JP2021187828A - 組換えフィブロネクチン変異体、その調整方法及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
組換えフィブロネクチン変異体は、そのヌクレオチド配列がSEQ ID NO.1に示す通りである。
ACGGGCATCGACTTCAGCGATATCACCGCGAACAGCTTCACCGTTCACTGGATCGCGCCACGTGCGACGATCACCGGCTATCGCATCCGCCATCACCCGGAACACTTTAGCGGTCGTCCACGCGAAGATCGCGTTCCGCATAGCCGCAATAGCATCACGCTGACCAATCTGACCCCGGGCACCGAATATGTTGTGAGCATCGTGGCGCTGAACGGCCGCGAAGAAAGCCCACTGCTGATTGGCCAGCAGAGCACCGTGAGTGATGGTGGCGGTGGCAGCAATATTGATCGCCCGAAAGGTCTGGCCTTCACGGATGTGGACGTGGACAGCATCAAAATCGCGTGGGAAAGCCCACAAGGCCAAGTTAGCCGCTACCGCGTGACCTATAGCAGCCCGGAAGATGGCATCCACGAACTGTTTCCGGCGCCGGATGGTGAAGAAGATACCGCGGAACTGCAAGGTCTGCGTCCGGGCAGCGAATACACGGTTAGCGTGGTGGCGCTACATGATGATATGGAAAGCCAGCCGCTAATAGGCACACAAAGCACAGCG(SEQ ID NO.1)。
ACGGGCATCGACTTCAGCGATATCACCGCGAACAGCTTCACCGTTCACTGGATCGCGCCACGTGCGACGATCACCGGCTATCGCATCCGCCATCACCCGGAACACTTTAGCGGTCGTCCACGCGAAGATCGCGTTCCGCATAGCCGCAATAGCATCACGCTGACCAATCTGACCCCGGGCACCGAATATGTTGTGAGCATCGTGGCGCTGAACGGCCGCGAAGAAAGCCCACTGCTGATTGGCCAGCAGAGCACCGTGAGTGATGGTGGCGGTGGCAGCAATATTGATCGCCCGAAAGGTCTGGCCTTCACGGATGTGGACGTGGACAGCATCAAAATCGCGTGGGAAAGCCCACAAGGCCAAGTTAGCCGCTACCGCGTGACCTATAGCAGCCCGGAAGATGGCATCCACGAACTGTTTCCGGCGCCGGATGGTGAAGAAGATACCGCGGAACTGCAAGGTCTGCGTCCGGGCAGCGAATACACGGTTAGCGTGGTGGCGCTGCATGATGATATGGAAAGCCAGCCGCTGATCGGCACCCAAAGCACCGCG(SEQ ID NO.2);
TGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDGGGGSNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTA(SEQ ID NO.3)。
(1)本発明に係る組換えフィブロネクチン変異体は、細胞増殖活性を効果的に促進し、細胞接着活性を向上させることができる。
(2)本発明に係る組換えフィブロネクチン変異体は、調製過程が簡単であり、精製が容易である。
(3)本発明に係る組換えフィブロネクチンは、新型組換えタンパク質変異体であり、変異体を得る新しい方法を提供する。
生物学的高分子シミュレーションを通じて細胞増殖及び接着を促進するフィブロネクチンの機能ドメインを選択し、新しいフィブロネクチン変異体を設計した。大腸菌のコドンの好み及び翻訳一時停止理論に従って、フィブロネクチン変異体のヌクレオチド配列を最適化した。そして、蘇州泓迅生物科技股フン有限公司に全遺伝子からフィブロネクチン変異体DNAを合成するよう依頼した。
ACGGGCATCGACTTCAGCGATATCACCGCGAACAGCTTCACCGTTCACTGGATCGCGCCACGTGCGACGATCACCGGCTATCGCATCCGCCATCACCCGGAACACTTTAGCGGTCGTCCACGCGAAGATCGCGTTCCGCATAGCCGCAATAGCATCACGCTGACCAATCTGACCCCGGGCACCGAATATGTTGTGAGCATCGTGGCGCTGAACGGCCGCGAAGAAAGCCCACTGCTGATTGGCCAGCAGAGCACCGTGAGTGATGGTGGCGGTGGCAGCAATATTGATCGCCCGAAAGGTCTGGCCTTCACGGATGTGGACGTGGACAGCATCAAAATCGCGTGGGAAAGCCCACAAGGCCAAGTTAGCCGCTACCGCGTGACCTATAGCAGCCCGGAAGATGGCATCCACGAACTGTTTCCGGCGCCGGATGGTGAAGAAGATACCGCGGAACTGCAAGGTCTGCGTCCGGGCAGCGAATACACGGTTAGCGTGGTGGCGCTGCATGATGATATGGAAAGCCAGCCGCTGATCGGCACCCAAAGCACCGCG。
ACGGGCATCGACTTCAGCGATATCACCGCGAACAGCTTCACCGTTCACTGGATCGCGCCACGTGCGACGATCACCGGCTATCGCATCCGCCATCACCCGGAACACTTTAGCGGTCGTCCACGCGAAGATCGCGTTCCGCATAGCCGCAATAGCATCACGCTGACCAATCTGACCCCGGGCACCGAATATGTTGTGAGCATCGTGGCGCTGAACGGCCGCGAAGAAAGCCCACTGCTGATTGGCCAGCAGAGCACCGTGAGTGATGGTGGCGGTGGCAGCAATATTGATCGCCCGAAAGGTCTGGCCTTCACGGATGTGGACGTGGACAGCATCAAAATCGCGTGGGAAAGCCCACAAGGCCAAGTTAGCCGCTACCGCGTGACCTATAGCAGCCCGGAAGATGGCATCCACGAACTGTTTCCGGCGCCGGATGGTGAAGAAGATACCGCGGAACTGCAAGGTCTGCGTCCGGGCAGCGAATACACGGTTAGCGTGGTGGCGCTACATGATGATATGGAAAGCCAGCCGCTAATAGGCACACAAAGCACAGCG。
TGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDGGGGSNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIHELFPAPDGEEDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGTQSTA。
(1)フィブロネクチンの発現菌株の調製
前記フィブロネクチンの発現菌株の調製過程は以下の通りである。
(1−1)大腸菌BL21(DE3)コンピテントセルの調製:調製過程の詳細は、『分子クローニング実験ガイドライン』第3版([米国]J.Sambrook著、黄培堂訳)に記載されている。
(1−2)発現担体pET−28a−Fibronectinを大腸菌BL21(DE3)コンピテントセルへの転換する:転換過程の詳細は、『分子クローニング実験ガイドライン』第3版([米国]J.Sambrook著、黄培堂訳)に記載されている。
具体的な操作過程は以下の通りである。
ステップ(1)で得られた発現菌株pET−28a−Fibronectinをカナマイシンの含有量が50μg/mLのLB培地10mLに接種し、37℃、180rpmで培養し、OD600=0.8であるときにIPTGを加え、最終濃度が1mM、37℃で4時間発現を誘導した後、5000g、4℃で10分間遠心分離して菌体を回収した。菌体をTris−HCl(pH8.0,0.15mol/LNaCl)緩衝液20mmol/Lに再懸濁し、高圧(800bar)で細胞を均一に破砕し、18000×g、4℃で30分間遠心分離し、上清及び沈殿物は、別々に後続きのSDS−PAGE電気泳動(5%濃縮ゲル、12%分離ゲル)及びWestern blot分析のためにサンプルを保留した。
ステップ(1)で得られたフィブロネクチン変異体の発現菌株をカナマイシンの含有量が50μg/mLのLB培地1Lにそれぞれ接種し、前記発現条件で振とうフラスコで発酵して誘導した。4℃、6000×gで10分間遠心分離して菌体を回収してから、菌体の沈殿物をNTA−10緩衝液に1:10の体積比で再懸濁し、高圧(1000bar)で細胞を均一に破砕した。4℃、25000×gで30分間遠心分離して上清を回収した。
ステップ(2)で得られたフィブロネクチンの発現菌体を高圧で均一に破砕して遠心分離して沈殿物を得て、さらに以下のステップを実行した。
(4−1)封入体を0.4%のデオキシコール酸ナトリウムで洗浄し、10000rpm、4℃で遠心分離し、遠心沈殿物を得た。
(4−2)沈殿物を8M尿素含有NTA−0緩衝液に溶解し、10000rpm、4℃で遠心分離し、溶解上清を得た。
(4−3)溶解上清をベッドボリュームが20mLのNi−NTAアフィニティークロマトグラフィーカラムに加え、流速0.6mL/minで、ベースラインに戻るように8M尿素含有NTA−0緩衝液で洗浄し、流速1mL/minで、8M尿素含有NTA−40緩衝液で不純物タンパク質を洗浄した。
(4−4)次に、カラム上のその場でのリフォールディング(refolding)方法によって封入体タンパク質をリフォールディングし、最後にNTA−250緩衝液で目的タンパク質を溶出し、精製されたフィブロネクチン変異体のタンパク質をSephadex G−25分子篩でイミダゾールを溶出し、精製されたフィブロネクチン変異体の純度をSDS−PAGE電気泳動により評定した。
具体的な測定過程は以下の通りである。
(1)BALB/c 3T3細胞を96ウェル細胞培養プレート(5000個細胞/ウェル)に接種し、37℃、5%のCO2細胞インキュベーターで24時間培養した。
(2)DMEM無血清培地に変更し、12時間培養し続けた。
(3)組換えフィブロネクチン変異体(可溶性で発現される精製成分、封入体で発現される精製成分)及びPBS(陰性対照群)をそれぞれ加え、48〜72時間培養し続けた。
(4)各ウェルにCCK−8試薬10μLを加え、37℃、5%のCO2細胞インキュベーターで2時間インキュベートした後、取り出した。
(5)マイクロプレートリーダーを用いて、96ウェルプレートの450nm及び630nmでの吸光値を読み取り、630nmを参照波長として、450nmでの吸光度を測定し、測定結果を記録した。
相対細胞増殖促進率=(実験群450nmでの吸光値−陰性対照群450nmでの吸光値)/陰性対照群450nmでの吸光値×100%。
前記細胞接着活性の測定の具体的な過程は以下の通りである。
(1)組換えフィブロネクチン変異体のタンパク質溶液の濃度は20μg/mlであり、96ウェル細胞培養プレートの各ウェルにサンプル溶液50μLを加え、37℃で2時間静置し、対照ウェルにPBS50μLを加えた。
(2)BALB/ 3T3細胞をトリプシン消化し、カウントし、各ウェルに5×104個の細胞を加え、37℃、CO2インキュベーターで2時間培養した。
(3)PBSで3回洗浄し、接着していない細胞を取り除いた後、DMEM培地200μLを加えた。
(4)各ウェルにCCK−8試薬10μLを加え、37℃、5%のCO2細胞インキュベーターで2時間インキュベートした後、取り出した。
(5)マイクロプレートリーダーを用いて、96ウェルプレートの450nm及び630nmでの吸光値を読み取り、630nmを参照波長として、450nmでの吸光度を測定し、測定結果を記録した。
(6)細胞接着促進率=(実験群450nmでの吸光値−陰性対照群450nmでの吸光値)/陰性対照群450nmでの吸光値×100%。
Claims (8)
- ヌクレオチド配列はSEQ ID NO.1に示す通りである、ことを特徴とする組換えフィブロネクチン変異体。
- 可溶性の形態で発現される、ことを特徴とする請求項1に記載の組換えフィブロネクチン変異体。
- フィブロネクチン変異体を翻訳一時停止して最適化することで得られる、ことを特徴とする請求項1に記載の組換えフィブロネクチン変異体。
- 前記フィブロネクチン変異体のヌクレオチド配列はSEQ ID NO.2に示す通りである、ことを特徴とする請求項3に記載の組換えフィブロネクチン変異体。
- 前記翻訳一時停止して最適化する過程は、フィブロネクチン変異体の最後の20コドンのうちの翻訳速度の速いコドンを翻訳速度の遅いコドンに置き換えることである、ことを特徴とする請求項3に記載の組換えフィブロネクチン変異体。
- 前記翻訳速度の速いコドンはATC、ACC、CTGを含み、前記翻訳速度の遅いコドンはATA、ACA、CTAを含み、翻訳一時停止サイトを作成するソフトウェアにより計算して決定される、ことを特徴とする請求項5に記載の組換えフィブロネクチン変異体。
- 前記ヌクレオチド配列がコードするアミノ酸配列はSEQ ID NO.3に示す通りである、ことを特徴とする請求項1又は4に記載の組換えフィブロネクチン変異体。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換えフィブロネクチン変異体の細胞増殖活性、接着活性の促進における使用。
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