な態様において、幹細胞のシングルセルクローニングを目的とする場合、段階希釈された幹細胞は本発明に使用されるポリペプチドがコートされた容器中に播種される。その後、適切な培地を使用し、培地交換を行いながら、例えば５日以上、好ましくは１０日以上、コロニーが出現するまで培養される。コロニーを取得することにより、幹細胞のシングルセルクローニングをすることができる。すなわち、この培養で得られたコロニー中の細胞の８０％以上、好ましくは９０％以上が幹細胞である。
　本発明の培養工程により得られた幹細胞は、その形態上の特徴に基づいてそれ以外の細胞と区別することが可能である。また、多能性幹細胞の場合、アルカリフォスファターゼ、段階特異的胎児抗原（ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ：ＳＳＥＡ、例えばＳＳＥＡ－４等）、腫瘍拒絶抗原（ｔｕｍｏｒ　ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ　ａｎｔｉｇｅｎ：ＴＲＡ）－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＯＣＴ４又はＮＡＮＯＧ等の未分化状態の指標となるマーカー分子の発現に基づいて確認することもできる。前記の分子（ポジティブマーカー）の発現は、例えば前記の分子を認識する抗体を用いて確認することができる。アルカリフォスファターゼに関してはその酵素活性に基づいて発現を確認することもできる。一方、神経幹細胞の場合、特に限定されないが、例えばＮｅｓｔｉｎ等の神経幹細胞マーカー分子の発現に基づいて確認することもできる。
　本発明の培養工程により得られた幹細胞は、８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上が上記ポジティブマーカーを発現している。
　更に、本発明の培養工程により得られる細胞集団より幹細胞を単離し、他の細胞と分離された幹細胞を取得することができる。幹細胞に特徴的な分子を認識する抗体は、本発明により得られた幹細胞を単離、精製するうえで有用である。こうして単離された幹細胞は、公知の方法により細胞株として樹立することができる。すなわち、本発明の態様の一つとして、本発明の幹細胞を含有する細胞集団の製造方法の工程及び得られた細胞集団より幹細胞を単離する工程を包含する幹細胞の製造方法が挙げられる。さらに、こうして得られた幹細胞を公知の方法で分化させることにより、種々の分化細胞を製造することも可能である。
　本発明で得られる幹細胞や当該細胞から得られる分化細胞は、例えば幹細胞の分化に関する研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。本発明によれば、一度の操作で多くの幹細胞を取得することができることから、これまでのように細胞のロット差の影響を受けずに、再現性のある研究結果を得ることが可能となる。
２．本発明のポリペプチド
　本発明は、幹細胞の製造に有用な、新規な組換えポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドは、「１．本発明の幹細胞の製造方法」に記載する（ａ）～（ｃ）のポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドであり、当該方法に有用である。本発明のポリペプチドは、幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、及び／又は幹細胞を誘導する機能を有する。本発明のポリペプチドは、全長フィブロネクチンと同等な機能又は既存のフィブロネクチンフラグメントより高い機能を有する。
　本発明のポリペプチドは、下記（ａ）～（ｃ）のポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドである：
（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
（ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－８～１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－８～１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
（ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１２～１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
　上記組換えポリペプチド（ａ）、（ｂ）および（ｃ）については、「１．本発明の幹細胞の製造方法」に記載のとおりである。
　特に本発明を限定するものではないが、例えばＮ末端側から（ａ）、（ｂ）、（ｃ）を有するポリペプチドが挙げられる。また、（ｂ）、及び（ｃ）はそれぞれインテグリンα５β１（ＶＬＡ－５ともいう）への結合活性、及びヘパリンへの結合活性を有していることが好ましい。
　本発明のポリペプチドの特に好適な態様は、配列表の配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。さらに、配列表の配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであって、かつ配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドと同等な機能を有する、あるいは幹細胞を増殖させる機能、幹細胞の未分化状態を維持する機能、及び／又は幹細胞を誘導する機能を保持するポリペプチドも本発明に包含される。特には限定されないが、例えば、ＩＩＩ－１（配列番号１）を含む代わりに、ＩＩＩ－１のＮ末９アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２３）、ＩＩＩ－１のＮ末５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２４）、又はＩＩＩ－１のＮ末３アミノ酸が欠失したアミノ酸配列（配列番号２５）を含むポリペプチドも、当該ポリペプチドに含まれる。より具体的には、Ｎ末９アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３０）、Ｎ末５アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３１）、Ｎ末３アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３２）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３３）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３４）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３５）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３６）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３７）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３８）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３９）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４０）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４１）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４２）、Ｎ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４３）、Ｎ末にＨｉｓ－ｔａｇを有するＦＣＨ－２９６（配列番号２１）、及びＮ末にＨｉｓ－ｔａｇを有するＤＣＨ－２９６（配列番号２２）が、例示される。
　本発明のポリペプチドは公知の組換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる。宿主やベクターには公知のものが使用できる。例えば細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、糸状菌、昆虫細胞、動物細胞（ヒト細胞を含む哺乳動物細胞等）を宿主とし、各宿主に適合するベクターを使用すればよい。前記ベクターには本発明のポリペプチドをコードする核酸が搭載される。前記核酸は天然の核酸（例えばヒトフィブロネクチンをコードするＤＮＡ）を改変して、あるいは化学合成して作製することができる。当該核酸を搭載したベクターが導入された宿主内で発現された、あるいは宿主の培養上清に分泌された本発明のポリペプチドは、公知のタンパク質精製方法によって所望の純度にまで精製することができる。
３．本発明のポリペプチドがコートされた固相
　本発明は、本発明のポリペプチドがコートされた固相を提供する。当該固相は、「１．本発明の幹細胞の製造方法」に記載される固相であり、当該方法に有用である。
　本発明の固相は、前記のポリペプチドが適切な固相の表面に固定化されたものである。前記固相としては細胞培養用器材又は細胞培養用担体、具体的にはディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン、スライドガラスが例示される。これらは、本発明の幹細胞の製造方法に利用可能なものであれば特に限定はない。さらに、ポリペプチドの固相への固定化は、本発明の幹細胞の製造方法について述べた方法を利用することができる。
　本発明の固相は、幹細胞を固相表面に安定して維持することができるため、培地交換のような培養上の操作の効率を向上させることができる。また、本発明の固相を前もって調製しておくことにより、即時に本発明の幹細胞の製造方法を実施することが可能となる。
　以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。
実施例１　ＦＣＨ－２９６の調製
　Ｎ末にメチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ－ｔａｇを有するＦＣＨ－２９６ポリペプチド（配列番号２１）を、以下の操作により調製した。
　前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを人工合成し、発現プラスミドに組み込んだ。当該プラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を前記ポリペプチドが発現する条件で培養した。培養物より集めた菌体を、超音波破砕機（Ｋｕｂｏｔａ社製）で破砕し、無細胞抽出液を得た。この抽出液を出発材料とし、Ｎｉ－Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（４０μｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、の一連のカラムクロマトグラフィーにより、ＦＣＨ－２９６を精製した。精製過程におけるＦＣＨ－２９６の確認は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色により実施した。得られたサンプルのＢｕｆｆｅｒを〔０．２ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４〕に置換し、ＦＣＨ－２９６標品６ｍＬを得た。
　ＦＣＨ－２９６標品は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色で単一のバンドを示した。ＢＣＡタンパク質定量キット（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いて、ＦＣＨ－２９６標品のタンパク質濃度を測定したところ、１．２１ｍｇ／ｍＬ（分子量から計算すると１２．４μＭ）だった。
実施例２　ＤＣＨ－２９６の調製
　Ｎ末にメチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ－ｔａｇを有するＤＣＨ－２９６ポリペプチド（配列番号２２）を、以下の操作により調製した。
　前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを人工合成し、発現プラスミドに組み込んだ。当該プラスミドで大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体を前記ポリペプチドが発現する条件で培養した。培養物より集めた菌体を、超音波破砕機で破砕し、無細胞抽出液を得た。この抽出液を出発材料とし、Ｎｉ－Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、の一連のカラムクロマトグラフィーにより、ＤＣＨ－２９６を精製した。精製過程におけるＤＣＨ－２９６の確認は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色により実施した。得られたサンプルのＢｕｆｆｅｒを〔０．２ｇ／Ｌ　ＫＣｌ、０．２ｇ／Ｌ　ＫＨ２ＰＯ４、８ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ、１．１５ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４〕に置換し、ＤＣＨ－２９６標品３ｍＬを得た。
　ＤＣＨ－２９６標品は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色で単一のバンドを示した。ＢＣＡタンパク質定量キットを用いて、ＤＣＨ－２９６標品のタンパク質濃度を測定したところ、１．０３ｍｇ／ｍＬ（分子量から計算すると１１．０μＭ）だった。
実施例３　各種フィブロネクチンフラグメントのヒトｉＰＳ細胞に対する接着性の評価
　全長フィブロネクチン（ヒト血漿由来；ＳＩＧＭＡ社製、Ｆ０８９５、終濃度５０μｇ／ｍｌ）、１２０ｋ－ｆｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、Ｆ１９０４、終濃度４０μｇ／ｍｌ）、ＣＨ－２７１（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　Ｖｏｌ．　１１０，　ｐ２８４－２９１　（１９９１）、終濃度２５μｇ／ｍｌ）及びＣＨ－２９６（レトロネクチン：タカラバイオ社製、終濃度２０μｇ／ｍｌ）をそれぞれＤ－ＰＢＳ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ社製、Ｃ－４０２３２）に溶解し、コーティング溶液を調製した。１２　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、３５１３）にコーティング溶液を０．４ｍＬ／ｗｅｌｌで加えた後、プレートに蓋をし、４℃で一晩放置した。翌日、コーティング溶液を除去したプレートを１ｍＬ／ｗｅｌｌのＤ－ＰＢＳで２回洗浄し、各ポリペプチドでコートされたプレートを得た。２種のフィブロネクチンフラグメントでコーティングを行う場合には、１回目のコーティングを終えたプレートに第２のコーティング溶液を０．４ｍＬ／ｗｅｌｌで加え、１回目のコーティングと同様に４℃での一晩放置と洗浄を行った。調製したプレートに蓋をし、使用時まで４℃で保存した。
　Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ（登録商標）　ＤＥＦ－ＣＳ培地（タカラバイオ社製、Ｙ３００１０）で継代培養したヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）（京都大学ｉＰＳ細胞研究所製）を、８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレートに播種し、同じ培地中で３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日から培地を毎日交換し、培養開始後６日目に細胞を観察した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　１２０ｋ－ｆｒ／ＣＨ－２７１及び１２０ｋ－ｆｒ／ＣＨ－２９６でコートされたプレートでは、細胞剥離が認められなかった。これらの結果より、既存のフィブロネクチンフラグメントを組み合わせることで、プレートへの細胞の接着を増強できることが示された。
実施例４　ＦＣＨ－２９６及びＤＣＨ－２９６のヒトｉＰＳ細胞に対する接着性の評価
　全長フィブロネクチン、１２０ｋ－ｆｒ、ＣＨ－２７１、ＣＨ－２９６、ＦＣＨ－２９６又はＤＣＨ－２９６をそれぞれＤ－ＰＢＳに溶解し、コーティング溶液を調製した。また、ＣＨ－２９６については高濃度のコーティング溶液、ＦＣＨ－２９６とＤＣＨ－２９６については低濃度のコーティング溶液も調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で１２　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。
　ＤＥＦ－ＣＳ培地で継代培養したヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）を、８×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日から培地を毎日交換し、培養開始後５、８、１１日目に細胞を観察した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　８日目には、既存のフィブロネクチンフラグメント（１２０ｋ－ｆｒ、ＣＨ－２７１、ＣＨ－２９６）でコーティングしたプレートで細胞剥離が認められた。一方、ＤＣＨ－２９６とＦＣＨ－２９６でコーティングしたプレートでは８日目に細胞剥離は認められなかった。特に、ＦＣＨ－２９６の場合、低濃度のコーティング溶液でコートされたウェルでも１１日目の時点でまったく細胞剥離が認められなかった。以上より、ＦＣＨ－２９６はヒトｉＰＳ細胞の培養において、全長フィブロネクチンと同等の細胞接着性をもつことが示された。
実施例５　ヒトｉＰＳ細胞の長期培養（ＤＥＦ－ＣＳ培地）
　全長フィブロネクチン又はＦＣＨ－２９６をそれぞれＤ－ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のコーティングを実施した。
　ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ－ＣＳ培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換するとともに、３～４日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図２に示す。また、培養開始後３５日目（１０継代目）に、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。その結果を表３に示す。ＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ４は、多能性幹細胞マーカーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でも、フィブロネクチンでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞は多能性を保持したまま増殖した。以上より、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上で、ヒトｉＰＳ細胞を長期培養できることが示された。
実施例６　ヒトｉＰＳ細胞の長期培養（ＤＥＦ－ＣＳゼノフリー培地）
　動物やヒト由来の成分を含まない培地、すなわちゼノフリー培地中でも、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できるかどうかを調べた。
　全長フィブロネクチン又はＦＣＨ－２９６をそれぞれＤ－ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。また、ＤＥＦ－ＣＳゼノフリー培地（タカラバイオ社製）で推奨されているＳｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）　ＩＩ－ＳＣ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（コーニング社製）を使用し、コーティングを実施した。
　ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ－ＣＳゼノフリー培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換するとともに、３～４日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図３に示す。培養開始後３５日目（１０継代目）に、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。その結果を表４に示す。ＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ４は、多能性幹細胞マーカーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上では、フィブロネクチン又はＳｙｎｔｈｅｍａｘでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞は多能性を保持したまま増殖した。以上より、ＤＥＦ－ＣＳゼノフリー培地中でも、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できることが示された。
実施例７　ヒトｉＰＳ細胞の長期培養（ＴｅＳＲ－Ｅ８培地）
　ＴｅＳＲ－Ｅ８培地は、ヒトｉＰＳ／ＥＳ細胞の維持に必要な最低限の８要素だけを含むゼノフリー培地である。ＴｅＳＲ－Ｅ８培地中でも、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できるかどうかを調べた。
　全長フィブロネクチン又はＦＣＨ－２９６をそれぞれＤ－ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。また、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で推奨されているＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ　ＸＦ（コーニング社製）を使用し、コーティングを実施した。
　ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＴｅＳＲ－Ｅ８培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換するとともに、３～４日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図４に示す。培養開始後２７日目（７継代目）に、ＴＲＡ－１－６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定した。その結果を表５に示す。ＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ４は、多能性幹細胞マーカーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上では、フィブロネクチン又はＶｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞は多能性を保持したまま増殖した。以上より、ＴｅＳＲ－Ｅ８培地中でも、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でヒトｉＰＳ細胞を長期培養できることが示された。
実施例８　ヒト神経幹細胞の長期培養
　ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でヒト神経幹細胞を長期培養できるかどうかを調べた。
　ＦＣＨ－２９６をＤ－ＰＢＳに溶解し、３０μｇ／ｍｌのコーティング溶液を調製した。このコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で１２　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。また、ＲＨＢ－Ａ培地（タカラバイオ社製）で推奨されているＬａｍｉｎｉｎ（ｇｉｂｃｏ社製、１０μｇ／ｍｌ）を使用し、コーティングを実施した。ヒト神経幹細胞を、１．５～２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで上記のコーティングしたプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日から培地を２日毎に交換するとともに、４～８日毎に細胞を継代した。細胞増殖の結果を図５に示す。
　また、培養開始後２８日目（５継代目）に、神経幹細胞マーカーであるＮｅｓｔｉｎの発現を免疫染色にて確認したところ、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でも、Ｌａｍｉｎｉｎでコートされたプレートと同様に、細胞はＮｅｓｔｉｎの発現を保持していた。以上より、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上で、ヒト神経幹細胞を長期培養できることが示された。
実施例９　ヒトｉＰＳ細胞のシングルセルクローニング
　全長フィブロネクチン又はＦＣＨ－２９６をそれぞれＤ－ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で９６　ｗｅｌｌ　Ｈａｌｆ　ａｒｅａ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）のコーティングを実施した。
　ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ－ＣＳ培地で懸濁した後、１ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌでプレートに播種し、２日後から培地を２日毎に交換した。１０日目に得られたコロニーの出現率を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上でも、フィブロネクチンでコートされたプレートと同様に、ヒトｉＰＳ細胞のシングルセル由来のコロニーを取得することができた。また、一部のコロニーを継代、拡大培養し、１６日目にＴＲＡ－１－６０陽性細胞率及びＳＳＥＡ４陽性細胞率をフローサイトメトリーにて測定したところ、すべて９０％以上であった。以上より、ＦＣＨ－２９６でコートされたプレート上で、ヒトｉＰＳ細胞のシングルセルクローニングが可能であることが示された。
実施例１０　ヒトｉＰＳ細胞に対する接着性の評価（Ｆ１ＣＨ－２９６、Ｆ２ＣＨ－２９６、Ｆ３ＣＨ－２９６）
　ＩＩＩ－１、ＩＩＩ－２、ＩＩＩ－３のうち、どのリピートが重要であるかを調べるために、図６に示すような、３種のポリペプチド（Ｆ１ＣＨ－２９６、Ｆ２ＣＨ－２９６、及びＦ３ＣＨ－２９６）を調製した。すなわち、実施例１と同様の操作で、Ｎ末にメチオニン残基及び６個のヒスチジン残基から成るＨｉｓ－ｔａｇを有する、Ｆ１ＣＨ－２９６（配列番号２６）、Ｆ２ＣＨ－２９６（配列番号２７）、及びＦ３ＣＨ－２９６（配列番号２８）を調製した。
　全長フィブロネクチン、ＣＨ－２９６、ＦＣＨ－２９６、Ｆ１ＣＨ－２９６、Ｆ２ＣＨ－２９６又はＦ３ＣＨ－２９６をそれぞれＤ－ＰＢＳに溶解し、各濃度のコーティング溶液を調製した。これらのコーティング溶液を使用し、実施例３と同様の操作で２４　ｗｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｐｌａｔｅのコーティングを実施した。なお、５０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンは約２００ｎＭであり、２０μｇ／ｍｌのＣＨ－２９６、３０μｇ／ｍｌのＦＣＨ－２９６、及び２４μｇ／ｍｌのＦ１ＣＨ－２９６は約３２０ｎＭである。
　ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株）をＤＥＦ－ＣＳ培地で懸濁した後、プレートに播種した。翌日から培地を毎日交換し、培養開始後３、６、８、１０日目に細胞を観察した。結果を表７に示す（細胞剥離なし：－、細胞剥離あり：＋）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　３種のポリペプチド（Ｆ１ＣＨ－２９６、Ｆ２ＣＨ－２９６、及びＦ３ＣＨ－２９６）は同様の傾向を示した。すなわち、例えば、２４μｇ／ｍｌの条件では８日目に細胞剥離が観察される。一方、ＣＨ－２９６では３日目に細胞剥離が観察され、ＦＣＨ－２９６では細胞剥離が観察されなかった。このことは、３種のポリペプチド（Ｆ１ＣＨ－２９６、Ｆ２ＣＨ－２９６、及びＦ３ＣＨ－２９６）の接着活性が、ＣＨ－２９６よりも高く、ＦＣＨ－２９６よりも低いことを示す。以上より、３つのＩＩＩ型リピート（ＩＩＩ－１、ＩＩＩ－２、ＩＩＩ－３）が同等の細胞接着性をもつこと、及び、３つのＩＩＩ型リピートをすべて含む場合に細胞接着活性が最も高くなることが示された。
実施例１１　様々なＮ末配列をもつＦＣＨ－２９６の評価
　様々なＮ末配列をもつＦＣＨ－２９６を調製した。すなわち、Ｎ末９アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号２９）、Ｎ末６アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３０）、Ｎ末５アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３１）、Ｎ末３アミノ酸欠損のＦＣＨ－２９６（配列番号３２）、ＦＣＨ－２９６（配列番号１９）、Ｎ末３アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３３）、Ｎ末６アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３４）、Ｎ末９アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３５）、Ｎ末１１アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３６）、Ｎ末１２アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３７）、Ｎ末１４アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３８）、Ｎ末１５アミノ酸挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号３９）、Ｎ末ＨＫＲＨＥＥＧＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４０）、Ｎ末ＨＫＲＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４１）、Ｎ末ＨＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４２）、及びＮ末ＨＨＨ挿入のＦＣＨ－２９６（配列番号４３）を調製した。
　実施例５～９で使用したＦＣＨ－２９６（Ｈｉｓ－ｔａｇ付き、配列番号２１）に代えて、上記の様々なＮ末配列をもつＦＣＨ－２９６のいずれかを使用して、実施例５～９に記載された内容を実施する。様々なＮ末配列をもつＦＣＨ－２９６は、ＦＣＨ－２９６と同様の効果を有する。
　本発明により、短期間に大量の幹細胞を製造する方法及びその方法に使用するポリペプチドが提供される。
SEQ ID NO:1 ; Partial region of fibronectin named III-1
SEQ ID NO:2 ; Partial region of fibronectin named III-2
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SEQ ID NO:7 ; Partial region of fibronectin named III-7
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SEQ ID NO:15 ; Partial region of fibronectin named CS-1
SEQ ID NO:16 ; Fibronectin fragment named 120k-fr
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SEQ ID NO:20 ; Fibronectin fragment named DCH-296
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SEQ ID NO:22 ; His-tag DCH-296
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SEQ ID NO:26 ; His-tag F1CH-296
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SEQ ID NO:33 ; N-terminal 3a.a. insertion of FCH-296
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SEQ ID NO:42 ; N-terminal HH insertion of FCH-296
SEQ ID NO:43 ; N-terminal HHH insertion of FCH-296

Claims (15)

  1. 　幹細胞を、
    （ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
    （ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－８～１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－８～１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
    （ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１２～１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
    の存在下で培養する工程を包含する、幹細胞の製造方法。
  2. 　幹細胞を、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の組換えポリペプチドを同一分子内に含む組換えポリペプチドの存在下で培養する工程を包含する、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　（ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　組換えポリペプチドが、配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項３に記載の製造方法。
  5. 　組換えポリペプチドの存在下で幹細胞を培養する工程が、組換えポリペプチドがコートされた固相と幹細胞とが接触した状態で実施される、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　固相が、細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、請求項５に記載の製造方法。
  7. 　固相が、ディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、請求項５に記載の製造方法。
  8. 　幹細胞が、ヒト由来の多能性幹細胞又は神経幹細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　（ａ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～７から成る群より選択されるリピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
    （ｂ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－８～１０リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－８～１０リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、及び
    （ｃ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１２～１４リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１２～１４リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、
    を同一分子内に含む組換えポリペプチド。
  11. 　（ａ）の組換えポリペプチドが、ヒトフィブロネクチンのＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートを含む組換えポリペプチド、もしくは前記のＩＩＩ－１～３リピート又はＩＩＩ－４～６リピートのアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項１０に記載のポリペプチド。
  12. 　配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドであるか、あるいは配列番号１９又は２０に記載のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドである、請求項１０に記載の組換えポリペプチド。
  13. 　請求項１０～１２のいずれか１項に記載の組換えポリペプチドがコートされた固相。
  14. 　組換えポリペプチドがコートされた細胞培養用器材又は細胞培養用担体である、請求項１３に記載の固相。
  15. 　組換えポリペプチドがコートされたディッシュ、プレート、フラスコ、バッグ、ビーズ、メンブレン又はスライドガラスである、請求項１３に記載の固相。
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