JPH02502825A - 好中球活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 好中球活性化因子 この発明は、免疫調節物質に関するものである。

さらに詳しくは、この発明は、ヒト中性好性白血球を活性化し得る免疫刺激因子 に関するものである。前記因子については、以後、好中球活性化因子（ＮＡ、Ｆ ）と称する。

１、背景 中性好性白血球（好中球）は、最も多く存在する白血球であり、ヒト血液におけ る白血球の約２／３を占める。それらは、微生物感染から宿主生物を防御すると いう一つの主機能を有する。好中球は移動性であり、感染後に生ずる走化性刺激 に反応を示し、感染組織中へ移動することにより微生物を殺すことができる。こ の殺微生物作用は、微生物を包み込み、酸素ラジカルおよび殺菌酵素を放出する という好中球の能力に依るものである（Ｂ、Ｍ、ベイバー、［二５−・イングラ ンド・ジャーナル・オン・メデイシン」ｚｓｇｒｔｃ＋７８］６５９−６６８お よびＭ、バッジ才す一二、「エクスベリエンチア」旦［１９８４二９０６−９０ ９）。それらの生成物の放出は、好中球の活性化によるものである。すなわち、 この明細書に記載されている好中球活性化因子のような物質を用いることにより 、好中球の活性化、従って、人体の抗菌防御機構を高めることができる。

ヒト単核白血球は、ヒト好中球においてエキソサイトーンスおよび呼吸バースト （酸素基形成および酵素放出）を誘発、すなわち抗菌作用において重要な好中球 活性化特性を示す因子を分泌することが見出された。

この因子は刺激されたヒト単核白血球の培養液から得られ、５ＤＳ−ゲル電気泳 動において約６０００、より正確には約６５００の見かけ上の分子量を有する。

単核白血球は、好中球と類似した食細胞である。しかしながら、好中球とは反対 に、単核白血球は寿命が長い。それらは、血液から、それらかマクロファージに 形質転換し得る全ての組織部位に移動する。ま１こ単核白血球からマクロファー ジへの形質転換は、細胞培養実験において観察され得る。組織におけるマクロフ ァージは、様々な機能、主に好ましくない物質の食作用並びに分泌される非常に 多様なペプチドおよび蛋白質の生産機能を有する。マクロファージは持続的感染 部位に集まり、これらの部位においては、これらの細胞がＮＡＰを産生ずること により、好中球の宿主防＠能が高められ、病態生理学的に適切な機能が発現され 得る。

ＮＡＦは、その好中球活性化特性、すなわち酸素ラジカルの生成を伴ういわゆる 呼吸バーストの誘発および酵素放出の誘発を特徴とする。分子という点からみる と、ＮＡＦは次に述べる性質を特徴とする。すなわち、５ＤＳ−ゲル電気泳動に おける見かけ上の分子量が約６５００であり、等電点が約８．６であり、耐熱性 が８０℃であり、若干の変性因子については耐性を示すが、プロテアーゼに対し ては感受性を示す。これはＮＡＦがポリペプチドであることを示唆している。ヒ ト好中球に対するＮＡＦの作用は、２種の公知走化性刺激剤、アナフィラトキシ ン０５ａおよび細菌性ペプチドのＮ−ホルミル−し−メチオニル−し−ロイシル −し−フェニルアラニン（ｆＭ　Ｌ　Ｐ　）の作用と類似しているが、ＮＡＦか 結合し、ヒト好中球の公知アゴニストの受容体とは異なる表面受容体により仲介 される。

ＮＡＰは、ヒトリンパ球ではなく、ヒト単核白血球により培養生産される。この 生産は、刺激物質、例えば細菌性リボ多糖類（ＬＰＳ）、フィトヘマグルチニン （ＰＨＡ）またはコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の存在並びに刺激物質濃度およ びインキュベーション時間により異なる。前記生産はシクロへキシミドにより阻 害されるため、新たに蛋白質の合成が要求されることを示している。

既に示した通り、単核白血球およびマクロファージは、多様な生物活性ペプチド および蛋白質の豊富な供給源である（Ｃ，Ｆ、ネイサン、「ジャーナル・オン・ クリニカル・インベスティゲーション」７９［１９８７３３１９−３２６）、そ れらは、３種の異なるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、インターロイキン１ （ＩＬ−１）、腫よう壊死因子（ＴＮＦ）およびインターフェロン−アルファ（ Ｉ　ＦＮ−α）の生産体として同定されている。また単核白血球およびマクロフ ァージが、前述のものと（ｊ異なる好中球に対して作用する因子を生産すること を示す幾つかの報告が公表されている。それらは好中球に対して活性を示すため 、これらの因子についてはある程度詳細に後述する。

肺胞マクロファージが、好中球に対して走化性であり（Ｊ、Ａ、カスミ二ロフス キー等、「ジャーナル・オン・クリニカル・インベステイゲーションＪ５９［１ ９７７コ２７３−２８１、Ｗ、Ｗ、メリル等、「ジャーナル・オン・クリニカル ・インベステイゲーションｊ６５［１９８０コ２６ｇ−２７０およびｃ、ｗ、ハ ニンゲイク等、「ジャーナル・オン・クリニカル・インベステイゲーションＪ６ ６［１９８０］４７３−４８３）、肺において抗菌性防御を促進し得る因子を放 出することが様々な出版物において報告された。その後、これらの因子は好中球 の抗菌活性を高めることが示された（Ｊ、Ｅ、ベニントン等、「ジャーナル・オ ン・インフェクシャス・ディシーズｊ　１４８［１９８３］１０１−１０９およ び［ジャーナル・オン・クリニカル・インベスティゲーションＪ　７５［１９８ ５］１２３０−１２３７）。

ゲルろ過およびクロマトフオーカシング精製を行うことにより、肺胞マクロファ ージにより生産され、分子量が６０００および等電点が７．６であるプロテアー ゼ感受性因子（ＮＡＦと称す）が同定された。この因子は走化性が弱く、好中球 により食さね−細菌の殺菌性を高めるが、それ自体は酸素基生成も酵素放出も誘 導しないことが報告された。高い抗菌活性の似た機構は他の研究者により報告さ れており（Ａ、フェランテ等、「クリニカル・アンド・エクスベリメンタル・イ ムノロジー４５６［１９８４３５５９−５６６）、それによると、ヒト好中球が ネイグレリア・フォウレリの殺菌作用を誘導するためには、単核白血球またはマ クロファージ由来の培養培地の添加を必要とすることが示された。ＬＰＳ−刺激 ヒト単核白血球により生産されるか粒球活性化伝達物質（ＧＲＡＭ）は、他の研 究者（Ａ。

キャップ等、「ジャーナル・オン・インベスティゲイティブ・ダーマトロジー」 ｌ旦Ｅｌ　９８６′１５２３−５２８およびＦ、Ｅ、マリ−等、「リンホカイン ・リサーチｊ５［１９８６コ２ｌ−３３）により報告された。２種のＧ　ＲＡ　 Ｍが記載され、大きい方は見かけ上の分子量が６００００であり、小さい方は見 かけ上の分子量が１００００であり、化学光が示すところでは、ヒト好中球にお いて遅い呼吸バースト応答を誘発するものであった。これらの因子は熱およびト リプシンに敏感であり、それらの生産は、ＬＰＳによる単核白血球の刺激および 、明らかに、新たな蛋白質合成に依存している。

幾つかの報告は、好中球に対する走化活性を有する単核白血球および／またはマ クロファージに由来する因子を記載している。「単核細胞由来ケモタキシンｊ（ ＭＯＣ）と称する因子で、明らかにＧＲＡＭとは異なる分子量１００００のペプ チドが報告された（Ｅ、コブナラキー等、「クリニカル・アンド・エクスベリメ ンタル・イムノロジー」旦土［１９８６］２１４−２２２）。また、ＬＰＳによ り刺激されたヒト血液単核白血球により生産される、分子量約１００００で等電 点８−８．５の好中球走化性因子が知られていた（Ｔ、吉村等、「ジャーナル・ オン・イムノロジー４１３９［１９８７ｊ７８８−７９３）。最後にまた、ＬＰ Ｓにより培養中で刺激されたうさぎ腹膜マクロファージは選択的好中球走化性因 子を放出することが報告された（Ｆ、Ｑ、クーチ等、「ジャーナル・オン・メデ ィカル・アンド・バイオロジカル・リサーチ」１９［１９８６］７７５−７７７ および「ヨーロピアン・ジャーナル・オプ・ファーマコロジー」上２９［１９８ ６コ６５−７６）。

これらの報告に含まれる生化学情報は予備的な性質であるため、記載されている 様々な因子間の構造類似性および相異に関して推測することは不可能である。

この発明に関する優先権主張日（複数もあり得る）の後に、Ｎ　Ａ　Ｆに対応す ると思われるペプチドの精製法が、パン・デイム等により報告され（Ｊ、パン・ デイム等、「ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メディシン」上ｌ二Ｊ１ ９８８コ１３６４−１３７６）、レクチン刺激ヒトリンパ球の上清から精製され たペプチドに関してＮＡＦの配列と同一の配列が、グレゴリ−等により報告され た（Ｈ。

グレゴリ−等、「バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ ュニケーションズＪｌ　５　Ｎ１９８８コ８９３−８９０）。

ＭＤＮＣＦをコードするｃＤ　Ｎ　Ａ　（Ｔ　、吉村等、「プロシーディングズ ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイユンシーズ・オン・ザ・ユナ イテッド・ステーブ・オン・アメリカＪ８４［１９８−ナル・オン・エクスベリ メンタル・メディンンｊ１６７「１９８８］１８８３−１８９３）、３−１０Ｃ ｃＤＮＡに相当することが見出された（Ｊ、シュミットおよびＣ，バイスマン、 「ジャーナル・オン・イムノロジー」Ｌ影９［１９８７３２５０−２５６）。シ ュミットおよびバイスマンは、３−１０ＣｃＤＮＡによりコードされたペプチド が、血小板第４因子、ベータートロンボグロブリン、結合組織活性化ペプチドＩ ［１（ＣＴＡＰ−ＩＬＩ）およびインターフェロン−ガンマ−誘導ペプチド（ガ ンマ−Ｉ　Ｐ−１０）との構造相同性を有することを示した。これらの分子はま た、メラノーマ成長刺激特性を有する７３−残基ペプチド（ＭＧＳＡ）と相同性 を示しくＡ、リッチモンド等、ＥＭＢＯジャー’ｒル、ビル１９８８コ２０２５ −２０３３）、その配列は、線維芽細胞から分離されたｇｒｏ　　ｃＤ　Ｎ　Ａ から誘導された配列と近似している（Ａ、アニソビッツ等、［プロシーディング ズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユ ナイテッド・ステープ・オン・アメリカＪ８４［１９８７］７１８８−７１９２ ）。また、上記蛋白質と関連性を有し得るねずみマクロファージ由来の炎症性蛋 白質（ＶＩＰ）が報告された（Ｇ。

ダバテリス等、「ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メディシン」−リビ ーｒ１９８８］１９３９−１９４４）。これは、ＲＡＳＹＥＳ、すなわちＩＬ− ２依存性の抗原刺激ヒトＴａ１Ｆ＆クローンがら単離さｅにｅＤＮＡの８ｋｄ生 成物を含むペプチドの種類の一員であると思われる（Ｔ、Ｊ、シャール等、１ジ ヤーナル・オン・イムノロジー」±土工ｒ１９８８］１０１８−１０２９）。こ れらのペプチドの機能は概ね未知である。ＭＧＳＡおよびＣＴＡＰ−Ｉ［１（Ｃ ，Ｗ、カスター等、「プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ− ・オン・サイエンシーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステープ・オン・アメリカ 、Ｊ８０［１９８３コア６５−７６９）は、細胞分裂促進性であることが報告さ れ、血小板第４因子は、免疫調節作用を有することが示された（Ａ、Ｄ、バロン 等、「ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー４２６３［１９８８コ ８７１０−８７１５）。

得られた結果は、ＮＡＦが、走化性アゴニストにより開始される場合と似た受容 体仲介プロセスにより好中球を選択的に活性化することを示唆している。

２、発明の要旨 この発明のＮＡＦは、先に述べた全ての受容体とは異なる選択的受容体を介して 作用することによりヒト好中球において酸素基形成および酵素放出を誘発するこ とが見出された。

ＬＰＳ刺激ヒト単核白血球から精製されたＮ、ＡＦの総アミノ酸配列を決定し、 主なＮＡＦ種をコードする遺伝子を合成し、その天然相同体と同し好中球活性化 特性を有する組換えペプチドとして発現させた。

すなわち、この発明は、ＮＡＦおよび天然供給源、例えばヒト単核白血球からの その分離に関するものである。

まにこの発明は、合成、特に組換えＮ　Ａ　Ｆ並びにその製造および発現に関す るものである。

３、詳細な言己載 公知配列決定方法により、ＮＡＦの完全なアミノ酸配列を決定し５ｅｒ−Ａｌａ −Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｘ　１ｅ−Ｌｙ ｓ−Ｔｈｒ−Ｔ）ｒｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐ窒潤| Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−ＡｓｐＪｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−丁ｒｐＪｍ ｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−１’ｈ＠−Ｌｅｕ−Ｌ ｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−５ｉｒ　−ＳＨメチル化およびアミノ −スクシニル化ＮＡＦの脱離後に得られた完全蛋白質並びに定型的フラグメント Ｔ７−２６およびＴ２７−４７のエドマン分解により、４７位までの配列が得ら れた。７５％ぎ酸による加水分解およびエドマン分解後、２ｏアミノ酸から成る ２つのほぼ等モルの配列、次いで２０位を越えるＮＡＦのアミノ末端配列に対応 する単一パターンが得られた。カルボキシ末端ペプチド、Ａ　５３−７２の配列 を消去法により決定し、定型的ペプチドＴ６１−７２の分析により確認した。カ ルボキシペプチダーゼＡおよびＢは検出可能な開裂生成物を生じないが、カルボ キシペプチダーゼＹにより１ナノモルＮＡＦを処理した後、１２０ピコモルのせ リンが放出され、これはカルボキシ末端としてのセリンを示している。

ＮＡＰの様々なバッチの分析により、何等かのアミノ末端異種性が示された。４ ｇ起列は主たる成分に関するものであり（約７０％）、これが生物活性に太き（ 関与していると信じられる。さらに３種の変異型を同定することができた。

配列ｌ（約１７％）： すなわち、上記完全配列において、Ｎ−末端をさらにＡｌａ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ− Ｐｒｏ−Ａｒｇ−により延長した（すなわち完全蛋白質は７７アミノ酸を有する ）。

配列２（約８％）： 、　　Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｃ）ｒｓ−１１ｅ− Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−ＬｙｓＪｒｏＪｂｅ−！撃Pｓ− Ｐｒｏ−ＬｙｓＪｈ＠−１１＠−Ｌｙｊ−Ｇｌｕ−ＩＪｕ−＾ｒｇ−Ｖａｌ−１ １句−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−！’ｒｏ−すなわち、上記完全配列において、 Ｎ−末端から５ｅｒ−Ａｌａ−を省くことにより短縮した（すなわち完全蛋白質 は７０アミノ酸を有する）。

配列３（約５％）： にｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−ＸｌトＬｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔ ｙｒ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−ＰｒｏＪｈｅ−Ｅ！Ｌｓ−Ｐｒｏ−すなわち、上記完全 配列において、Ｎ−末端から５ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−を省くことにより短縮し た（すなわち完全蛋白質は６９アミノ酸を有する） これらの配列は全て、９９アミノ酸から成る３−１０ＣｃＤＮＡから予測された 配列に対して一直線に合致し得る（Ｊ、シニミツアミノ酸配列の２８〜９９位に 対応するが、上記３種の変異型は、その２３位（配列ｌ）、３０位（配列２）お よび３１位（配列３）から始まる配列に対応する。

上記配列データにより３−ｔｉｃ　　ｃＤＮＡか、ら誘導された配列を比較する と、単核食細胞は、細胞内生成されるＮＡＦの前駆体を合成することが示される 。７７残基ペプチドは、それがｃＤＮＡ誘導配列から２２アミノ酸を有する予測 されたシグナルペプチドを除いた配列に相当するため、ＮＡＦの最大分泌形態を 表し得る。主１こる７２残基ＮＡＰ種並びに７０および６９残基を有する類似体 は、さらに翻訳後修飾から形成され得る。

ＮＡＦの全形態は、メルカプトエタノールが阻害性であることが見出されたこと から活性に重要であると思われる縦向ジスルフィド橋を形成することが予想され る４つのシスティン残基を有する（Ｐ。

ペベーり等、「ジャーナル・オン・エクスペリメンタル・メディシンＪｌ　６７ ［１９８８１１５４７−１５６０）。ジスルフィド橋は、部分的にＮＡＦと相同 性であるベータートロンボグロブリンおよび血小板第４因子の場合と同様、７− ３４位および９−５０位を結合すると思われる。

β−トロンボグロブリンとの相同性に従うと、ＮＡＦは２つの分子内ジスルフィ ド橋を有する。従って、算出された分子量は、５ＤＳ−電気泳動による見かけ上 の分子量よりも明らかに高い８３８４゜７である。

天然供給源、例えばヒト単核白血球からのＮＡＦの製造は収率が悪いため、大規 模で複雑を精製工程が必要である。

さらに優れた収率で大量にＮＡＦを製造するためには、合成方法、例えば完全化 学合成または組換えＤＮＡ技法が適している。また、原核生物または真核生物発 現系、例えばエシェリヒア・コリにおける発現を含む、例えば組換えＤＮＡ方法 による合成ＮＡＰの製造はこの発明の一部である。また、合成ＮＡＦ、すなわち 合成方法、例えば組換えＤＮＡ方法により製造されたＮＡＦは、この発明の一部 である。合成ＮＡＦ、例えば細菌から単離された組換えＮＡＦは、天然ＮＡＦと 同じアミノ酸配列（複数も可）並びに同じ生物学的特性および活性を有する。Ｆ 組換えＮＡＰｊは、組換えＤＮＡ技法により得られたｐζＡＦを意味する。

組換えＤＮＡ方法によるＮＡＦの製造は、公知手順に従い、すなわち対応するオ リゴヌクレオチドの合成、精製および結合、合成ＮＡＦ遺伝子のクローニング、 例えばエシェリヒア・コリにおける発現、最後に組換えＮＡＦの回収および精製 （こより行なわれる。例えば、７２アミノ酸ＮＡＦをコードする遺伝子を、好ま しくはコドンを最大限に活用して合成し、次いでクローニングし、エシェリヒア ・コリにおいて発現させる。

天然ＮＡＦに対して生じた抗血清を用いる粗細菌抽出物のウェスタン・プロット 分析は、天然ＮＡＦと共に移動する単一バンドを示す。均質に精製された組換え ＮＡＦは、７２アミノ酸天然ＮＡＦと同一のアミノおよびカルボキシ末端配列を 有する。ヒト好中球に関して試験した場合、それは、化学走性、細胞質ゾル遊離 Ｃａ”＋の急速な上昇、呼吸バーストの活性化並びに特異か粒およびアズール好 性か粒内召物の放出の誘導において天然ＮＡＦと同じ活性および効力を有するこ とが見出された。

第１３図は、合成ＮＡＦ遺伝子の設計を示す。エシェリヒア・コリでの発現を容 易にするための３−１０ＣｃＤＮＡのコード配列における改変は明白である６３ ゛−末端において、天然ターミネータ−ＴＡＡをトリプル・ターミネータ−ＴＡ ＡＴＡＡＴＧＡと置換し、ＢａｍＨＩ部位をすぐ下流に加える。５ニー末端にお いて、５ｐｈＩおよびＣｌａＩ部位を加えることにより、各々クローニングおよ び発現ベクター−の挿入を可能にする。塩基３４では、ＡｒｇコドンをＡＧＡか ９ＣＧＡに変えることにより、ＴａＱ１制限部位を後の５゛−末端操作のために 作成する。

ブロック的アニーリング（オリゴヌクレオチド１−２．３−４および５−６）は 、６つのオリゴヌクレオチド全部の同時ライゲーションに有利な点をもたない。

全オリゴヌクレオチドの５°−ホスホリル（燐酸）化の結果、予想されたサイズ よりも大きいライゲーション生成物が生成されるが、末端オリゴヌクレオチド〈 １および６）がホスホリル化されていない場合、高分子量を有する生成物は２４ ８／２４０塩基を有する完全な遺伝子である。この遺伝子を５ｐｈＩ／ＢａＩ！ １ＨＩ−切断ｐＢｓＭ１３−中にライゲーションし、エシェリヒア・つりに形質 転換する。６つの生成し几アンピシリン耐性コロニーから単離されたプラスミド ＤＮＡをＣ１ａＩ／ＢａｍＨＩにより切断すると、どの場合も１．４％アガロー ス・ゲル上に２３７ｂｐバンドが形成される。ＤＮＡ配列分析は、正しい配列を 含むクローンを示す。

正しいクローンから得られたＣ１ａｌ　／　Ｂａ＋ａＨＩバンドをゲルから除去 し、Ｔｒｐプロモーター・ベクターｐｌ　Ｌ　４０２　（Ｔｅｒｍ）にクローン 化する。発現を高め得る手段として、合成転写ターミネータ−（実施例１７参照 ）を、ＢａｍＨ１部位においてヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の３′−末端に結合され に前記ベクターに組み込み得る。従って、ＮＡＦ遺伝子を、プロモーターにおけ る転写開始部位のこのＢａｍＨＩ部住およびＣ１ａ）部位下流間に挿入すること により、ｃＭ−ｃｓＦ遺伝子を置き換える。生成したＮ　Ａ　Ｆ発現プラスミド 、Ｉ）（Ｎ　Ａ　Ｆ　）−〇Ｔ３を第１４図に示す。

Ｐ（ＮＡＦ）−６Ｔ３を含むインドールアクリル酸誘導エシェリヒア・コリ抽出 物の銀染色およびウェスタン・プロット分析は、天然ＮＡＦと共に移動し、天然 ＮＡＦに対する抗血清と反応するペプチドの時間依存性生産を立証する。

また、上記発現システムを用いることにより、前述のＮＡＦ変異型または他の生 物活性ＮＡＦフラグメン）・、例えばアミノ先端切断ＮＡＦフラグメントを製造 することができる。

ＮＡＦの生物特性は種特異性である。ウサギにおける活性は、ヒトにおける活性 を非常に密接に反映したものである。マウス、ラットおよびモルモットにおける 予備試験は明白な活性を全く示さなかっ７：０ ＮＡＦは、局所的または全身的に、Ｐ　Ｍ　Ｎ　（多形核細胞−好中球）の数ま 几は活性化状態の修飾に伴うかまたはこれを原因とする状態の処置における使用 に適している。Ｎ　Ａ　ＦはこれらのＰＭＮパラメーターを広範に修飾するため 、ＰＭＮＯ数または活性化状態が上昇すると臨床的改善が為される状態、例えば 細菌、マイクプラズマ、酵母および真菌およびウィルス感染症の処置における使 用に適している。さらにＮＡＰは、炎症性疾患、例えば乾せん、関節炎状態およ びぜん息、または異常に低い好中球数および／または全身的に低い好中球レベル の状態、並びにこれらの適応症に使用されるきっ抗物質の製造での使用に適して いる。

４、図面の説明 第１図：　ＬＰＳにより誘導されるＮＡＦ産生：実施例１の記載に従い分離され た単核細胞を２４ウエルの培養プレートに播種しく１Ｈ中５ｘｌＯ’細胞）、指 示濃度のＬＰＳにより刺激する。様々な時間間隔で培地を集め、遠心分離（２０ ０００ｒｐｍ、２０分間、４℃）により透明にし、ＮＡＦ活性を測定する。単一 ドナーから得られた細胞、デニプリケイト培養の平均。これるの結果は、異なる ドナーの細胞を用いた４つの類似実験の代表値である。

第２図：リンパ球ではなく単核食細胞によるＮＡＦの産生：ａ）総革核細胞フラ クション（・、■、５ｘｌＯ”細胞／ｌρ）およびそこから誘導された付着細胞 （０，口）を１００ｎ９のＬＰＳの存在下（・。

Ｏ）および非存在下（■０口）に２４時間培養する。

ｂ）水ひにより精製された単核白血球（０，１０＠細胞／！Ｑ）およびリンパ球 （△、４Ｘ１０＠細胞／１ｉ２）を１００ｎｌ？のＬＰＳの存在下で培養する。

グラフは、各々２回繰り返された５（ａ）および６（ｂ）独立実験から得られた エラスターゼ放出の平均相対値を表す。パネルａにおける・およびパネルｂにお けるＯの２４時間値を１．０に換算し、それに対応する他の値（平均±標準偏差 ）を計算することにより、データを規格化する。一方ではＮＡＦ生産における個 々の変動および他方ではＮＡＦの試験に使用される好中球の応答性における個々 の変動を説明するために、このタイプの表示形式が選ばれる。

第３図：ホスホセルロース・クロマトグラフィーによるＮＡＰの部分精製： 蛋白質（２８０ｎｍでの吸光度、−−−）、Ｎ　Ａ　Ｆ　（０）およびＩＬ−１ （△）の分布を示す。最高のＮＡＦ活性を有するフラクションを指示通りプール する。

第４図：ＨＰＬＣゲルろ過によるＮＡＦの精製：ａ）蛋白質（２８０ｎｍでの吸 光度）の分布および分子量マーカーの溶離時間（矢印：ｌ−分子量６６２００． ２＝分子１４２７００．３＝分子量２１５００．４＝分子量６５００および５； 分子量１２５５）。

ｂ）ＮＡＦ活性のプロフィール。

第５図２ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィーによるＮＡＦの精製： 部分精製ＮＡＦを低塩濃度でカラムに仕込み、次いで１モルＮａＣ１含有緩衝液 により溶離する。棒線はＮＡＦ活性を示す。

第６図：ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーによるＮＡＦの精製： 部分精製ＮＡＦを低塩濃度でカラムに仕込み、次いで１．５モルＮａＣ１含有緩 衝液により溶離する。棒線はＮＡＦ活性を示す。

第７図：Ｃ４カラム逆相ＨＰＬＣによるＮＡＦの精製：ａ）精製ＮＡＦを０．１ ％トリフルオロ酢酸中ＲＰカラムに充填する。カラムは、０．１％トリプルオロ 酢酸中アセトニトリルの一次勾配により展開される。

ｂ）棒線はＮＡＦ活性を示す。

第８図：ＣＮ−プロピル・カラム逆相ＨＰＬＣによるＮＡＦの精製： ａ）精製ＮＡＦを０．１％トリフルオロ酢酸中ベーカーボンドＣＮ−プロピル・ カラムに充填する。カラムは、０．１％トリフルオロ酢酸中ｎ−プロパツールの 一次勾配により展開される。

ｂ）棒線はＮＡＦを示す。

第９図：クロマトフオーカシングによるＮＡＦの精製：部分精製ＮＡＦをクロマ トフオーカシング・カラムに仕込む。カラムをボリバファ−９６−ＭＣｌ、ｐＨ ７，０により展開する。フラクションをＮＡＦ活性（−（−）およびｐＨ（・・ ・■・・・）について試験する。

第１０図工部分精製Ｎ　Ａ　Ｆに対する呼吸バースト応答：ａ）スーパーオキサ イドの生成：好中球（３Ｘ１０’／ｚのを３７゜で２分間１μｌのＰＡＦの存在 下または非存在下にプレインキスベーションし、次いで増量のＮ　Ａ　Ｆにより 刺激する。ＮＡＦ添加後のチトクロムＣ還元の記録を示す。

ｂ）ＨｚＯｔ−依存性化学光：部分精製ＮＡＦ並びにほぼ等活性濃度のＣ５ａお よびｆＭＬＰによる刺激後のプログレス曲線を左方に示す。

応答の初期相を右方に詳しく示す。刺激物質を５０μＣのＰＢＳ−ＢＳＡ中で加 える。

第１１ＥＤ：ＮＡＦおよびＣ５ａ間の識別：Ｃ５ａおよびＮ　Ａ　Ｆを新鮮なヒ ト血清またはＰＢＳと１５分間インキュベーションし、誠製物の活性（スーパー オキサイド生成）を測定する。

ａ）ＰＢＳ中Ｃ５ａ。

ｂ）血清中Ｃ５ａ。

Ｃ）血清単独、 ｄ）ＰＢＳ中ＮＡＦ。

ｅ）血清中ＮＡＦ。

第１２図工部分精製ＮＡＦ、Ｃ５ａおよびｆＭＬＰによる連続刺激に応じたスー パーオキサイド形成： ａ）好中球（３Ｘ　１０　＠／ｗＱ）を３７℃で５分間プレインキニベーション し、次いで（矢印で）示した種々のアゴニストにより刺激する。

ｂ）ＮＡＦおよび０５ｇによる連続または反復刺激。ａ）の場合と同様の条件。

矢印は示されたアゴニストの添加を示す。０５ａの濃度はζａ）では０．５ナノ モルおよびｂ）では０．２ナノモルであり、ｆＭＬＰの濃度は、両実験共２０ナ ノモルである。アゴニストを５０μＱのＰＢＳ−ＢＳＡ中で加える。

第１３図：合成ＮＡＦ遺伝子のヌクレオチド配列：遺伝子構築に使用される単一 オリゴヌクレオチド、０Ｎ−１〜０Ｎ−６を破線で示す。（下、りヌクレオチド 数は、２本鎖の右側上部に記載されている。主形態の対応するペプチド配列に、 アミノ末端（Ｓｅｒ）から始めて番号を付す。Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨＩ制限部 位を２本鎖上部に示す。まＬ１アルギニン・コドンのＡをＣで置換することによ り作成されたＴａｑＩ部位を示す。

第１４図：発現ベクターｐ（ＮＡＰ）　　６　Ｔ　９　：ＡＲ＝アンピシリン耐 性遺伝子 ＴｒｐＰ１０＝）リブトファン・プロモーターＴ；合成転写ターミネータ− 第１５図：天然および組換えＮＡＦの同定：上のグラフ：天然（左）および組換 え（右）ＮＡＦにより誘発された細胞質ゾル遊離Ｃａ”＋変化。好中球（４Ｘ１ ′０’細胞／酎）を０．１ナノモルｑｕｉｎ−２／ＡＭと共に負荷し、次いで３ ナノモルＮＡＦ（マーク）により刺激するｅｖ、フォノ・チャーナー等、「ジャ ーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリーＪ２６］（１９８６）１０１６３ −１０１６８頁の記載に従い、ｑｕｉｎ−２の飽和度の変化を測定する。

下のグラフ：天然（左）および組換え（右）ＮＡＦにより誘発された呼吸バース ト。好中球（１０ｒ″細胞／鱈）を３．１０および３０ナノモルのＮＡＦにより ０時点で刺激し、過酸化水素生成を化学発光により測定する（Ｍ、Ｐ、ワイマン 等、「アナリテイカル・バイオケミストリー」上６５［１９８７コ３７１−３７ ８）。

第１６図：皮膚部位への血しようしん出：ＮＡＦまたはエンドトキシンの皮内注 射後、持続時間：４時間、 ３匹のウサギの平均：平均応答の標準誤差。

第１７図：皮膚部位における好中球蓄積：第１６図でプロットされた応答との同 時測定。

第１８図：好中球蓄積に対するポリミキシンＢの作用：！’、”ＡＦ（１０ノモ ル／部位）、ｆＭＬＰ（１０ａモル／部位）またはエンドトキシン（１０−”モ ル／部位）の皮内注射後、ポリミキシンＢ：４０μ９／部位１ 持続時間：２時間、 ３匹のウサギの平均立平均応答の標準誤差。

第１９図：好中球蓄積に対するアクチノマイシンＤの作用：ＮＡＰ（１０−”モ ル／部位）、ｆＭＬＰ（１０ａモル／部位）または・　　エンドトキシン（１０ −”モル／部位）による皮膚部位の刺激後、持続時間：２時間、 ３匹のウサギの平均：平均応答の標準誤差。

５、実施例 以下、実施例によりこの発明を説明する。温度は全て摂氏である。

次の省略形を用いる。

Ｐ）（Ａ：　　　　　　　フィトヘマグルチニン。

ＣｏｎＡ：　　　　　　　コンカナバリンＡ９ＬＰＳ＋　　　　　　　エシェリ ヒア・コリ・リボ多糖類。

ＢＳＡ：　　　　　　　うし血清アルブミン。

ｆＭＬＰ：　　　　　　Ｎ−ホルミル−し−メチオニル−し−ロイシル−し−フ ェニルアラニン。

ＰＡＦ：　　　　　　１−０−ヘキサデシル−２−〇−アセチルー５ｎ−グリセ ロー３−ホスホコリン（血小板活性化因子）。

ＭＥＭ：　　　　　　イーグル最小必須培地（ゼロ−メト・ゲゼルシャフト・ミ ツト・ベシュレンクテル・ハフラング、ミュンヘン、西ドイツ国）、２５μ９／ 村ネオマイシンによる補足、２５ミリモルＮａＨＣＯ，および２０ミリモルＨＥ ＰＥＳによりｐＨ７，４に緩衝。

ＭＥＭ−ＰＰＬ：　　上と同様、ただし、さらに１％の低温殺菌面しょう蛋白質 溶液（５％Ｐ　Ｐ　Ｌ　−Ｓ　ＲＫ、スイス・レッド・クロス・ラボラトリ−、 ベルン、スイス国）および１００１　Ｕ／ＩＱペニシリンおよびストレプトマイ シン（ギブコ・アクチェン・ゲゼルシャフト、バーゼル、スイス国）を含有。

ＰＢＳ：　　　　　　Ｃａ”÷およびＭｇ！↑不含有燐酸緩衝食塩水（１３７ミ リモルＮ　ａ　Ｃ１，２，７ミリモルＫＣＩ、８．１ミリモルＮａ　Ｈｚ　Ｐ　 ＯＡおよび１．５ミリモルＫＨｔＰＯ，、ｐＨ７，４に調節）。

ＰＢＳ−ＢＳＡ：　　　０．９ミリモルＣａＣ１＊、０．４９ミリモルＭｇＣ１ ｔおよび２　、５　ｍ９／友ＱＢ　Ｓ　Ａにより補足しＨＥＰＥＳ：　　　　　 Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ。

−２−エタンスルホン酸。

ＰＰＬ−ＳＲＫ：　　血しよう蛋白質溶液（スイス・レッド・クロス）。

ＮＡＦ：　　　　　　好中球活性化因子または蛋白質。

Ｃｘ：　　　　　　　シクロへキシミド。

ＩＬ−１：　　　　　　インターロイキン−１゜ＳＯＤ：　　　　　　スーパー オキサイド。

０５ａ：　　　　　　　アナフィラトキシン。

ＣＰＣ：　　　　　　制御多孔質ガラス。

ＰＡＧＥ：　　　　　ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動。

ＧＭ−ＣＳ　Ｆ　：　　　か粒球−マクロファージ・コロニー−刺激因子。

ＣＢ：　　　　　　サイトカラシンＢ（５μｙ／１Ｉ２）。

ＭＥＳ：　　　　　　　２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸。

ＨＰＬＣ：　　　　　高速液体クロマトグラフィー。

ＳＤＳ：　　　　　　　ドデシル硫酸ナトリウム。

第１部：　ヒト単核白血球によるＮＡＦ産生。

実施例Ｉ ＬＰＳにより刺激されたヒト単核白血球によるＮＡＦの産生。

ヒト単核白血球を、ドナー血液（スイス・レッド・クロス・ラボラトリ−、ベル ン、スイス国）の軟膜からフィコルーパーク勾配による遠心分離により単離する 。この方法は、いわゆる単核細胞、すなわち単核白血球（約２０％）およびリン パ球（約８０％）の混合物から好中球を分離するものである。３種の単核白血球 調製物、すなわち（ｉ）全単核細胞フラクション、（ｉｉ）付着により単核細胞 フラクションから濃化されに単核白血球、および（ｉｉｉ　）遠心水はによりリ ンパ球から分離された９０％純度の単核白血球を使用する（Ｇ、ガロツク等、「 バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ ｊ１４０［１９８６：！９４８−９５４およびＫｌ。

クレメッツォン等、「ジャーナル・オン・エクスベリメンタル・メディシンｊｌ 多１［１９８５］９７２−９８３）。細胞をＭＥＭ−ＰＰＬ中で培養し、濃度を 高めた（０．１ｎｇ〜１μ９／＋ｆｆ）Ｌ　Ｐ　Ｓにより刺激する。異なる時点 で、培養培地のアリコート試料を採取し、サイトカラシンＢにより前処理された ヒト好中球からのエラスターゼ放出誘導能としてＮＡＦ活性を測定する（Ｂ、デ ュウォルド等、「バイオケミカル・ファーマコロジーＪ３６［１９８７コ２５０ ５−２５１０）。

約ｌ：５の比率での単核白血球およびリンパ球から成る単核細胞培養（５ｘｌＯ ’細胞／ＦＣ）は、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｘＱ）により刺激されるとＮＡＦを生 産する。ＮＡＦは２４時間にわたり培地に蓄積し、生産量は２４時間ないし４８ 時間の間に横這い状態になるゎ刺激物質の非存在下ではＮＡＦは全く形成されな い。第１図は、既にＯ２ｌｎｇ／ｉＱおよび１ｎｇ／ｘＱの間で活性を示してい るＬＰＳの時間経過および激変依存性を示す。

様々な単核細胞調製物を用いてＮＡＦの供給源を試験する。第２ａ図は、全単核 細胞フラクションおよびそこから付着により選択された単核白血球によるＮＡＦ のＬＰＳ−依存生産性を示す。これらの結果は、ＮＡＦ’生成がＬＰＳに依存し ていることを確認し、ＮＡＦが単核白血球により生成されることを示す。リンパ 球の存在は、ＮＡＦの生産量に影響するとは思われない。水はにより精製された 単核白血球およびリンパ球を用いても同様の結果が得られる。第２ｂ図に示され １こ通り、ＮＡＦはリンパ球ではなく単核白血球により生成される。

実施例２ ＰＨＡまたはＣｏｎ、Ａにより刺激されたヒト単核白血球によるＮＡＦの産生。

実施例１の記載に従いヒト血液軟膜から分離されに単核細胞フラクションを、実 施例１で概略を示した条件下で培養し、ＰＨＡ（５μ９／！１ＩＱ）またはＣｏ ｎＡ（１０ｔｔ９／ｚＱ”）により刺激する。Ｎ　Ａ　Ｆ生産の時間経過は、１ ００　ｎｇ／ｘＱのＬＰＳにより刺激されに単核細胞により観察された時間経過 と類似している。約２４時間後、最大値に到達する。

実施例３ シクロへキシミドによるＮＡＦ生成の阻害。

：＜　Ａ　Ｆが、刺激物質濃度により異なるにせよ、単核白血球の刺激直後には 放出されず、数時間内に放出されるという事実は、新たな蛋白質合成が要求され ること、およびＮＡＦ産生が現実には刺激物質により誘発されることを示唆して いる。蛋白質合成の必要条件は、シクロへキシミドの添加によりＮＡＦ生成が阻 害される実験により立証される。代表的実験の結果を第１表に示す。

第１表 シクロへキシミドによるＮＡＦ生成の阻害処理　　　　　　　　　　　　Ｎ　Ａ 　Ｆの平均生産量４時間後　　８時間後　　２４時間後 無し　　　　　　　　　　　　　ｏ　　　　　　Ｏ０ＬＰＳ　　　　　　　　　 　７２６　　２０４２　　２６３３ＬＰＳ＋ＣＸ　　　　　　　　　０　　　　 　　０　　　　　　０ＬＰＳ＋ＣＸ（４時間後）７７４　　　９６６　　　６３ ９ＬＰＳ＋ＣＸ（８時間後）７５２　　１８８４　　１８５４シクロへキシミド （ＣＸ、１０μ９／ｚＱ）をＬ　Ｐ　Ｓ　（１００ｒ＋ｇ／ＩＩｃ）（７）４ま たは８時間後に加える。活性を、エラスターゼ放出を表す蛍光単位で示す。

第２部：　　ＮＡＦ精製 実施例４ ホスホセルロース・クロマトグラフィーによるＮＡＦおよびＩＬ−１の分離。

実施例１の記載に従いドナー血液軟膜から得られた単核細胞を、撹はん培養瓶中 （１，５１２，５Ｘ１０”細胞／Ｍの、１００　ｎｇ／１ｉ（ｌのＬＰＳの存在 下にＭＥＭ−ＰＰＬ中で４８時間培養する。次いで、培養上清を集め、４゛で２ θ分間２００００　ｒｐ＋ｎで遠心分離することにより、粒状物質を除去し、２ ０ミリモルＮａＣ１および５％グリセリンを含有する２０ミリモル燐酸カリウム 緩衝液、ｐＨ７，２により平衡状態にした１０ｇρホスホセルロース・カラム（ ワットマンＰ１１．１．４Ｘ６ｃｉ）に負荷する。カラムを上記緩衝液３０！ｇ により洗浄し、次に同緩衝液中、直線ＮａＣ１濃度勾配（０，０２モル〜１．５ モル）９０ｚ（により溶離する。２好のフラクションを０．１％ポリエチレング リコール中で集め、Ｎ　Ａ　ＦおよびＩＬ−１活性について試験する。２８０ｎ ｍでの吸光度を蛋白質の尺度として継続的にモニターする。

第３図は、蛋白質の分布プロフィール（２８０ｎｍでの吸光度）並びに２種の生 物活性、すなわち、ＮＡＦ活性の尺度としてのエラスターゼ放出およびＩＬ−１ 活性の尺度としての胸腺細胞増殖を示す。

大部分の蛋白質およびＩＬ−１活性は、フロー−スルー容積で回収される。直線 ＮａＣ１勾配により溶離すると、低イオン強度でＩＬ−１活性が得られ、次いで Ｎ　Ａ　Ｆに対応するエラスターゼ放出活性のピークが得られる。これは、０． ５モルで溶離し始め、０．８モルＮａｃ１でその最大値に到達する。ピークは対 称であり、小さな肩が先行する。ＵＶ−吸収材料の中には塩勾配により溶離され るものもある。しかしながら、そのプロフィールは、測定された生物学的活性と は一致しない。第３図で示す通り、ＩＬ−１およびＮ　Ａ　Ｆは完全に分離され 得る。ＩＬ−１と関連のあるエラスターゼ放出活性も、ＮＡＦと関連のある胸腺 細胞増殖誘発活性も存在しない。分画化後のＮＡＦの収率はほぼ１００％であり 、培地が阻害剤または活性剤を含まないことを示している。

実施例５ ゲルろ過によるＮＡＦの精製。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）により部分精製されりＮＡ Ｆ　２００　ａ（ｉｔ））試料を、ＴＳＫ−ＧＳＷＰプレカラム（７５Ｘ７５Ｉ ｘ）付ＨＰＬＣＴＳＫ−Ｇ２０００ＳＷカラム（７，５ｘ６００■）に適用する 。１００ミリモルＮａＣ１を含む１００ミリモルＮ　ａ　ＨＰ　Ｏ４、ｐＨ７， ０中、カラムから０　、５　ｚＬ’分の速度で溶出させる。うし血清アルブミン （分子量６６２００）、卵アルブミン（分子量４２７００）、大豆トリプシン阻 害剤（分子量２１５００）、アプロチニン（分子量６５００）およびアクチノマ イシンＤ（分子量１２５５）を測定標準として使用する。ＮＡＦは、アプロチニ ンの直後およびアクチノマイシンＤのかなり上に僅かな非対称ピークを伴って溶 離する。従って、ＮＡＦの見かけ上の分子量は約６５００である。ＮＡＦ活性は 、記されたピークの前または後には溶離されない（第４図）。

実施例６ ヒドロキシアパタイトによるＮＡＰの精製。

１５１１２の総容量（約８００Ｍｇの非分画化培養上清に相当）でホスホセルロ ース・クロマトグラフィー（実施例４）から得られたフラクションのプールを、 充填緩衝剤（０，１％ポリエチレングリコール６０００中ｌＯミリモルの燐酸ナ トリウム、ｐＨ６，９）によりｌ：１０に希釈し、充填緩衝液中平衡状態である ３ｍＣヒドロキシアパタイト・カラム（バイオゲルＨＴＰ）に注入する。カラム を３紅分量の充填緩衝剤により３回洗浄し、次いで１モルＮａＣ１を補った充填 緩衝液により溶離する。この手順により、ＮＡＦはカラムから回収される。続い て０．５モル燐酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６，９により溶離してもそれ以上ＮＡ Ｆ活性は得られない（第５図）。

実施例７ ヘパリン−セファロースによるＮＡＦの精製。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）により部分精製されたＮＡ Ｆ１ｉ＋Ｑの試料を、０．１％ポリエチレングリコール６０００および５０ミリ モルＮａＣ１を補った１０ミリモル燐酸ナトリウム、ｐＨ７，３において平衡状 態に達したヘパリン−セファロース４Ｂの０　、５　＊Ｑカラムに注入する。カ ラムを同緩衝液で洗浄し、次いで１．５モルＮａＣ１を補ったＩＯミリモル燐酸 ナトリウム、ｐＨ７。

３で溶離する。カラム洗浄後、少量のＮＡＦがフロー−スルー流体中に検出され るが、カラムに結合した活性の大部分は、さらに高いイオン強度の緩衝液により 溶離される（第６図）ｅ実施例８ ０４力ラム逆相高圧液体クロマトグラフィーによるＮＡＦの精製。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）、次いでヒドロキシアパタ イト精製（実施例６）により精製されたＮＡＦの試料を、広孔逆相Ｃ４カラム（ バイオラッドＲＰ　３０４）に適用する。０．６６％／分の割合で増加させなが ら、０．１％トリフルオロ酢酸中θ〜８０％アセトニトリルの勾配に上りカラム を溶離する。流速は０゜５！Ｑ／分である。フラクションを集め、真空乾燥する 。残留物を０゜１％ポリエチレングリコール６０００含有ＰＢＳ　１００μｇに 再懸濁し、ＮＡＦ活性について試験する。ＮＡＦは約６０分の保持時間で溶離し 、単一の鋭いピークとして約４０％アセトニトリルに対応する（第７図）。

実施例９ ＣＮ−プロピル・カラム逆相高圧液体クロマトグラフィーによるＮＡＦの精製。

実施例８記載の逆相クロマトグラフィーにより精製し、真空乾燥した、０．１％ ポリエチレングリコール含有ＰＢＳ　１００μＱに再懸濁したＮＡＦの試料を、 １倍容量の０．１％トリフルオロ酢酸により希釈し、ベーカーボンド広孔シアノ （ＣＮ）−プロピル・カラム（ベーカー・リサーチ・プロダクツ、フィリップス バーブ、ニューシャーシー、アメリカ合衆国）に適用する。０．４１％／Ｍ１． の割合で増加させながら、０，１％トリフルオロ酢酸中Ｏから５０％へのｎ−プ ロパツール勾配によりカラムを溶離する。流速は０．５ｘ（１／分である。

フラクションを集め、真空乾燥する。残留物を０．１％ポリエチレングリコール ６０００含有燐酸緩衝食塩水１００μρに再！ｆ！、濁し、Ｎ　Ａ　Ｆ活性につ いて試験する。ＮＡＦは２つの鋭いピークで溶離する。これらのピークの大きい 方は、５３分の保持時間で２２％のｎ−プロパツールに対応し、全活性の３０％ に満１；ない小さい方のピークは、６６分の保持時間で２７．５％のｎ−プロパ ツールに対応する（第８図）。

実施例１Ｏ Ｎ　Ａ　Ｆのクロマトフオーカシング。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）により部分精製したＮＡＦ ４ｚＣの試料を、２５ミリモルのエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ９，４および ０．１％ポリエチレングリコール６０００から成る出発緩衝液に対して透析し、 同緩衝液により平衡状態に達しているＰＢＥ９４カラム（０，７Ｘ　Ｉ　９ｃｚ 、ファルマシア）に注入する。

次に、カラムを２００ｚｆｆの０．１％ポリエチレングリコール６０００含有ポ リバフア−９６−ＨＣＩ（水で１：１０に希釈）、ｐＨ７、０により溶離する。

１０分フラクションを１０−１４１１２／時の流速で集め、ＮＡＦ活性について 測定する。活性の大部分はｐＨ８、５〜ＰＨ８，８の領域で溶離する（第９図） 。

第３部：　　ＮＡＦの物理化学的および生物学的特性検定。

実施例１１ ＮＡＦの物理化学特性。

ホスホセルロース・クロマトグラフィー（実施例４）により得られた部分精製Ｎ ＡＦをこれらの実験において使用する。ホスホセルロース・クロマトグラフィー 後、最高のＮＡＦ活性を有するフラクションを、分子量カットオフ力月０００ダ ルトンである膜を用いて４゜で−夜ＰＢＳに対して透析する。次いで、得られた 調製物に対し、次の処理を行う。すなわち、ａ）トリプシン、キモトリプシンま たは　′プロテア−ゼＫ（１００μｇ／ｚ１２）の存在下および非存在下３７゜ でインキュベーションし、次いで過剰のＢ　Ｓ　Ａ　（２ｍｙ／ｘ４）を添加す ることによりＮＡＦの蛋白質加水分解を止める、ｂ）５６°、８０゜または９５ °に加熱する（対照の場合の２２°と比較）、ｃ）ｐＨ２または１０（２２°で ）に暴露し、次いでｐＨ７，４に調節する（対照のｐＨ７，４と比較）、ｄ）２ モルの塩化リチウム、６モルのグアニジウムクロリド、１％の２−メルカプトエ タノールまたは０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に３時間２２°で 暴露し、次いでＰＢＳに対して４°で２４時間透析する。添加を行うとき、ＮＡ Ｆ不含有試料を同様に操作し、ＮＡＦ検定に及ぼし得る影響について試験する。

第２表に示す通り、ＮＡＦは不活化に著しい抵抗を示す。その活性は、種々のプ ロテアーゼとのインキュベーション後に破壊され、ＮＡＦがポリペプチドである ことを示している。反対に、Ｎ　Ａ　Ｆは、加熱、酸およびアルカリｐＨ条件ま たはＳＤＳ暴露によって容易には不活化されない。２−メルカプトエタノール、 塩化リチウムおよびグアニジウムクロリドによりある程度不活化は達成される。

第２表 Ｎ　Ａ　Ｆの物理化学的特性 処理　　　　　　　　　　　　　条件　　　　　　　相対活性温度　　　　　　 　　　　　　　２２＠、３時間　　　１００５６°、１時間　　　　８２ ８０＠、１５分　　　８０ ９５°、５分　　　　６６ ｐＨ２，ｏ　　　　　　　　　　　　２２°、３時間　　　　７６ｐＨ１０，ｏ 　　　　　　　　　　　２２°、３時間　　　　９０ＳＤＳ　　０．５％　　　 　　　　　２２°、３時間　　　１００２−メルカプトエタノール１．０％　　 ２２°、３時間　　　　３０塩化リチウム　２モル　　　　　２２°、３時間　 　　　５２グアニジウムクロリド６モル　　２２°、３時間　　　　６８トリプ シン　１００μ９／蛙　　３７°、４時間　　　１００３７°、１２時間　　　 　８ α−キモトリプシン１００μｇ／１Ｉ２３７°、４時間　　　　８０３７°、１ ２時間　　　　ｌ プロテイナーゼに１００μ９／ＩＩＱ　　３７°、１２時間　　　　０実施例１ ２ ＮＡＦ誘発エキソサイト−シス（ヒト好中球でのＮＡＦによるか粒放出の誘発） 。

Ｐ　Ｂ　Ｓ／　Ｂ　Ｓ　Ａニ懸ｍＬ１；好中球（５ｘ　１０　”／ｒｔ＝Ｑ）’ ｅ、３７ａで５分間サイトカラシンＢ（５μ９／好）の存在下または非存在下に プレインキユベーンヨンする。次いで、刺激物質、例えばＮＡＦまｋは標準刺激 物質を加えることによりか粒放出を開始させる。水中で急速冷却することにより １５分後に反応を止め、次に遠心分離により細胞を沈澱させる。ビタミンＢ１２ 結合蛋白質、β−グルクロニダーゼおよび乳酸デヒドロゲナーゼを細胞不含有培 地および細胞沈澱物において測定し、これらの成分の放出を全細胞成分のパーセ ントとして計算する（Ｂ、デュウォルトおよびＭ、バッジョリｍ；、「メソッズ ・イン・エンザイモロジーＪｌ　３２！：１９８６］２６７）。

ビタミンＢ１２結合蛋白質およびβ−グルクロニダーゼ（各々、特異か粒および アズール好性か粒の成分である）の放出に対するＮＡＦの作用を第３表に要約す る。

第３表 ヒト好中球によるか粒成分の刺激物質依存性エキソサイト−シス放出パーセント ビタミンＢ１２　　　β−グルク　乳酸デヒド刺激物　　　ＣＢ　　結合蛋白　 　　ロニダーゼ　ロゲナーゼ無し　　　　　　　−６，０土０．４　　　２．１ ±０．４　　６．２出２．５ＮＡＦ　　　５０ｕＱ　　−１２，９±１．６　　 ２．７±１．３　　５．８立０．７ＮＡＦ　　ｌｏＯμＩ２　−　　１３．９立 ２．１　　３．０±１．：ｌ　　　６．８＋２．２ｆＭＬＰ　　Ｏ，１μＭ　　 −１４，０±０．９　　２．３±０．８　　５．？±１．１無し　　　　　　　 ＋　　１０．０±１．１　　　２．４±０．２　　７．０±３．２ＮＡＦ　　　 　　５０μｍ２　　　＋　　　　２５．６＋：３．４　　　　７．９±２．０　 　　６．７±１．６ＮＡＦ　　　　１００μｆ２　　　＋　　　　２６．ｌｌｌ ±４．９　　　　８．５±１．７　　　７．３±２．１ｆＭＬＰ　　　０．１μ Ｍ　　＋　　　　３５，６±５．５　　　１２．１±４．４　　　５．３±１． ６正常な好中球において、ＮＡＦは特異か粒のみのエキソサイト−シスを誘発す る。しかしながら、細胞をサイトカラシンＢで前処理すると、両タイプのか粒か らの充分な放出が達成される。後者の条件下において、β−グルクロニダーゼの 放出は、Ｎ　Ａ　Ｆ活性の試験に使用されるマーカーである（実施例１）、エラ スターゼの放出と平行している。量的な点では、ＮＡＦのエキソサイト−シス誘 発特性は、走化性ペプチドｆＭＬＰの場合と類似している。いずれの刺激物質も 細胞質ゾル酵素、乳酸デヒドロゲナーゼの放出を誘発せず、細胞障害がごく僅か であることを示している。

実施例１３ ＮＡＦ誘発呼吸バースト（ヒト好中球でのＮ　Ａ　Ｆによるスーパーオキサイド 形成の誘発）。

フェリチトクロムＣのＳＯＤ感受性還元として、スーパーオキサイド形成を３７ °で測定する（Ｍ、マーケート等、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」±３ ２［１９８４３２６７）。検定混合物（８００μＣ）は、８５マイクロモルのチ トクロムＣを含む、０．７５Ｘ１０６細胞／ｉ（２のＰＢＳ−ＢＳＡにより構成 される。サーモスタット式７プレート・キュベツト交換器を備えたヒユーレット −パラカード８４５１Ａ二極管配列分光光度計において、吸光度変化を記録する 。第４表は、ヒト好中球におけるＮＡＦの呼吸バースト誘発能を示す。

第４表 ヒト好中球によるＮＡＦ依存性スーパーオキサイド生成チトクロムＣ還元十 ＮＡＦ　　　最大速度　　　　　　　　　３分間の合計（ρ　　　（ナノモル　 　　　　　　　　　（ナノモル５　　０．８１　　　　　　　　０．８９１０　 　　１．４５±０．６３　　　１．４５±０．５０２０　　２．３２±０．５６ 　　２．１６±０．３９３０　　２．５１±０．５０　　２．３０±０．５５５ ０　　　Ｌ５１±０．６９　　３．１０±０．５５１００　　３．６９　　　　 　　　　３．３９゜＋値は全て１０＠細胞当たりについて示す。

平均値＝標準偏差 スーパーオキサイド生成の最大速度および合計量の漸増は、ＮＡＦ量を増すこと により達成される。比較実験が示し得る通り、最大レベルのスーパーオキサイド 生成を誘発するＮＡＦ量量は、最大エキソサイト−シス誘発量に対応する。

実施例１４ Ｈｔ　Ｏを形成（ヒト好中球における呼吸バーストの刺激物質としてのＮＡＦと ｆＭＬＰおよびＣ５ａとの比較）。

刺激された細胞によるスーパーオキサイドまたは過酸化水素の生成を評価するこ とにより、呼吸バースト刺激物質としてのＮＡＦ。

ｆＭＬＰおよびＣ５ａの特性を比較する。実施例１３の記載に従いスーパーオキ サイド生成を測定する。化学発光により過酸化水素形成を測定する（Ｍ、Ｐ、ワ イマン等、「アナリティカル・バイオケミストリー」上６５［１９８７］３７１ −３７８）、’　０．１Ｍナトリウムアジド、０．０１ｍＭルミノール、９Ｕ／ ｉ（２西洋わさびペルオキシダーゼおよび１０１１好中球を含むＰ　Ｂ　Ｓ　− Ｂ　Ｓ　、Ａから成る検定混合物を３７°でｌθ分間プレインキニベーションし 、小型注射器で刺激物質を加えることにより反応を開始させる。

第１０図は、Ｎ　Ａ　ＦＯ量を増すことにより誘発されるスーパーオキサイド形 成を示す。その開始が急速で、速度が高く、早く横這い状態になることから、Ｎ ＡＦに対する応答は、ｆＭＬＰまたはＣ５ａにより誘発される応答と近似してい る。ＮＡＰに対する応答は、ＰＡＦによる細胞の前処理により著しく高められ（ 第１０図）、またこの前処理によってｆＭＬＰまたはＣ５ａにより誘発されるス ーパーオキサイド生成も高められる。Ｎ　Ａ　Ｆ　、　ｆＭ　Ｌ　ＰおよびＣ５ ａに対する応答の直接比較を第９図に示す。Ｈ２Ｏ２形成速度対時間の化学発光 記録は、応答の類似性を強調している。さらに、これらの測定および他の測定結 果は、ｆＭＬＰ、Ｃ５ａ、ＰＡＦおよびロイコトリエンＢ４に関する先の報告に よると、刺激物質添加およびＮＡＦ、ｆＭＬＰおよびＣ５ａにより誘発されるＨ ２Ｏ，生成の開始の間の時間が同一であり、約２秒後に達することを示している （Ｍ、Ｐ、ワイマン等、「ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリーＪ ２６２［１９８７コ１２０４８）。ＮＡＦＳｆＭＬＰおよびＣ５ａに対する好中 球応答の定性的および定量的類似性は、ＮＡＦが表面受容体への結合により好中 球を活性化し、受容体アゴニストのように作用することを示す。

実施例１５ ＮＡＦおよびＣ５ａ間の区別。

実施例１４で報告した通り、ヒト好中球に対するＮＡＦ活性のプロフィールはＣ ５ａの場合と似ている。これら２種のペプチド間の類似性は、さらに物理化学特 性、例えば熱および酸に対する耐性を識別する場合にも当てはまる。Ｃ５ａおよ びＮＡＦは好中球に対して似た作用を有するため、これら２つを完全に区別する ためにはさらに別の実験を行わなければならない。ＮＡＦおよびＣ５ａの試料を 新鮮なヒト血清に暴露する。この処理は、カルボキシペプチダーゼによる開裂に よりＣ５ａをその比較的不活性のデス−アルギニル誘導体に変換することが知ら れている。第１１図に示す通り、血清処理は完全にＣ５ａの活性を破壊するが、 ＮＡＦの活性には何等影響を与えない。これは、これら２種の薬剤が構造的に異 なることを示す。

実施例１６ ＮＡＦが好中球にそれ自体の特異的受容体を有している証拠。

同量の同じ受容体アゴニスト（例、ｆＭＬＰ）により好中球を２回刺激し、スー パーオキサイド生成を好中球応答の尺度として記録した場合、第２の刺激は事実 上不活性である。他方、異なる受容体に作用するアゴニストを連続して用いた場 合（例、ｆＭＬＰ、次いで０５ａ）、これらの刺激により通常の応答が得られる 。従って、このタイプの実験を用いることにより、ＮＡＦがそれ自体の受容体に より作用するのか、他のアゴニストによっても使用される受容体により作用する のかを判断する。

第１２ａ図は、Ｎ　Ａ　ＦまたはＣ５ａによる初回攻撃後、好中球がｆＭＬＰに 対し正常応答することを示す。第、１２ｂ図では、ＮＡＦおよびＣ５ｇによる反 復刺激の結果を示す。まず、同量のスーパーオキサイド生成誘発濃度のＮＡＦお よびＣ５ａにより細胞を刺激し、次に、同じかまたは代替的刺激物質により刺激 する。同じアゴニストを２回適用しに場合、細胞は第２刺激には反応しない。逆 に、ＮＡＦにより初回攻撃された細胞ではＣ５ａに対する正常応答が得ろれ、Ｃ ５ａにより初回攻撃された細胞ではＮＡＦに対する正常応答が得ろれる。好中球 はいずれかの刺激に対する完全な脱感作性は示すが交差脱感作性は示さないこと から、ＮＡＦおよびＣ５ａは、非関連受容体によりそれらの刺激効果を発揮する と思われ、それらが構造的に異なることを示す。また、ＳＡＦとＰＡＦ、、ｆＭ ＬＰおよびロイコトリエンＢ４との組み合わせは交差脱感作性を示し得ない。

従って、ＮＡＦは選択的で現在まで未知の受容体を介して作用する。

実施例１７ ウサギにおけるＮＡＰにより誘発される好中球蓄積および血しようしん出。

意識のある２、０〜２　、５　ｋｇニューシーラント産アルピノ・ウサギの皮膚 において炎症反応を試験する。ドナーのウサギから採取した血液中の赤血球を、 ヒドロキシエチルセルロース（ポリサイエンシーズ、ウォーリントン、ペンシル バニア）により沈降させ、生成した白血球濃化面しょう中の好中球を、パーコー ル（ファルマシア、ウプサラ、スエーデン）密度勾配遠心分離により精製する〈 〉９４％好中球）。１０％低血小板血しょうを含むＣａ”＋およびＭｇ”十不含 有タイロード溶液に細胞を再懸濁して１０”白血球／Ｑの濃度とし、１０６細胞 当たり４０μＣ１１１１インジウム−オキシン（アマ−ジャム）により室温で１ ５分間標識する。標識細胞を１０％低血小板血しょうによる遠心分離により洗浄 し、ｌ容器光たり約１０６細胞を１０μＣ３ｌｆｆｉ６ヨウ素標識ヒト血清アル ブミン（アマ−ジャム）と混合し、試験下の炎症病変部を有するウサギの後部耳 静脈に静脈内注射を行う。次いで、炎症剤の皮肉注射を行い、アクチノマイシン ＤおよびポリミキシンＢによる試験では２時間後、および用量応答試験では４時 間後に動物を殺す。放射能標識細胞が循環している期間の中途で、血液試料を集 め、好中球および血しょうの血中比活性を測定する。各実験の最後に炎症病変部 における放射能をマルチチャンネル・ガンマ・カウンターで測定し、対照皮膚部 位の活性を控除し、炎症病変部に蓄積している好中球の絶対数および血１．．よ うの体積を比活性から算出する。チブルスキー等の方法（「アメリカン・ジャー ナル・オン・バソロジーｊｌ　２４［１９８６ｉ３６７）に従い、末梢血液１ｉ １２につき循環している１０＠好中球当たりの細胞数として結果を表すことによ り、炎症病変部の好中球数を動物間で標準化する。

実施例１９の記載に従い得られた組換えＮ、ＡＦを、４００μ９／ｘＣの割合で ０．４５モルＮａＣ１（ｐＨ６、５）含宵最小必須培地（５０ミリモル）に溶解 する。エンドトキシン（エンエリヒア・コリ血清型０５５：Ｂ５、シグマ、セン トルイス、ミズーリ）を発熱物質不含有規定食塩水に溶かす。ｆＭＬＰをジメチ ルスルホキシドに溶かしく１０−２モル）、ＰＦＳ中作業濃度に希釈する。ポリ ミキシンＢおよびアクチノマイシンＤを１ｘＱのエタノールに溶かし、ＰＦＳ中 ＮＡＦ。

エンドトキシンまたはｆＭＬＰと混合することにより２０倍に希釈する。炎症応 答阻害試験では、４０μこのポリミキシンＢおよび１０−７モルのアクチノマイ シンＤを、皮膚部位光たり１０μモルの工ンドトキシンと共に皮膚部位に注射す る。全実験において、１部位当たり０　、２　ｚ（ｌの炎症剤を２６ゲージ針に より皮肉注射し、各動物において各処理を５回反復する。

Ｎ　Ａ　Ｆは、試験用量範囲（１部位当たりＩＱ−１１〜１０ノモル）において 血しょうしん出（第１６図）および好中球蓄積（第１７図）における用量依存性 増加を誘発する。比較し１；場合、エンドトキシンは、１部位当たりｌｏｊｓモ ルで同等の強度の血しょうしん出（第１６図）および好中球蓄積（第１７図）を 誘発する。５匹のウサギにおいて、ＮＡＦは、血しょうしん出および好中球蓄積 に対する刺激物質としてｆＭＬＰよりも３〜１０倍効力が強い。ＮＡＦを溶かす のに使用される緩衝液を、１部位当たり１０−９モルを送達する溶液中に存在す る濃度に希釈することにより誘発される好中球蓄積は、ＰＦＳのみ与えられた部 位における応答とは異ならない。ＮＡＦｆｆ製物の活性がエンドトキシン汚染物 質に起因し得るという可能性を、ＮＡＦ。

ｆＭＬＰまたはエンドトキシンと一緒にポリ、ミキシンＢ（４０μ９／部位）を 注射することにより試験する。ポリミキシンＢは、エンドトキシン（１０−”モ ル）に対する応答の８４％阻害を誘発するが、ＮＡＦ（１０−９％ル）まｙ二ｆ ＊ｆＭＬＰ（１０−”モル）ｉ：よ１，１誘発される好中球蓄積については影響 を及ぼさない（第１８図）。

ＲＮＡ転写の非可逆的阻害剤、アクチノマイシンＤ（１０−’モル／部位）を１ Ｑ−１ｓモルのエンドトキシンと一緒に注射すると、好中球蓄積の９０％阻害が 誘発される（第１９図）。反対にアクチノマイシンＤは、ＮＡＦ（１０−’モル ）またはｆＭＬＰ（１０ノモル）により誘発される好中球蓄積に対して影響を与 えない（第１９図）。

結果は、ＮＡＦがインビボ活性であり、好中球の用量依存性蓄積および炎症病変 部への血しょうのしん出を誘発することを示している。ＮＡＦのモル効力は、古 典的走化性物質Ｃ５ａおよびＬＴＢと同等であり、ｆＭＬＰよりも３〜５倍高い 。ＮＡＦにより誘発される好中球蓄積は、蛋白質合成阻害剤（アクチノマイシン Ｄ）の同時皮肉注射により阻害されない。すなわち、ＮＡＦ’は、エンドトキシ ンとは異なるが、走化性アゴニスト、例えばｆＭＬＰと同様に直接作用する。

実施例１８ ＮＡＦ誘発エキソサイト−シス（ウサギ好中球に対する作用）。

ウサギ好中球を、デキストラン沈降、次いでハイパークーフィコル密度勾配遠心 分離により末梢血液（耳静脈または動脈から得られた）から分離する。精製天然 ＮＡＦを使用する。

エキソサイト−シス条件＝　３７°で５分間サイトカラシンＢにより前処理され た０、６ｘ１０’細胞（０，１５１１２の全体積中）をＮＡＦ（０，１−１００ −）−１モル）またはｆＭＬＰ（１００す１モル）ｌ：より１５分間刺激する。

Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、すなわちアズール好性か粒マーカーを 細胞不含有培地において測定する。

結果を第５表に示す。

第５表 ＮＡＦ誘発エキソサイト−シス 刺激物質　　　濃度　　Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ（ｎＭ　　　（ ピコモル　　） 無し ＮＡＦ　　　　　　０．１　　　　　　　　５３１．０９９ １０．０　　　　　　　１３９ １００．０　　　　　　　１５７ ｆＭＬＰ　　　１００．０　　　　　　　１８１第４部二　組換えＮ　Ａ　Ｆ 実施例１９ エシェリヒア・コリにおけるＮＡＦの合成および発現。

ａ）オリゴヌクレオチド合成および精製。

オリゴヌクレオチドＯＮ　−１〜０Ｎ−６（第１３図参照）を、固体支持体、例 えばフラクトシル・シリカゲルまたは制御多孔質ガラス（ＣＰＧ）上、モノマー として３゛−β−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホアミド化ヌクレ オシドとの標準化学作用を用いた自動式ＤＮＡシンセサイザーにおいて合成する （Ｓ、Ｌ、ビューケージおよびＭ、Ｈ，カルサーズ、「テトラヘドロン・レター ズＪ２２［１９８１］１８５９、Ｎ　、　Ｄ　、ジーナ等、「ヌクレイツク・ア シッズ・リサーチＪ１２［１９８４コ４５３９）。

脱トリチル化材料を、室温で２５％アンモニアによる２時間処理により支持体か ら分離し、アンモニア含有溶液を２０時間５５°に加熱することにより保護基を 全て脱離させ、生成物を凍結乾燥する。

２０　Ｖ　７ｃｍで１２％アクリルアミド、０．３％ビスアクリルアミド。

７モル尿素、０．０８９モルのトリス−ボラート、０．０８９モルはう酸、０． ００２モルＥＤＴＡを用い１こポリアクリルアミド−ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ） により粗材料の分離を行う。蛍光シリカゲル・プレートにおける紫外線シャドウ ィングにより完全長のオリゴヌクレオチドを配置させ、ゲル部分を取り除き、溶 離チャンバにおいて電気溶離する。層線溶液を、バイオゲルＰ２カラム（３０Ｘ ０．９ｃｚ）において１０％エタノールで溶離することにより脱塩し、凍結乾燥 する。ＯＮ−１−ＯＮ−６の試料を３′Ｐ−γ−ＡＴＰおよびポリヌクレオチド キナーゼにより放射能標識する。ＰＡＧＥによる分析およびオートラジオグラフ ィーにより、それらが均一であることが確認される。修飾ろ紙上に固定したオリ ゴヌクレオチドのマクサム−ギルバート配列決定法により正しい配列を確認する （Ａ、ローゼンタール等、「ヌクレイツク・アシッズ・リサーチＪ１３［１９８ ５コ１１７３−１１８４）。

ｂ）アニーリングおよびライゲーション。

アニーリングおよびライゲーションするため、２５０ピコモル分量のオリゴヌク レオチドを、２０μＣのキナーゼ緩衝液中４μＣ１３！Ｐ−ＡＴＰ（５０００μ Ｃ４／ミリモル）および９単位のポリヌクレオチドキナーゼにより３７°で４０ 分間ホスホリル化しくＴ、マニアチス等、「モレキュラー・クローニング、ア・ ラボラトリ−・マニュアルｒｘ　９８２Ｆ、コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボラトリ−、ニューヨーク）、次いで５ミリモルの非標識ＡＴＰにより２０分 チュースを行う。７０°でｌμｇの０．５モルＥＤＴＡにより反応を止める。ホ ンソーブ２０カートリツジ（デュポン）吸着および２０％エタノールでの溶離に よりホスホリル化オリゴヌクレオチドを精製すると、収率は約９０％である。等 量の３０〜１００ピコモルの５°−ホスホリル化０Ｎ−２〜０Ｎ−５および非ホ スホリル化０Ｎ−１および０Ｎ−６の同時アニーリングおよびライゲーションを 、２５ミリモルＭｇＣ１ｔを含む２５μＣの緩衝液（１２５ミリモルのトリス− ＨＣｌ、ｐＨ７，６）中で行う。混合物を４分間９０°に加熱し、３時間以内で １４°に冷却し、さらに１４時間１４°でインキュベーションする。５０ナノモ ルのトリス−ＨＣｌ、ｐ）（７、６，１０ミリモルＭｇＣ１＊、１０ミリモルの ジチオトレイトール、１ミリモルのＡＴＰ、１６００〜２０００単位のＴ４−リ ガーゼ含有０　、１　Ｈ／！１１２うし血清アルブミンにより体積を６０μｇに 調節する。１４時間１４°でライゲーションを行い、１Ｆｇの０．５モルＥＤＴ Ａを加え、７０°に加熱することにより止める。フェノール抽出後、水溶液を０ ．３モル酢酸ナトリウム、０．０１モル酢酸マグネシウムに導入し、ＤＮＡをエ タノール沈澱させ、０　、５　＊ｘ厚さのゲルの１．５ｃｍスロット当たり１０ ’ピコモルＤＮＡの最大ローディングによるＰＡＧＥ（８％アクリルアミド、７ モル尿素）により生成物を精製する。

オートラジオグラフィーにより正しい長さの生成物を同定し、ゲル部分を削り取 り、Ｄ　Ｎ　、ＡをバイオトラップＢＴ１００中２００ｖで６時間電気溶離し、 エタノール沈澱させると、１００ピコモルのオリゴヌクレオチド当たり最終収量 ５〜８ピコモルの精製２本鎖ＤＮＡが得られる。

Ｃ）合成遺伝子のクローニング。

１１０ｎ９の分離合成ｘＡＦ遺伝子の試料を、２ＢＯｎ９のアガロース・ゲル− 精製５ｐｈｌ／ＢａｍＨＩ切断ｐＢＳ　　Ｍ２Ｓ−プラスミドＤＮＡ（ストラタ ジーン）とライゲーションする。このライゲーション混合物の１０分の１を用い ることにより、Ｄ、ハナハンの方法（「ジャーナル・オン・モレキュラー・バイ オロジーＪｌ　６６［１９８３］５５７−５８０）によりコンビ−テントにされ た２００μρのエシェリヒア・コリ株５に細胞の形質転換を行った結果、約３２ ０のアンピシリン耐性コロニーがインプットＤＮＡ１ｎ９につき生成される。６ クローンを抜粋し、Ｌ−ブロス／アンピシリン中で一夜生長させる。

プラスミドＤＮＡを製造しくＨ，Ｃ，ビルンボルムおよびＪ、ドリー、「ヌクレ イツク・アシッズ・リサーチＪ７［１９７９コ１５１３−１５２３）、１％アガ ロース・ゲル上で泳動させる。バンドを３ＭＭペーパー（ワットマン）に電気泳 動させ、エッペンドルフ管中に遠心分離することにより、純粋スーパーコイルＤ ＮＡを分離する。フェノール抽出およびエタノール沈澱後、Ｔ３およびＴ７プラ イマー（ストラタジーン）およびシーケナーゼ酵素を用いたアルカリ変性プラス ミド鎖末端方法によりＤＮＡを配列させる（Ｅ、Ｊ、チェノ等、ＤＮＡ±［１９ ８５］１６５−１７０）。

６クローンのうち３クローン、すなわちクローン１．２および６は、正しいＮＡ Ｆ配列を含んでいた。他の３つのクローンは誤った配列を有していた。クローン ３はＡＴＧ出発コドン後に挿入された余分のＧ残基を有していたため、完全コー ド配列は位相が異なっている。クローン５では、３４位においてＣ？Ｊ＜Ｔによ り置き換えられているため、停止コドンは６番アミノ酸の後に形成される。最後 に、クローン４は、１３位にＧを欠いている。この位置は、コード配列ではなく 、出発コドンおよびリポソーム結合部位間の領域に存在する。

正しい配列を含むプラスミド（クローン６）を、制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍ ＨＩにより切断し、前述の３ＭＭベーパーへの溶出により、２３７ｂｐフラグメ ントをアガロース・ゲルから分離する。次いで、このフラグメントを、左から右 に向かって、−ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位、−合成転写ターミネー タ−（ＣＣＣＧＧＧＣＧＡＴＧＡＡＴＣＧＣｃｃｃｃｃまたはＣＣＣＧＧＧＣＧ ＡＴＴＣＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧ）、 一ヌクレオチド６５１番の５ａｌＩ部位から複製開始点およびアンピシリン耐性 遺伝子を通り、ヌクレオチド０番のＥｃｏＲ１部位までのプラスミドｐＡＴ１５ ３の部分、 一エシェリヒア・コリ・トリプトファン・プロモーター、−プロモーターにおけ るリポソーム結合部位の約５塩基対下流に位置するＣｌａＩ部位 を含む線状Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントにライゲー゛ジョンする。

作成されたアンピシリン耐性発現プラスミド、すなわちｐ（Ｎ　Ａ　Ｆ　）−６ Ｔ３（第１４図）をＨ８１０１株のエシェリヒア・コリ細胞に形質転換する。

転写ターミネータ−は、エシェリヒア・コリにおけるＮＡＦの発現に不可欠では ない。それはエシェリヒア・コリ・ポリメラーゼにより生成されたＮ、ＡＰ−ｎ ＲＮＡを有効に終結させるため、発現の収量を高める。しかしながら、ＮＡＦは また、転写ターミネータ−をもたない同じベクターにおいて発現され得るが、そ の場合、収率は３０〜５０％未満である。

また、ＮＡＦをコードするこの合成遺伝子および同じ塩基性ペプチド配列をコー ドするが異なるヌクレオチド配列を有するかまたは様々な長さのペプチドをコー ドする他の遺伝子は、他のプロモーター、例えばラムダＰＬまたはエシェリヒア ・コリＬａｃもしくはＴａｃプロモーターを用いてエシェリヒア・コリにおいて 発現され得る。

またこれらの遺伝子は他のベクターを用いて導入され、他の生物、例えば酵母、 真菌、動物細胞、細菌セルライン、植物およびトランスジェニック高等生物にお いて発現され得る。

Ｃ）発現 エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩにおけるｐ（ＮＡＦ）−６Ｔ３の発現は、次の要 領で行なわれる。

前培養１ニー２０°に保たれたセルラインのグリセリン培養５０ｕＱを、１００ 　ｔｔ９／１１２アンピシリン含有無菌ＬＢ培地（１０９／Ｃトリプトン、５９ ／Ｉ２酵母抽出物、Ｉ　Ｏ９／（ｌＮ　ａＣ１）　１０　ｘ（ｌに加える。

この培養を、インキュベーター中３７°で８時間２０　Ｏｒｐｍで振り混ぜる。

前培養２：前培養１の培地から得た８ｘＱを、０．２％グルコース、０．５％カ サミノ酸（ディフコ）、２５１９／Ｑトリプトフアンおよび１００μ９７１１ア ンピシリンを含むＭ９培地（Ｊ、Ｈ，ミラー、［エクスベリメンツ・イン・モレ キュラー・ジェネティックスＪ［１９７２］コールド・スプリング・ハーバ−・ ラボラトリ−、ニューヨーク、４３１−４３３頁）１１２中に接種する。この培 養をインキュベーター中３７°で１５−１６時間２００　ｒｐｒｒｒで振り混ぜ る。

発酵ニア０Ｑの発酵槽中３５１２の作業体積で主発酵を行う。前培養２の場合と 同じ培地を使用するが、例外として５ｚｙ＃のみのトリプトファンを加える。前 培養２をこの培地に接種し、３７°で６０Ｏｒ＋ｍ（ＯＤｅ。。）での光学密度 が２．８に達するまで発酵を続行する。

０Ｄ−ｏｏが２．８に達すると、エタノール中インドールアクリル酸を加えて最 終濃に２０１１９／（ｌとする。４時間後、ＯＤ　ｅ。。は１３，５に増加する 。遠心分離により５１６１？の沈澱物が得られる。

ｄ）組換えＮＡＦの精製 組換え体ＮＡＦ含有エシェリヒア・コリ細胞を一２０°で貯蔵する。１００９の バッチを、５０ミリモルＮａＣ１を含む２０ミリモルのトリス−ＭＣＩ、１）Ｈ ８，０１１００１！（！により洗浄し、同緩衝液２５０１１１１２に再！！Ａ濁 し、フレンチ・プレス（アミンコ）中２５００ｐｓｉで崩壊させる。４０分間４ ７０００ｇでの遠心分離後、沈澱物を同緩衝液に再懸濁し、再遠心分離し、−２ ０°で貯蔵する。ｌｏｙ分量を１００ｘ６の５０ミリモルＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐ Ｈ６，５，６Ｍグアニジン−Ｈｏｆｆに懸濁し、１時間撹はんし、’０．５％酢 酸に対して透析する。透析物を遠心分離により透明にし、アリコートに分けてモ ノ−Ｓカラム（ＨＲ５１５、ファルマシア）に仕込む。０．２モルＮａＣ１を含 む５０ミリモルＭＥＳ−ＮａＯＨ，ｐＨ６，５によりカラムを洗浄し、同緩衝液 中−次勾配により（０，２〜０．５モルＮａＣ１）０゜５ｘ（２／分の速度で溶 離する。最高のＮＡＦ含有量を有するフラクションをプールし、１峠／分の流速 で２０〜６０％アセトニトリル勾配により０．１％トリフルオロ酢酸中、上孔逆 相ＨＰＬＣカラム（０゜４６×１２５ｘｘバイダツクＣ４ＴＰ）によるクロマト グラフィーを行う。

第５部：　天然および組換えＮＡＦの同定実施例２０ 物理化学的同定。

）（ＰＬＣから回収された５ＡＰ（実施例１９参照）は、２つの基準に基づき純 粋であると考えられる。銀染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、天然ＮＡＦ と一致する単一バンドを示しくレーン２におけるＨＰＬＣビーク・フラクション から得た組換えＮＡＦ１μ９対レーン３における天然ＮＡＦ１μり、分子量標準 はレーンｌにおけるチトクロムｃ［１２，５ｋｄｌおよびアプロチニンＥ６　、 ５　ｋｄ二１）、ぎ酸（開裂したペプチドはアミノを生ずる）およびカルボキシ 末端配列のエドマン分解法は、７２−アミノ酸天然ＮＡＦの場合と一致する。

アミノ酸分析は配列から予想される組成と一致している。メチオニンは見出され ず、この残基が恐らくは細菌により除去されることを示している。

実施例２１ 生化学的同定。

天然および組換えＮ　Ａ　Ｆをヒト好中球において平行して試験する。

それらは細胞質ゾル遊離Ｃａ’十において事実上同一の変化を引き出し、３ナノ モル程度の低濃度で最大上昇をもたらす（第１５図）。化学発光による評価によ ると、はぼ同一の濃度依存性呼吸バースト応答が１〜３０ナノモルの範囲で画調 製物により得られる。天然および組換えＮＡＦ間の均等性はまた、走化性および エキソサイト−シス測定により表される。走化性移動は０．１ないし１０ナノモ ルの間で観察され、最大効果は１ナノモルで得られる（第６表）。いずれかのペ プチドにより、０，３ナノモルで特異か粒からのビタミンＢ、。

−結合蛋白質および１ナノモルでアズール好性か粒からのベーターグルクロニダ ーゼの顕著な放出が観察される。この効果は、第７表に示された刺激物質濃度に より増加する。

第６表 ＮＡＦ誘発好中球走化性 Ｎ　Ａ　Ｆ　（ｎＭ）　　　　ｎａｔ　　　　　　　　　ｒｅｃＯ，１９８：６ 　　　　　８８出６ １．０　　　１２３云６　　　１２４±３１０．０　　　１２７：ｌ：３　　　 　１２６＝４値は、リーディング・フロント移動の平均士標準偏差（μｌ）を表 す（ｎ＝３）。走化性刺激物質の非存在下におけるランダム移動は６１±５μｍ である。ｎａｔ　＝天然ＮＡＦｓ　ｒｅｃ＝１１Ｆｌ換えＮＡＦ。

第７表 Ｎ　Ａ　Ｆ誘発エキソサイト−シス ビタミンＢｌｔ−結合蛋白質　ベーターグルクロニダーゼＮＡＦ（ｎｌ＋ｌ　　 　　　ｎａｔ　　　　　ｒｅｃ　　　　　　　ｎａｔ　　　　　ｒｅｃＯ，３７ ，８±３．６　　　５．４出２．８　　　１．１±０．８　　　０．８±０．６ ３．８　　　２１．９±４．２　　２０．２出３．７　　８．２出１．９　　７ ．１±１．７３０．０　　　２ｇ、４±３．７　　２８．１±３．８　　１４． ２±２．１　　１２．９±２．９天然（ｎａｔ）または組換え（ｒｅｃ）Ｎ　Ａ 　Ｆにより１０分間刺激されたサイトカラシンＢ前処理好中球（４ＸＩＱ’細胞 ／酎）からの放出パーセント。対応する非刺激対照からの放出が誘引される。平 均出標準偏差（ｎ＝３）。

ＦＩＧ、１ 判御り肯り竿イ士Ｌ ＦＩＧ、　２ シト日）ヒ１′５（与・トコジ （ａ子）　　　　　　　　　　　＜Ｆ３りΔ３ＨｔＣｐｍ×１０−”　　−ｅＰ −ｅＰＦＩＧ、　４ ふ宅ト声ンｔ　神戸＝７　　（分） 頃ル ＦＩＧ、　７ ７う７シヲ〉１１号 ＦＩＧ、　８ 謄触Ｂ！間【廼 ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、　１１ ＦＩｏ　　１３ ＭＩＩｔ　　Ｓ＠ｔ　　ｋＬａ　　ＬＹ跡　＋ｍｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｇ　　Ｃ ｙｍ　　ＧＬＩＩ　　Ｃｙｍ　　Ｈａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ@テｙｒ　　５ｔｒ 　　Ｌｙｓ　　。

Ｐｒｏ　Ｐｈ＠）＋１ｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ｔｈｅ　！ｌ＠Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　Ｌ ｅｕλｒｇ　ｖｌｌｌ　！ｌｅ　Ｇｌｕ　１ｉｅｒ　にｌｙ@Ｐｒｏ　Ｈｌｍ　 Ｃｙｓ＾１ａ ２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３゜＾ｌｌｎ　丁ｈｒ 　Ｇｌｕ　　！ｌ＠　　工１＠　Ｖａｎ　　Ｌｙｅ　Ｉｘｕ　　！＠ｒ　　入ｍ ｐ　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅ普@Ｃｙｓ　　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　　Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　　Ｃ１，ｕ４０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　Ｂ６ＦＩＧ、１４ 数／ｆ７　　ｘｌｏ　　　　Ｑｕｉｎ−２ｅ’ｔ−ｏ度ＦＩＧ、１６ ＮＡＦ　　　　　　　　　　　　エントトキンンメコ看￥　（１４；フイ立ヒ「 ンンＱ−１ｏ１ｃ＋し２ＦＩＧ、　１７ 人工里（１吾Ｐ）ガク「ジノの−ｔｏｌ’ｉルｆ欠２ＦＩＧ、　１８ ”　　　　　　　　＋ＰＭＢ　　　　＋ＰＭ８　　　　＋ＰＭ８に捏 ＦＩＧ、　１９ ÷へ〇　　　　÷ＡＤ　　　　　＋ＡＯ人捏 国際調査報告 一一−−鵠１＾−−−・−Ｎ−ＰＯＴ／ΣＰ　　８Ｂ１０１０２５

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. （１）好中球活性化因子（ＮＡＦ）。
2. （２）ヒト単核白血球から誘導される、請求項１記載のＮＡＦ。
3. （３）下記の完全アミノ酸配列を有する請求項１記載のＮＡＦ。 【配列があります】
4. （４）下記に示した通り延長されたアミノ末端を有する請求項３記載のＮＡＦ。
5. （５）下記に示した通り短縮されたアミノ末端を有する請求項３記載のＮＡＦ。 【配列があります】
6. （６）下記に示した通り短縮されたアミノ末端を有する請求項３記載のＮＡＦ。 【配列があります】
7. （７）請求項３〜６に示された配列のうちの２つまたはそれ以上を有する蛋白質 の混合物により構成される請求項１記載のＮＡＦ。
8. （８）請求項３で同定されたＮＡＦ約７０％、請求項４で同定されたＮＡＦ約１ ７％、請求項５で同定されたＮＡＦ約８％および請求項６で同定されたＮＡＦ約 ５％から成る混合物により構成される、請求項７記載のＮＡＦ。
9. （９）合成体である、請求項１記載のＮＡＦ。
10. （１０）組換え体である、請求項９記載のＮＡＦ。
11. （１１）生物学的に活性である、請求項９記載のＮＡＦ。
12. （１２）請求項３〜６のいずれか１項に示された配列のいずれか１つを有する、 請求項９記載のＮＡＦ。
13. （１３）分子量が約８５００であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける見かけ上の分子 量が約６５００であり、等電点が約８．６である、請求項２または９記載のＮＡ Ｆ。
14. （１４）ヒト単核白血球培養の上清からクロマトグラフィーにより精製し、回収 することを含む、請求項１記載のＮＡＦの製造方法。
15. （１５）ホスホセルロース・クロマトグラフィーを含む、請求項１４記載の方法 。
16. （１６）ヒドロキシアバタイト・クロマトグラフィーを含む、請求項１４記載の 方法。
17. （１７）ヘパリン−セファロース・クロマトグラフィーを含む、請求項１４記載 の方法。
18. （１８）Ｃ４カラム逆相ＨＰＬＣを含む、請求項１４記載の方法。
19. （１９）ＣＮ−プロピル・カラム逆相ＨＰＬＣを含む、請求項１４記載の方法。
20. （２０）請求項１５〜１９のクロマトグラフィー方法のうちの２つまたはそれ以 上の組み合わせを含む、請求項１４記載の方法。
21. （２１）クロマトフォーカシングによる精製を含む、請求項１４記載の方法。
22. （２２）対応するオリゴヌクレオチドの合成、精製およびライゲーション、生成 した合成ＮＡＦ遺伝子のクローニング、発現並びに回収および精製を含む、請求 項９記載のＮＡＦの製造方法。
23. （２３）エシェリヒア・コリにおける発現を含む、請求項２２記載の方法。
24. （２４）オリゴヌクレオチドＯＮ−１〜ＯＮ−６のいずれか１つの使用を含む、 請求項２２記載の方法。
25. （２５）発現ベクターｐ（ＮＡＦ）−６Ｔ３の使用を含む、請求項２２記載の方 法。
26. （２６）請求項１０記載のＮＡＦのエシェリヒア・コリにおける発現に適した、 発現ベクターｐ（ＮＡＦ）−６Ｔ３およびその均等物。
27. （２７）請求項１０のＮＡＦのエシェリヒア・コリにおける発現に適した、第１ ３図に示されたヌクレオチド配列を有するＤＮＡおよびその均等物。
28. （２８）ｃＤＮＡである、請求項２７記載のＤＮＡ。
29. （２９）請求項３〜６のいずれか１項記載のＮＡＦをコードするＤＮＡにより形 質転換されたセルライン。
30. （３０）治療に使用される、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＮＡＦ。
31. （３１）多形核細胞−好中球の数または活性化状態の修飾に伴うか、またはこれ を原因とする状態の処置において使用される、請求項１〜１３のいずれか１項記 載のＮＡＦ。
32. （３２）多形核細胞−好中球の数または活性化状態の上昇により臨床的改善が為 される状態の処置において使用される、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＮ ＡＦ。
33. （３３）細菌、マイコプラズマ、酵母および真菌またはウイルス感染症において 使用される請求項１〜１３のいずれか１項記載のＮＡＦ。
34. （３４）炎症疾患に使用される、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＮＡＦ。
35. （３５）乾せん、関節炎状態もしくはぜん息、異常に低い好中球数および／また は低い好中球レベルの状態、またはこれらの適応症で使用されるきっ抗物質の製 造に使用される、請求項１〜１３のいずれか１項記載のＮＡＦ。
36. （３６）常に請求項１４〜２５のいずれか１項記載の方法により得られる、請求 項１〜１３のいずれか１項記載のＮＡＦ。
37. （３７）請求項１〜１３のいずれか１項記載のＮＡＦを、医薬的に許容し得る担 体または希釈剤と一緒に含有する医薬組成物。
38. （３８）処置を必要とする対象に対する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の ＮＡＦの治療有効量の投与を含む処置方法。
39. （３９）この出願の明細書および／または請求の範囲において個々または集合的 に示された工程、態様、組成物および化合物、並びに前記工程または態様の２つ もしくはそれ以上または幾つかもしくは全部の組み合わせ。