HU205617B - Process for producing neturophyl-activating factor, gene coding this and pharmaceutical composition - Google Patents

Description

A találmány egy immunmodulátorra vonatkozik, még közelebbről egy olyan immunstimuláló faktorra, amely humán neutrofil leukociták aktiválására képes, s ennélfogva neutrofílaktíváló faktornak (neutrophil-activating factor - NAF) nevezzük.

A neutrofil leukociták (neutrofilek) a legközönségesebb A neutrofil leukociták (neutrofilek) a legközönségesebb leukociták és az emberi vérben a fehérvérsejteknek körülbelül kétharmadát teszik ki. Egy fő funkciójuk van, megvédeni a gazdaszervezetet a mikrobiális fertőzésekkel szemben. A neutrofilek mozgékonyak, válaszolnak a fertőzések által kiváltott kemotaktikus stimulusokra és képesek a fertőzött szövetekhez vándorolni, hogy ott elpusztítsák a mikroorganizmusokat. Az elölést a neutrofileknek az a képességük okozza, hogy elnyelik a mikroorganizmusokat és hogy oxigéngyököket és mikrobicid enzimeket választanak ki [B. M. Babior, New Engl. J. Med., 298,659-668 (1978) és M. Baggiolini, Experientia, 40, 906-909 (1984)]. Ezeknek az anyagoknak a kibocsátása a neutrofilek aktiválásától függ. Tehát az olyan anyagok, mint az itt leírt neutrofilaktiváló faktor, a neutrofilaktiválás fokozására és ennélfogva az emberi szervezetnek a mikroorganizmusokkal szembeni védekező mechanizmusa fokozására használhatók.

Azt találtuk, hogy a humán monociták egy faktort szekretálnak, amely humán neutrofilekben exocitőzist és respirációs robbanást (oxigéngyök-képződés és enzimkiválasztás) indukál és így olyan neutrofilaktiváló tulajdonságokat fejt ki, amelyek az antimikrobiális hatás szempontjából fontosak.

A faktor előállítható stimulált humán monociták folyékony tenyészetéből, molekulatömege feltehetően körülbelül 6000, pontosabban körülbelül 6500, SDSgél-elektroforézis alapján.

A monociták, hasonlóan a neutrofilekhez, fagocitasejtek. A neutrofilekkel szemben azonban a monociták hosszú életűek. A vérből elvándorolnak a szövetek minden lehetséges részébe, ahol makrofágokká alakulnak. A monociták makrofágokká való transzformációja sejttenyésztési kísérletekben is megfigyelhető. A szövetekben a makrofágok különböző funkciókat látnak el, ilyen főleg a nemkívánatos anyagok fagocitózisa és nagyszámú peptid és protein termelése, amelyek szekretálódnak. A makrofágok a fennálló fertőzés helyén gyűlnek össze és így ezeken a helyeken az ezen sejtek által termelt NAF fokozhatja a neutrofilek védekező (host-defence) képességét, s így patofiziológiailag fontos funkciójuk van.

A NAF-ot neutrofilaktiváló tulajdonságok jellemzik, azaz indukálja az ún. respirációs robbanást (respiratory burst) oxigéngyökők termelésével és indukálja az enzimkibocsátást. Molekuláris szinten a NAF-ra a következő tulajdonságok jellemzőek: molekulatömege minden bizonnyal körülbelül 6500 SDS-gél-elektroforézis alapján, izoeléktromos pontja közelítőleg 8,6, 80 °C-ig hőre rezisztens és még számos denatruáló szerrel szemben is, de érzékeny a proteázokra, amiből arra lehet következtetni, hogy a NAF egy polipeptid. A NAF hasonló módon hat a humán neutrofilekre, mint a két ismert kemotaktikus stimuláló anyag, a C5a anafilatoxin és az N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenil-alanin (fMLP) bakteriális peptid, de egy olyan felületi receptor közvetíti, amelyhez a NAF hozzákötődik és amely humán neutrofilek bármelyik ismert hatóanyagának receptorától különbözik. A NAF humán monociták tenyészetében termelődik, de nem termelik a humán limfociták. A termelés stimuláló anyag jelenlétének a függvénye - ilyen anyag a bakteriális lipopoliszacharid (EPS), a fitohemagglutínin (PHA) vagy a konkanavalin A (ConA) - továbbá függ a stimulátor koncentrációjától és az inkubációs időtől. Gátolja a termelést a cikloheximid, jelezvén, hogy egy protein de novo szintéziséről van szó.

Ahogy már kifejtettük, a monociták és a makrofágok gazdag forrásai a különféle bioaktív peptideknek és proteineknek [C. F. Náthán, J. Clin. Invest, 79, 319— 326 (1987)]. Megállapították, hogy ezek a sejtek három különböző citokint állítanak elő: interleukin-1 (ΚΙ), tumor nekrózis faktor (TNF) és α-interferon (IFNa). Számos közlemény jelent meg, amelyek bemutatták, hogy a monociták és a makrofágok olyan faktorokat is termelnek, amelyek a neutrofilekre hatnak és ezek különböznek a már fent említettektől. Minthogy ezek a neutrofilekre hatnak, a faktorokat részletesebben mutatjuk be. Különböző közlemények ismertették, hogy az alveoláris makrofágok olyan faktorokat bocsátanak ki, amelyek a neutrofilekre kemotaktikus hatást gyakorolnak [J. A. Kazmierowski és mtsai, J. Clin. Elvest., 59, 273-281 (1977); W. W. Merrill és mtsai, J. Clin. Invest., 65, 268-270 (1980); G. W. Hunninghake és mtsai, J. Clin. Invest., 66, 473-483 (1980)] és amelyek fokozzák a tüdőben az antimikrobiális védekezőképességet. Továbbá bemutatták, hogy ezek a faktorok erősítik a neutrofilek mikrobicid hatását [J. E. Pennington és mtsai, J. Infect. Dis. 148, 101-109 (1983) és J. Clin. Invest., 75,1230-1237 (1985)]. A gélszűréssel és kromatofokuszálással való tisztítás egy olyan proteázra érzékeny faktor (neve: NAF) azonosításához vezetett, amelyet az alveoláris makrofágok termelnek, molekulatömege 6000 és izoeléktromos pontja 7,6. E faktorról közölték, hogy gyengén kemotaktikus és hogy a neutrofilek által fagocitált baktériumok elpusztítását fokozza, nem indukálja azonban oxigéngyökök termelését vagy enzimek kibocsátását. Az antimikrobiális hatás növekedésének hasonló mechanizmusáról írtak más szerzők [A. Ferrante és mtsai, Clin. Exp. Immunoi., 56, 559-566 (1984)], akik kimutatták, hogy a humán neutrofilekhez hozzá kellett adni monocitáktól vagy makrofágoktól származó tenyészlevet, hogy a Neigleria fowleri elpusztítására késztessék. Más laboratóriumok [A. Kapp és mtsai, ! Invest. Dermatol., 86, 523-528 (1986) és F. E. Maly és mtsai, Lymphokine Rés., 5, 21-33 (1986)] LPS-sel stimulált humán monociták által termelt granulocitaaktiváló mediátorokat (granulocyte-activating mediator=GRAM) ismertettek. Két GRAM-fajtát írtak le, a nagyobbik molekulatömege 60000-nek bizonyult, a kisebbik molekulatömege 10 000 volt, s ez humán neutrofil sejteknél egy késleltetett respirációs robbanást indukált válaszként, amint

HU 205 617 Β ezt kemilumineszcenciával kimutatták. Ezek a faktorok hőre és tripszinre érzékenyek, képződésük a monociták LPS-sel való stimulációjától és kétségtelenül de novo proteinszintézistől függ.

Számos közlemény írt le olyan monocita és/vagy makrofág eredetű faktorokat, amelyek neutrofilekkel szemben kemotaktikus hatást fejtenek ki. A „mononukleáris sejt eredetű kematoxin” (mononuclear cell-derived chemotaxin=MOC) elnevezésű faktor kétségtelenül egy 10 000 molekulatömegű peptid, amely a leírt GRAM-tól különbözik [E. Kownatzki és mtsai, Clin. Exp. Immunoi., 64, 214-222 (1986)]. J. Immunoi., 139, 250-256 (1987)-ben közölnek egy olyan cDNS kiónt, amely humán leukocitagéneket kódol, például a kiónok egyike a 99 aminosavból álló humán β-tromboglobulint. A protein kifejezését és biológiai aktivitásának vizsgálatát azonban nem írják le. A FEBS Lett., 236 (2), 467-470 (1988)-ban (1988. augusztusban) 8 805 070 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentésünk benyújtása után közöltek egy 72 aminosavból álló peptidet, amelynek aminosav-szekvenciája azonos a találmányunk szerint előállított NAF szekvenciájával. Szintén ismert egy olyan neutrofil kemotaktikus faktor, amelyet LPS-sel stimulált humán vér eredetű monociták termelnek. A faktor molekulatömege körülbelül 10000 és izoelektromos pontja 8-8,5 [T. Yoshimura és mtsai, J. Immunoi., 139, 788-793 (1987)]. Végül ugyancsak közölték, hogy patkány peritoneális makrofágok, ha tenyészetüket LPS-sel stimulálják, szelektív neutrofil kemotaktikus faktort bocsátanak ki [F. Q. Cunha és mtsai, J. Med. Bioi. Rés., 19,775-777 (1986) és Eur. J, Pharmacol., 129, 65-76 (1986)].

A biokémiai információk - amelyeket a fenti közlemények tartalmaznak - előzetes volta miatt lehetetlen a különböző leírt faktorók közti szerkezeti hasonlóságok és különbségek felett találgatásokba bocsátkozni.

A jelen találmány által igényelt prioritási dátum(ok) után Damme és mtsai [J. Van Damme és mtsai, J. Exp. Med., 167, 1364-1376 (1988)] egy, a NAF-nak valószínűleg megfelelő peptid tisztítását ismertették, továbbá Gregory és mtsai [H. Gregory és mtsai, Biochem. Biophys. Rés. Comm., 890-893 (1988)] a NAF szekvenciájával azonos szekvenciájú peptidet írtak le, melyet lektinnel stimulált humán limfociták felülúszójából tisztítottak. Az MDNCF-et (monocyte derived neutrophyil chemotactic factor) kódoló cDNS-t [T. Yoshimura és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 9233-9237 (1988)] nemrég klónozták [K. Matsushima és mtsai, 1, Exp., Med., 167, 1883-1893 (1988)] és megállapították, hogy a 3-10C cDNS-nek [J. Schmid és C. Weissmann, J. Immunoi., 139, 250-256 (1987)] felel meg. Schmid és Weissmann kimutatták, hogy a 3-10C cDNS által meghatározott peptid a trombocita faktor 4-gyel, a béta-tromboglobulinnal, a kötőszövet aktiváló peptid IH-mal (connective tissue-activating peptide III=CTAP-III) és az interferon-gammával indukálható peptiddel (interferon-gammainducible peptide=gamma-IP-10) szerkezeti homológiát mutat. Ezek a molekulák ugyancsak homológok egy 73-csoportból álló peptiddel (melanóma growth-stimulating activity = MGSA), melynek melanómanövekedést stimuláló tulajdonságai vannak [A. Richmond és mtsai, EMBO J., 7,2025-2033 (1988)] és amelynek a szekvenciája nagyon hasonló a fibroblasztokból izolált grocDNS-ből levezetett szekvenciához [A. Anisowicz és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 7188-7192 (1987)]. Ugyancsak leírtak [G. Davatelis és mtsai, J. Exp, Med., 167,1939-1944 (1988)] egy patkányfélékben található makrofágból származó gyulladáskeltő proteint (macrophage-derived inflammatory protein=MIP), amely valószínűleg a fent leírt proteinekkel van rokonságban, és úgy tűnik, hogy a RANTES-t - IL-2 függő, antigénspecifikus humán T-sejt klónokból izolált cDNS-nek 8 kD molekulatömegű terméke [T. J. Schall és mtsai, J. Immunoi., 141, 1018-1029 (1988)] magába foglaló peptidek családjának egy tagja. Ezeknek a peptideknek a funkciója teljesen ismeretlen, Megállapították, hogy az MGSA és a CTAP-III [C. W. Castor és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci., 80, 765-769 (1983)] mitogén hatású és a trombocitafaktor 4 immunmodulációs hatásokat fejt ki [A. D. Barone és mtsai, J. Bioi. Chem., 263, 8710-8715 (1988)].

A kapott eredményekből arra lehet következtetni, hogy a NAF szelektíven aktiválja a neutrofileket egy olyan receptor közvetítette folyamat révén, amely hasonló a kemotaktikus hatóanyagok által megindított folyamatokhoz.

A jelen találmány szerinti NAF humán neutrofilsejtekben oxigéngyök-képződést és enzimkibocsátást indít meg egy minden eddig leírt receptortól eltérő szelektív receptoron keresztül kifejtett hatása révén.

Meghatároztuk az LPS-sel stimulált humán monocitákból tisztított NAF teljes aminosav-szekvenciáját, szintetizáltuk a fő NAF-fajtákat kódoló gént és kifejeztük, mint rekombináns peptidet, amely ugyanolyan neutrofilaktiváló tulajdonságokkal rendelkezett, mint a természetes homológ peptid.

Tehát a találmány tárgya a NAF és a NAF izolálása olyan természetes forrásokból, mint a humán monociták.

A találmány ezenkívül a szintetikus, főként rekombináns NAF-ra, továbbá a NAF előállítására és expressziójára is vonatkozik.

A NAF teljes aminosav-szekvenciáját ismert szekvenálási módszerekkel határoztuk meg:

Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Th r-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-GluLeu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-His-Cys-Ala-AsnThr-Glu-Ile-Ile-Val-Lys-Leu-Ser-Asp-Gly-Arg-GluLeu-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln-Arg

-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys-Arg-Ala-Glu-Asn-Ser.

A teljes protein és az SH-metilezett és amino-szukcinilezett NAF hasítása után kapott T 7-26 és T-27-47 tripszines fragmentumok Edman-lebontásával jutottunk a szekvencia 47. pozíciójáig. Hidrolízissel - 75%os hangyasavval - és Edman-lebontással két 20 aminosavból álló közel ekvimoláris szekvenciát kaptunk, valamint egy egyedi képletet, amely a NAF 20. pozíción túli aminoterminális szekvenciájának felel meg. Az A 53-72 karboxiterminális peptidszekvenciát levonással

HU 205 617 Β határoztuk meg, s ezt a T 61-72 tripszines peptid analízisével bizonyítottuk. A karboxipeptidáz-A és -B nem adott kimutatható hasítási terméket, de amikor 1 nmól NAF-ot karboxipeptidáz-Y-nal kezeltünk, 120 pmól szerint szabadult fel, jelezvén, hogy szerin a karboxiterminális.

A különböző NAF-sarzsok analízise aminoterminális heterogenitást mutatott ki. A fenti szekvencia képezi a jelentősebb komponenst (mintegy 70%), amelyről azt gondoljuk, hogy a leginkább felelős a biológiai hatásokért. Három további variánst lehetett azonosítani:

Szekvencia-1 (körülbelül 17%):

Ala-Val-Leu-Pro-Arg-Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-ArgCys-Gln-Cys-He-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-HisPro-Lys-Phe-He-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-SerGly-Pro-, azaz a fenti teljes szekvencia az N-terminálisnál tovább terjed az Ala-Val-Leu-Pro-Arg-szekvenciával (így a teljes protein 77 aminosavat tartalmaz).

Szekvencia-2 (körülbelül 8%);

Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-TyrSer-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-LeuArg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Proazaz a fenti teljes szekvencia az N-terminálisnál megrövidül a Ser-Ala-aminosavakkal (tehát a teljes protein 70 aminosavat tartalmaz).

Szekvencia-3 (körülbelül 5%):

GIu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-SerLys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-He-Lys-Glu-Leu-ArgVal-He-Glu-Ser-Gly-Pro-, azaz a fenti teljes szekvencia az N-terminálisnál a Ser-Ala-Lys-aminosavakkal megrövidül (tehát a teljes protein 69 aminosavat tartalmaz).

Ezeket a szekvenciákat a 3-10C cDNS-ből levezethető, 99 aminosavból álló szekvenciához lehet illeszteni [J. Schmid és C. Weissmann, J. Immunoi., 139, 250-254 (1987)]. AfőNAF-peptid a 3-10C aminosavszekvencia 28-tól 99-ig terjedő pozícióinak felel meg, míg a fenti három változat ennek 23. (szekvencia-1),

30. (szekvencia-2), illetve 31. (szekvencia-3) pozíciójánál kezdődik.

A 3-10C-ből származtatott szekvenciának a fenti szekvenciaadatokkal való összehasonlításából az a következtetés vonható le, hogy a mononukleáris fagociták egy NAF-prekurzort szintetizálnak, amely intracellulárisan készül el. A 77-csoportból álló peptid valószínűleg a NAF legynagyobb szekretált formáját reprezentálja, mivel ez felel meg a cDNS-ből származtatott szekvenciának mínusz a feltehetően 22 aminosavból álló szignál peptid. A legfontosabb 72-csoportból álló NAF-fajták és a 70 és 69 csoportból álló analóg peptidek további poszttranszlációs módosulások révén keletkezhetnek.

A NAF minden formája négy ciszteincsoportot tartalmaz, amelyek valószínűleg láncközi diszulfid hidakat képeznek. Úgy tűnik, hogy e hidak az aktivitás szempontjából fontosak, mivel úgy találták, hogy a merkaptoetanolnak gátló hatása van [P. Peveri és mtsai, J. Exp. Med., 167, 1547-1560 (1988)]. A diszulfid hidak feltehetően a 7-34 és 9-50 pozíciókat kötik össze, mint ahogy a béta-tromboglobulinban és a trombocitafaktor 4-ben, amelyek részben homológok a

NAF-fal.

A béta-tromboglobulinnal való homológiának megfelelően a NAF-ban két intramolekuláris diszulfid híd van. Tehát a számított molekulatömeg 8.383.7, ami jóval magasabb, mint az SDS-gél-eléktroforézissel meghatározott molekulatömeg.

A NAF termelése természetes alapanyagokból, ilyenek a monociták, gyenge kihozatalt eredményez és hosszan tartó, bonyolult tisztítási lépéseket igényel.

Annak érdekében, hogy a NAF-ot nagyobb mennyiségben és jobb kitermeléssel lehessen termelni, szintetikus eljárásokra, például teljes kémiai szintézisre és rekombináns DNS-technológiára van szükség. A szintetikus NAF előállítása - például rekombináns DNSeljárásokkal - beleértve a kifejeződést egy prokarióta vagy eukarióta expressziós rendszerben - például E. coliban - szintén a találmány részét képezi. A szintetikus NAF-nak, például a baktériumokból izolált rekombináns NAF-nak a természetes NAF-fal azonos aminosav-szekvenciája (szekvenciái) van (vannak) és ugyanolyan biológiai tulajdonságokkal és hatásokkal rendelkezik. A „rekombináns NAF” rekombináns DNS-eljárásokkal kapott NAF-ot jelent.

A rekombináns NAF-nak rekombináns DNS-módszerekkel való előállítását ismert eljárások szerint végezzük, ilyenek a szintézis, a megfelelő oligonukleotidok tisztítása és ligálása, a szintetikus NAF-gén klónozása, például E. coliban való kifejezése és végül a rekombináns NAF kinyerése és tisztítása. Például: a 72 aminosavból álló NAF-ot kódoló gént szintetizáljuk előnyösen kodonoptimalizálással - majd klónozzuk és E. coliban kifejezzük.

A nyers bakteriális kivonatok Western blot-analízise - a vizsgálatban természetes NAF-fal szembeni antiszérumot használunk - egyetlen sávot eredményez, amely a természetes NAF-fal együtt vándorol. A homogenitásig tisztított rekombináns NAF amino- és karboxiterminális szekvenciája identikus a 72_:aminosavas NAF-éval. Humán neutrofilsejteken végzett vizsgálatokban azt találtuk, hogy a rekombináns NAF ugyanolyan aktivitású és hatékonyságú, mint a természetes NAF, a kemotaxis indukciója, a szabad citoszol Ca²⁺tartalom gyors emelése, a respirációs robbanás aktiválása és a specifikus azurofilgranulum-tartalom kibocsátása szempontjából.

A 13. ábra egy szintetikus NAF-gén vázlatát mutatja be. A 3-10C cDNS kódoló szekvenciáján változtatások találhatók az E. coliban való kifejeződés megkönnyítése céljából. A gén 3’-végén a természetben előforduló TAA terminátort a TAATAATGA hármas terminátor helyettesíti és ettől közvetlenül downstream egy BamHI helyet fűztünk hozzá. Az 5’-végen Sphl és Clal helyet létesítettünk, hogy lehetővé váljék a kiónozó, illetve expressziós vektorba való beépítése. A 34. bázisnál egy Taql restrikciós helyet létesítettünk az 5’vég későbbi manipulálása végett azáltal, hogy az AGA Arg kodont CGA-val cseréltük ki.

A blokkonként való összekapcsolás (1-2,3-4 és 5-6

HU 205 617 Β oligonukleotidok) nem előnyösebb, mint mind a hat oligonukleotid egyidejű ligálása. Az Összes oligonukleotid 5’-foszforilálása a kívánt nagyságnál nagyobb ligációs termékeket eredményez, de ha a terminális oligonukleotidokat (1 és 6) nem foszforiláljuk, a legnagyobb molekulatömegű termék a teljes gén lesz, 248/240 bázissal. A gént a pBS M13' vektor Sphl7BamHI helyére építjük be (ligázzal), s ezzel E. coli sejteket transzformálunk. A kapott 6 ampicillin rezisztens telepből izoláltuk a plazmid DNS-t, ezt Clal/BamHI-gyel hasítottuk, s így minden esetben egy 237 bp sávot kaptunk 1,4%-os agarózgélben. A DNS szekvenálásával kimutattuk, hogy a kiónok a korrekt szekvenciát tartalmazták. Egy korrekt klón ClAI/BamHI sávját a gélből eltávolítjuk és beklónozzuk a pIL402/Term/Trp promoter vektorba. Az expressziós megnövelésének egy lehetséges eszköze gyanánt szintetikus transzkripciós terminátort (lásd a 17. példát) vihetünk be ebbe a vektorba úgy, hogy rákapcsoljuk a humán GM-CSF-gén 3’-végéhez, a BamHI-helynél. (GM-CSF=granulocyte-monocyte colony stimulating factor). A NAF-gén tehát ezen BamHI- és Clal-hely közé van beépítve a promoterben lévő transzkripcióindító helytől downstream irányban, a GM-CSF-gént helyettesítendő. A kapott NAF expressziós plazmidot p(NAF)-6T3 - a 14. ábrán mutatjuk be.

A p(NAF)-6T3 plazmidot tartalmazó indol-akrilsavval indukált E. coli sejtek kivonatainak ezüst festése és Western biot analízisével egy olyan peptid idő-függő termelődése mutatható ki, amely együtt vándorol a természetes NAF-fal és egy természetes NAF-fal szembeni antiszérummal reagál.

A fenti expressziós rendszer a fent említett NAF-variánsok vagy más, biológiailag aktív NAF-fragmentumok - mint amilyenek az aminoterminálisan csonkított fragmentumok - előállítására is felhasználható.

A NAF biológiai tulajdonságai fajspecifikusak. Hatása leginkább nyúlban tükrözi az emberben meglévő aktivitást. Egérben, patkányban és tengerimalacban végzett előzetes vizsgálatokban semmilyen egyértelmű hatás nem mutatkozott.

A NAF használata olyan állapotok kezelésénél javaik, amelyeket a PMN (polymorphonuclear cells neutrophils=polimorfonukleáris sejtek - neutrofilek) számának vagy aktiválási állapotának helyi vagy szisztémiás módosulása kísér vagy okoz. A NAF széleskörűen módosítja ezen PMN-paramétereket, használata ezért javaik olyan állapotok kezelésére, amelyekben a PMN számának vagy aktiválási állapotának a növelése klinikailag javuláshoz vezet, azaz bakteriális, mycoplazmás, élesztő vagy gomba eredetű és vírusfertőzések esetén. A NAF használata még gyulladásos betegségek esetén is javaik, ilyenek a psoriasis, ízületi esetek és asztma. A NAF abnormálisán alacsony neutrofilszám és/vagy generalizált alacsony neutrofilszint eseteiben is használható, továbbá a fenti indikációk esetén alkalmazandó ellenszerek előállítására.

Az alábbiakban az ábrák magyarázata következik.

1. ábra: LPS-sel indukált NAF-termelés

Az 1. példában leírtak szerint szeparált mononukleáris sejteket 24 tartályos tenyésztőlemezekre oltjuk (5.10⁶ sejt/ml) és a megadott koncentrációkban LPSsel stimuláljuk. Különböző időközönként a közeget összegyűjtjük, centrifugálással (20000 ford/perc; 20 perc; 4 °C) derítjük és NAF-aktivitását megmérjük. Egy donortól származó sejtekkel párhuzamos tenyésztéseket végzünk. Ezek az eredmények négy hasonló kísérlet eredményeit ábrázolják, amelyekben különböző donoroktól származó sejteket használtunk.

2. ábra: mononukleáris fagociták - de nem limfociták

NAF-termelése.

a) A teljes mononukleáris sejtfrakciót (·, ·, 5.10⁶ sejt/ml) és az innen származó adherens sejteket (O, □) 100 ng LPS jelenlétében (·, O) és távollétében (, □) tenyésztjük 24 óra hosszat.

b) Elutriációval tisztított monocitákat (Ο, 10⁶ sejt/ml) és limfocitákat (Δ, 4.10⁶ sejt/ml) tenyésztünk 100 ng LPS jelenlétében.

A grafikonok az elasztázkibocsátás relatív középértékeit ábrázolják. Az eredmények 5 (a), illetve 6 (b) külön elvégzett kísérletből - mindegyiket párhuzamosan futtattuk - származnak. Áz adatokat úgy normalizáltuk, hogy az „a” grafikonon a (·) 24 órás értékét és a „b” grafikonon a (O) 24 órás értékét vettük 1,0-nek és a többi értéket (középérték ± standard eltérés) ehhez viszonyítva számoltuk ki. Ezt a típusú ábrázolást azért választottuk, mivel egyrészt számításba vettük a NAFtermelés individuális változásait, másrészt a NAF teszteléséhez használt neutrofilek érzékenységét.

3. ábra: A NAF részleges tisztítása foszfocellulóz- kromatográfiával

Az ábrán a protein (280 nm,—), a NAF (O) és az IL-1 (Δ) megoszlás látható. A legnagyobb NAF-aktivitású frakciókat, mint jeleztük, egyesítettük.

4. ábra: a NAF tisztítása HPLC-gélszííréssel.

a) Proteinmegoszlása (280 nm) és a molekulatömeg markerek elúciós ideje (a nyilak a következő molekulatömegekre vonatkoznak: 1 = 66200; 2 = 42700:

3=21500: 4=6500 és 5 = 1255).

b) a NAF-aktivitás profilja

5. ábra: a NAF tisztítása hidroxil-apatit-kromatográfiával

A részlegesen tisztított NAF-ot alacsony sókoncentráció mellett felvisszük az oszlopra, majd 1 mól/1 NaCl-tartalmú puffénál oldjuk ki. A hasábok a NAFaktivitást jelentik.

6. ábra: a NAF tisztítása heparin-Sepharose-kromatográfiával

A részlegesen tisztított NAF-ot alacsony sókoncentráció mellett felvisszük az oszlopra, majd 1,5 mól/1 NaCl-tartalmú puffénál oldjuk le. A hasábok a NAFaktivitást jelentik.

7. ábra: a NAF tisztítása reverz fázisú HPLC-vel C4 oszlopon

a) A tisztított NAF-ot, 0,1% trifluor-ecetsavban RPoszlopra visszük fel. Az oszlopot 0,1 %-os trifluor-ecetsavas acetonitril lineáris gradiensével fejlesztjük ki.

b) A hasábok a NAF-aktivitást jelentik.

8. ábra: a NAF tisztítása reverz fázisú HPLC-vel CNpropil oszlopon

HU 205617 Β

A tisztított NAF-ot 0,1%-os trifluor-ecetsavban egy Bakerbond CN-propil oszlopra visszük fel. Az oszlopot 0,1%-os trifluor-ecetsavas n-propanol lineáris gradiensével fejlesztjük ki.

9. ábra: a NAF tisztítása kromatofokuszálással

A részlegesen tisztított NAF-ot kromatofokuszáló oszlopra visszük fel. Az oszlopot 96-HC1 polipuffenal (pH=7,0) fejlesztjük ki. A frakciókat NAF-aktivitásra (--) és pH-ra (-O-) teszteljük.

10. ábra: a részlegesen tisztított NAF-ra válaszként kapott respirációs robbanás

a) Szuperoxid-termelés: a neutrofíleket (3.10⁶/ml) 37 °C-on 2 percig előinkubáljuk 1 μΜ PAF-fal vagy enélkül, majd növekvő mennyiségű NAF-fal stimulálunk. A NAF hozzáadását követően a cítokróm C redukcióját regisztráljuk.

b) H₂O₂-függő kemilumineszcencia: bal felől láthatók a részlegesen tisztított NAF-fal és a C5a-ból és fMLP-ből körülbelül azonos hatást kefejtő koncentrációkkal való stimulálás progressziós görbéi. A válasz kezdeti fázisa jobb felől, részletezve látható. A stimuláló anyagokat 50 pl PBS-BSA-ban adagoltuk.

11. ábra: aNAF és a C5a megkülönböztetése

A C5a-t és a NAF-ot 15 percig friss humán szérummal vagy PBS-sel inkubáljuk, ezután meghatározzuk a készítmények aktivitását (szuperoxid-képződés).

a) C5a PBS-ben,

b) C5a szérumban,

c) szérum,

d) NAF PBS-ben,

e) NAF szérumban.

12. ábra: szuperoxid-képződés a részlegesen tisztított

NAF-fal C5a-val és fMLP-vel végzett sorozatos stimulálásra adott válaszban

a) A neutrofíleket (3.10⁶/ml) 37 °C- on 5 percig előinkubáljuk, majd a különböző hatóanyagokkal stimuláljuk a jelzés (nyilak) szerint.

b) Sorozatos vagy ismételt stimulálás NAF-fal és C5a-val. A feltételek ugyanolyanok, mint a)-nál.

A nyilak a hatóanyagok hozzáadását jelzik. A C5a koncentrációja a)-ban 0,5 nM, b)-ben 0,2 nM, az fMLP koncentrációja mindkét kísérletben 20 nM. A hatóanyagokat 50 pl PBS-BSA-ban adagoltuk.

13. ábra: a szintetikus NAF-gén nukleotid szekvenciája

Az 0N1-0N6 egyedi oligonukleotidokat, amelyeket a gén felépítéséhez használtunk, szaggatott vonalakkal ábrázoljuk. A nukleotidok száma (aláhúzva) a kettős szál felett a jobb oldalon jelenik meg. A fő formának megfelelő peptid szekvenciát az aminoterminális végtől (Ser) kezdve kezdjük számozni. A Clal és BamHI restrikciós helyeket a kettős szál felett jelezzük. A Taql-helyet, amelyet úgy állítottunk elő, hogy az arginin kodonban az A-t C-vel helyettesítettük, szintén mutatjuk.

14. ábra: a p(NAF)-6T3 expressziós vektor

A^r=ampicillinrezisztencia-gén

Trp P/O=triptofán promoter

T=szintetikus transzkripciós terminátor 75. ábra: a természetes és rekombináns NAF azonossága

Felső grafikonok: a természetes (bal) és rekombináns (jobb) NAF által indukált változások a citoszol szabad Ca²⁺-tartalmában. A neutrofilek (4.10⁶ sejt/ml) 0,1 nM Quin-2-ΑΜ (a kalciumion fluorimetriás reagense) terhelést kaptak, amelyeket ezután 3 nM NAFfal stimuláltunk. A Quin-2 (kalcium-specifikus kelátképző és indikátor) szaturáció változásait V. von Tschamer és mtsai [J. Bioi. Chem., 261 10163-10168 (1986)] által leírtak szerint kalibráltuk.

Alsó grafikonok: a természetes (bal) és rekombináns (jobb) NAF által indukált respirációs robbanás. A neutrofileket (10⁶ sejt/ml) 3, 10 és 30 nM NAF-fal stimuláltuk nulla időpontban és a hidrogén-peroxid-képződést kemilumineszcencíával mértük [Μ. P. Wymann és mtsai, Anal. Biochem., 165,371-378 (1987)].

16. ábra: plazma szivárgása a bőrrészekre

NAF vagy endotoxin intradermális injekciója után; időtartam: 4 óra; 3 nyúlnál kapott válaszok középértéke ± standard eltérések.

17. ábra: neutrofilek akkumulációja a bőrrészekben

A16. ábrára felvitt válaszokkal egyidejű mérések.

18. ábra: polymyxinB hatása neutrofilek akkumulációjára

NAF (IO^-9 mól/bőr-rész), fMLP (10^-9 mól/bőrrész) vagy endotoxin (IO'¹³ mól/bőrrész) intradermális injekciója után.

Polymyxin B: 40 pg/bőirész

Időtartam: 4 óra nyúlnál kapott válaszok átlaga: középértékek ± standard hiba.

19. ábra: actinomycin D hatása a neutrofilek akkumulációjára

A bőrrészek NAF-fal (10'⁹ mól/rész), fMLP-vel (10' ⁹ mól/rész) vagy endotoxinnal (10'¹³ mól/rész) való stimulálása után:

Időtartam: 2 óra nyúlnál kapott válaszok átlaga: középértékek ± standard hiba.

A találmányt az alant következő példák világítják meg, amelyek azonban nem korlátozzák a találmány oltalmi körét.

A hőmérsékleti értékeket Celsius-fokokban adjuk meg. A leírásban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk:

PHA:	fitohemagglutinin
ConA:	konkanavalin A
LPS:	E. coli lipopolíszacharid
BSA:	bovin szérum albumin
fMLP:	N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenil- alanin
PAF:	l-Q-hexadeciI-2-0-acetil-sn-glicero-3-f oszfokolin (platelet activating factor= trombocitaaktiváló faktor)
MÉM:	Eagle-féle minimál essential médium (Seromed GmbH, NSZK) 25 pg/ml neomicinnel kiegészítve, 25 mM NaHCO3tal és 20 mM HEPES pufferral pH=7,4re pufferolva
MEM-PPL:	fentieken kívül 1% pasztörizált plazmaprotein oldatot (5%-os PPL-SRK: Svájci Vöröskereszt Laboratóriuma, Bem,

HU 205 617 Β

Svájc) tartalmaz és 100 NE/ml penicillint és streptomicint (Gibco AG, Bázel, Svájc)

PBS: foszfáttal pufferolt konyhasóoldat Ca²⁺és Mg²⁺-mentes (137 mM NaCI, 2,7 mM KC1, 8,1 mM NaH₂PO₄ és 1,5 mM KH₂PO₄pH 7,4-re beállítva)

PBS-BSA: a PBS 0,9 mM CaCl₂-vel, 0,49 mM MgCl₂-vel és 2,5 mg/ml BSA-val kiegészítve

HEPES: N-2-hidroxi-etil-piperazin-N’-2-etánszulfonsav

PPL-SRK: plazmaprotein-oldat, Svájci Vöröskereszt (Plasma Protein Pösung - Sweizerisches Pote Xreuz)

NAF: neutrofílaktiváló faktor vagy protein

CX: cikloheximid

IL-1: interleukin-1

SÓD: szuperoxid dizmutáz

C5a: anafilatoxin

CPG: · ellenőrzött porózus üveg (controlled porous glass)

PAGE: poliakrilamid-gél elektroforézis

GM-CSF: granulocyte macrophage colony-stimulating factor=granulocita-makrofág-telepstimuláló faktor

CB: cytochalasin B (5 μg/ml)

MES: 2-(N-morfolino)-etánszulfonsav

HPLC: high pressure liquid chromatography=magasnyomású folyadékkromatográfia

SDS: sodium dodecyl sulphate=nátrium-dodecil-szulfát

1. rész

Humán monociták NAF-termelése

1. példa

LPS-sel stimulált humán monociták NAF-termelése Donorvérek fehérvérsejt-trombocita rétegéből (buffy coat: Svájci Vöröskereszt Laboratóriuma, Bem, Svájc) Ficoll Paque gradiensben centrifugálással izoláljuk a humán monocitákat. Ezzel a módszerrel választjuk el a neutrofileket az ún. mononukleáris sejtektől, egy monocitákból (20%) és limfocitákból (80%) álló keverékből. Három monocitakészítmény használatos: (i) a teljes mononukleáris sejtfrakció, (ii) mononukleáris sejtfrakcióból adherenciával feldúsított monociták és (iii) limfocitákból centrifugális elutriációval elválasztott 90%-ban tiszta monociták [G. Garotta és mtsai, Biochem. Biophys. Rés. Comm., 140, 948-954 (1986) és K. J. Clemetson és mtsai, J.Exp. Med., 161,972-983 (1985)]. A sejteket MEM-PPL tápoldatban tenyésztjük és növekvő koncentrációjú (0,1 ng/ml - 1 μg/ml) LPS-sel stimuláljuk. A tápoldatból különböző időben alikvot mintákat veszünk. A minták NAF-aktivitását úgy mérjük, hogy meghatározzuk, mennyire képesek indukálni a cytochalasin B-vei előkezelt humán neutrofilekből elasztáz kibocsátását [B. Dewald és mtsai, Biochem. Pharmacol., 36,2505-2510 (1987)].

A monociták és limfociták körülbelül 1:5 arányú keverékéből álló mononukleáris sejttenyészetek (5.10⁶ sejt/ml) LPS-sel (100 ng/ml) való stimulálás esetén NAF-ot termelnek. A NAF 24 órán keresztül szaporodik a közegben és 24 és 48 óra között a termelés egyenletessé válik. Stimulus nélkül nem képződik NAE Az 1, ábra az LPS hatásának időbeli lefolyását és koncentrációfüggését mutatja be. Az LPS 0,1 ng/ml ésl ng/ml között már hatásos.

A NAF képződésének tanulmányozásához különböző mononukleáris sejtkészítményeket használunk. A 2a ábra a NAF LPS-függő képződését mutatja be a teljes mononukleáris sejtfrakcióban, és az innen adherencia segítségével szelektált monocitákban. Az eredmények bizonyítják, hogy a NAF-termelés függ az LPS-től és hogy a NAF-ot a monociták termelik. Úgy tűnik, hogy a limfociták jelenléte nem befolyásolja a termelt NAF mennyiségét. Hasonló eredményeket kaptunk elutriációval tisztított monocitákkal és limfocitákkal. A 2b ábrán látható, hogy a NAF-ot a monociták termelik és nem a limfociták.

2. példa

PHA-val és ConA-val stimulált humán monociták

NAF-termelése

A mononukleáris sejtfrakciót - melyet az 1. példában leírtak szerint humán vér buffy coatból szeparálunk - az 1. példában vázolt feltételek mellett tenyésztjük és PHA-val (5 μg/ml), valamint ConA-val (10 μg/ml) stimuláljuk. A NAF-termelés időbeni lefolyása hasonló ahhoz, mint amit a 100 ng/ml LPS-sel stimulált mononukleáris sejtek esetén megfigyeltünk. A termelés maximumát körülbelül 24 óra után értük el.

3. példa

NAF-termelés gátlása cikloheximiddel

Az a tény, hogy a NAF kibocsátása nem közvetlenül a monociták stimulálásakor következik be, hanem órákat jelentő időtartam alatt, a stimulus koncentrációjától függően, arra enged következtetni, hogy de novo proteinszintézisről van szó, és hogy a NAF-termelést ténylegesen a stimulus indukálja. A proteinszintézis tényét olyan kísérletekben mutatjuk ki, amelyekben a NAFtermelést a cikloheximid-adagolás gátolja. Egy reprezentatív kísérlet eredményét az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

NAF-termelés gátlása cikloheximiddel

Kezelés	Átlagos NAF-termelés
4	8	24
	óra múlva
Kezelés nélkül	0	0	0
LPS	726	2042	2633
LPS+CX	0	0	0
LPS+CX a 4. órában	774	966	639
LPS+CX a 8. órában	752	1884	1854

HU 205 617 Β

A cikloheximidet (CX, 10 gg/ml) az LPS (100 ng/ml) után 4 vagy 8 óra múlva adagoltuk. Az aktivitást fluoreszcencia-egységekben adjuk meg, mely az elasztázkibocsátást fejezi ki.

II. rész

4. példa

A NAF ésIL-1 elválasztása foszfocellulóz-kromatográfiával

Az 1. példában leírtak szerint a donorvérBufiy coatból kapottmononukleáris sejteket MEM-PPL tápoldatban tenyésztjük 48 órán át 100 ng/ml LPS jelenlétében, rázott tenyésztÓpalackokban (1,5 liter, 5.10⁶ sejt/ml). Ezután a tenyészetfelülúszőt összegyűjtjük, 20000 ford/perc mellett 4 °C-on 20 percig centrifugáljuk, hogy az oldhatatlan részecskéket eltávolítsuk, majd felvisszük egy 10 ml-es foszfocellulőz oszlopra (Whatman Pll, 1,4x6 cm), amelyet 20 mM NaCl-ot és 5% glicerint tartalmazó 20 mmólos kálium-foszfát pufferrel (pH=7,2) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot a fenti puffer 30 ml-ével mossuk, majd 90 ml NaCI-oldattal, lineáris koncentráció gradiens alkalmazásával (0,02-1,5 M NaCl ugyanezen pufferben) eluáljuk. A frakciószedés 2 ml-enként történik, 0,1% polietilén-glikolba, majd a frakciók NAF- és IL-l-aktívitását teszteljük. Az abszorpciót 280 nm-en folyamatosan ellenőrizzük, a protein mennyiségének jelzésére.

A 3. ábrán a protein megoszlási profilját mutatjuk be (abszorpció 280 nm-en), valamint két biológiai aktivitást, az elasztázkibocsátást, amely a NAF-aktivitás mértékéül és a trimocitaproliferációt, amely az IL-1aktivitás mértékéül szolgál. A protein nagy része és az IL-l-aktvitás az átfolyt térfogatban jelenik meg. A lineáris NaCl gradienssel való kioldáskor alacsony ionerőnél kapunk bizonyos IL-l-aktivitást, amelyet egy csúcs követ a NAF-nak megfelelő elasztázkibocsátó aktivitással. Ez a csúcs 0,5 M NaCl-nál éri el maximumát. A csúcs szimmetrikus és egy kis váll előzi meg. A sógradiens bizonyos UV-abszorbeáló anyagot is kiold; profilja azonban nem esik egybe a meghatározott biológiai aktivitásokkal. Amint azt a 3. ábra jelzi, az IL-1 és a NAF teljesen elválaszthatók. Az IL-l-hez nem kapcsolódik elasztázkibocsátó aktivitás és a NAF-hoz sem kapcsolódik tímocitaproliferációt indukáló aktivitás. A frakcionálással a NAF közel 100%-ban visszanyerhető, amiből az következik, hogy a közeg nem tartalmaz sem inhibitorokat, sem aktivátorokat.

5. példa

A NAF tisztítása gélszííréssel

Foszfocellulőz-kromatográfiával részlegesen tisztított NAF-ból (4. példa) 200 μΐ-es mintát viszünk fel egy HPLC TSK-G2000 SW oszlopra (7,5x600 mm), melyhez egy TSK-GSWP előtét oszlop (7,5x75 mm) tartozik (gyártó: E. MERCK, Darmstadt). Az oszlopot 10Q mM NaCl-tartalmú 100 mmól-os NaHPO₄-ban futtatjuk 0,5 ml/perc sebességgel. Kalibrációs standardokként bovin szérum albumint (móltömeg: 66200), ovalbumint (móltömeg: 42700), szójabab tripszin inhibitort (móltömeg: 21500), aprotonint (móltömeg: 6500) és actinomycin D-t (móltömeg: 1255) használunk. A NAF egy enyhén aszimmetrikus csúcsban oldódik le, közvetlenül az aprotinin után és jóval az actinomycin D felett. A NAF molekulatömege tehát valószínűleg körülbelül 6500. Sem az említett csúcs előtt, sem utána nem oldódik le NAF-aktivitás.

6. példa

A NAF tisztítása hidroxil-apatiton

A foszfocellulóz-kromatográfiával (4. példa) kapott frakcióból egy 15 ml összmennyiségű poolt készítünk (körülbelül 800 ml frakcionálatlan tenyészet-felülúszőnak felel meg), melyet 1:10 arányban hígítunk a vivőpufferrel [10 mM nátrium-foszfát (pH=6,9) 0,1% polietilénglikol 6000-ben], majd felvisszük egy 3 ml-es hidroxil-apatit oszlopra (Biogel HTP), amelyet előzőleg a vivőpufferral hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot háromszor mossuk a vivőpuffer 3 ml-es részleteivel, majd a kioldást 1 M NaCl-dal kiegészített vivőpufferral végezzük. Ezzel az eljárással visszanyerjük a NAFot az oszlopról. Egy ezt követő 0,5 mólos nátriumfoszfát pufferes (pH=6,9) eluálás nem eredményez további NAF-aktivitást (5. ábra).

7. példa

A NAF tisztítása heparin-Sepharose-kromatográfiával

A foszfocellulőz-kromatográfíával részlegesen tisztított NAF-ból (4. ábra) 1 ml mintát viszünk fel egy 0,5 ml-es heparin-Sepharose 4B oszlopra, melyet előzőleg 0,1% polietilénglikol 6000-rel és 50 mM NaCldal kiegészített 10 mmólos nátrium-foszfáttal (pH=7,3) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot ugyanezzel a pufferral mossuk, majd a kioldást 1,5 M NaCl-tartalmú 10 mmólos nátrium-foszfát pufferral (pH=7,3) végezzük. A NAF-ból egy jelentéktelen mennyiség kimutatható az oszlop mosásakor átfolyt folyadékban, de az oszlop által megkötött aktivitás legnagyobb része a magasabb ionerősségű pufferral oldódik ki (6. ábra).

8. példa

A NAF tisztítása reverz fázisú magasnyomású folyadék kromatográfiával C4 oszlopon Foszfocellulóz-kromatográfiás tisztítással (4. példa) és az ezt követő egy hidroxil-apatitos tisztítással (6. példa) kapott NAF-mintát felvisszük nagy porozitású (widepore) reverz fázisú C4 oszlopra (Biorad RP-304). Az oszlop kioldását 0,1%-os trifluor-ecetsavas acetonitril 080%-os gradiensével végezzük, 0,66%/perc koncentrációnövekedés mellett. Az átfolyás sebessége 0,5 ml/perc. A leszedett frakciókat vákuumban szárítjuk. Az üledékeket 100 μΐ 0,1% polietilénglikol 6000 tartalmú PBS-ben reszuszpendáljuk és NAF-aktivitásra teszteljük. A NAF mintegy 60 perces retenciós idővel eluálódik, amely körülbelül 40% acetonitrilnek felel meg, s egyetlen éles csúcsot ad (7. ábra).

9. példa

A NAF tisztítása reverz fázisú magasnyomású folyadékkromatográfiával CN-propil oszlopon A 8. példa szerint reverz fázisú kromatográfiával

HU 205 617 Β tisztított NAF egy mintáját - amelyet vákuumban szárítottunk és 100 μΐ 0,1% polietilénglikol-tartalmú PBS-ben reszuszpendáltunk - egy térfogat 0,1%-os trifluor-ecetsawal hígítjuk és felvisszük Bakerbond nagy porozitású ciano(CN)-propil oszlopra (Baker Research Produchts, Phillisburg, NJ., USA). Az oszlopot 0,1 %-os trifluor-ecetsavas n-propanol 0-50%os gradiensével - növekedés 0,41%/perc - oldjuk ki. Átfolyási sebesség; 0,5 ml/perc. A leszedett frakciókat vákuumban szárítjuk. Az üledékeket 100 μΐ 0,1% polietilénglikol 6000 tartalmú foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban reszuszpendáljuk és NAF-aktivitásra teszteljük. A NAF két éles csúcsban oldódik le, a nagyobbik 53 perces retenciós idővel, mely 22% n-propanolnak felel meg és a kisebbik 66 perces retenciós idővel, mely 27,5% n-propanolnak felel meg (8. ábra).

10. példa

A NAF kromatojbkuszálása

Foszfocellulóz-kromatográfiával részlegesen tisztított NAF (4. példa) 4 ml-nyi mintáját 25 mM etanolamin.HCl (pH=9,4) és 0,1% polietilénglikol 6000 öszszetételű startpuffercal szemben dializáljuk, majd felvisszük egy PBE-94 oszlopra (0,7x19 cm Pharmacia), amelyet előzőleg ugyanezen pufferral hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot ezután 200 ml 0,1% polietilénglikol 6000 tartalmú poli-puffer 96-HCl-del (1:100 arányban hígítva vízzel: pH=7,0) oldjuk ki. Tízperces frakciókat gyűjtünk, 10-14 ml/óra átfolyási sebesség mellett. A frakciókat NAF-aktivitásra vizsgáljuk. Az aktivitás fő része pH=8,5-től 8,8-ig oldódik le (9. ábra).

III. rész

A NAF fizikokémiai és biológiai jellemzése

11. példa

A NAF fizikokémiai tulajdonságai

Foszfocellulóz-kromatográfiával részlegesen tisztított NAF-ot (4. példa) használunk ezekben a kísérletekben. A foszfocellulóz-kromatografálást követően a legmagasabb NAF-aktivitású frakciókat egy éjszakán át 4 °C-on PBS-sel szemben dializáljuk olyan membrán alkalmazásával, melynek kizárási molekulatömege 1000 dalton. A kapott készítményt ezután a következő kezeléseknek vetjük alá:

a) inkubálás 37 °C-on tripszinnel, kimotripszinnel vagy proteináz K-val (100 μg/ml) és ezek nélkül. Ezután BSA-t (2 mg/ml) adagolunk feleslegben a NAF protolízisének megállítása céljából;

b) hevítés 56 °C-on, 80 °C-on és 95 °C-on (az összehasonlító kontroll 22 °C);

c) pH=2 és pH= 10 mellett (22 °C-on) tartás, mely után a készítményt pH=7,4-re állítjuk be (az összehasonlító kontroll pH=7,4);

d) 2 M lítium-kloriddal, 6 M guanidínium-kloriddal, 1% 2-merkapto-etanollal vagy 0,5% SDS-sel való kezelés 3 órán át 22 °C-on, mely után dialízis következik 24 órán át 4 °C-on, PBS-sel szemben. Az adagolásoknál a NAF nélküli mintákat azonos módon kezeltük és azt vizsgáltuk, hogy ennek milyen hatása lehet a NAF assayre.

A második táblázatból kitűnik, hogy a NAF feltűnően rezisztens inaktiválással szemben. A különböző proteázokkal való inkubálás esetén aktivitása tönkremegy, ami azt jelzi, hogy a NAF egy polipeptid. Ezzel szemben, a NAF-ot nem könnyű inaktiválni hővel, savval és lúgos pH-η vagy SDS-kezeléssel. Bizonyos inaktiválódás lép fel 2-merkapto-etanol, lítium- és guanidíniumklorid hatására.

2. táblázat

A NAF fízikokémiai tulajdonságai

Kezelés	Feltételek	Relatív aktivitás
Hőmérséklet	22°, 3 óra	100
	56°, lóra	82
	80°, 15 perc	80
	95°, 5 perc	66
pH=2,0	22°, 3 óra	76
pH=10,0	22°, 3 óra	90
SDS 0,5%	22°, 3 óra	100 “
2-merkapto-etanol 1,0%	22°, 3 óra	30
lítium-klorid 2 mól	22°, 3 óra	52
guanidínium-klorid 6 mól	22°, 3 óra	68
tripszin 100 gg/ml	37°, 4 óra	100
	37°, 12 óra	8
a-kimotripszin 100 gg/ml	37°, 4 óra	80
	37°, 12 óra	1
proteináz K 100 gg/ml	37°, 12 óra	0

12. példa

NAF-indukálta exocitózis (NAF által indukált degranuláció humán neutrofilekben)

PBS/BSA-ban szuszpendált neutrofileket (5.10⁶/ml) 37 °C -on 5 percig előinkubálunk cytochalasin B (5 gg/ml) jelenlétében és távollétében. A degranulációt stimulus adásával indítjuk meg, például NAF-fal, vagy egy standard stimulussal. A reakciót 15 perc múlva állítjuk le úgy, hogy a sejteket jéggel gyorsan lehűtjük, majd centrifugálással ülepítjük. A sejtmentes közegben és a sejtüledékben meghatározzuk a B₁₂-vitamin-kötő proteint, béta-glükuronidázt és a laktat dehidrogenázt és ezeknek az alkotórészeknek a kibocsátását a teljes sejttartalom százalékában számítjuk ki [B. Dewalt és M. Baggiolini, Methods Enzymol., 132,267 (1986)].

A 3. táblázatban foglaljuk össze a NAF hatását a B12-vitamin-kötő protein és a béta-glükuronidáz ezek a specifikus és azurofil granulumok alkotórészei kibocsátásra.

HU 205 617 Β

3. táblázat

Agranulumtartalom stimulusfűggő exocitőzisa humán neutrofileknél

Stimulus	CB	Bü-vitaminkötö protein kibocsátása	Béta-glükuronidáz százalékban	Laktát-de- hidrogenáz
nincs		6,0±0,4	2,l±0,4	6,2+2,5
NAF50gl	-	12,9+1,6	2,7+1,3	5,8±0,7
NAF 100 μΐ	-	13,9+2,1	3,0+1,3	6,8±2,2
fMLP 0,1 μΜ	-	14,0±0,9	2,3+0,8	5,7+1,1
nincs	•F	10,0±l,l	2,4±0,2	7,0±3,2
NAFSOpl	+	25,6±3,4	7,9±2,0	6,7±1,6
NAF 100 μΐ	•F	26,8+4,9	8,5+1,7	7,3+2,1
fMLPO.lgM	-F	35,6+5,5	12,1+4,4	5,3±1,6

kőzépértékek ± standard eltérés

Normál neutrofilekfaen a NAF csak a specifikus granulumok exocitőzisát indukálja. Azonban ha a sejteket Cytochalasin B-vel (CB) előkezeljük, mindkét típusú granulumból extenzív kibocsátást kapunk. Ez utóbbi feltételek mellett a béta-glükuronidáz kibocsátása az elasztázkibocsátással párhuzamos, melyet markerként használunk a NAF-aktivitás tesztelésére (1. példa). Mennyiségileg a NAF exocitózisindukáló tulajdonságai hasonlóak az fMLP kemotaktikus pepiidéihez. Egyik stimulns sem indukálja a laktát-dehidrogenáz mely citoszol enzim - kibocsátását, jelezvén, hogy a sejt károsodása elhanyagolható.

13. példa

NAF-indukálta respirációs robbanás (szuperoxidképzödés indukciója NAF hatására humán neutrofilekben)

A szuperoxíd képződését 37 °C-on mérjük, mint a feiricitokróm C SÓD érzékeny redukcióját [M. Markért és mtsai, Methods Enzymol., 132, 267 (1984)]. A vizsgálandó reakcióelegy (800 pl) 0,75x10® sejt/ml PBS-BSA-ból áll, mely 85 pmól citokróm C-t tartalmaz. Az abszorpcióváltozásokat egy olyan HewlettPackard 8451A - diódatömbös - spektrofotométerrel követjük, mely fel van szerelve termosztált hét-helyes kűvettaváltóval. A 4. táblázat adatai dokumentálják a NAF-nak azon képességét, hogy humán neutrofilekben respirációs robbanást idéz elő.

4. táblázat

Humán neutrofilek NAF-függő szuperoxid-termelése

NAFgl	Citokróm C redukció*
	Maximális sebesség nmől/perc	Összmennyiség (nmól) 3 percen belül
5	0,81	0,89
10	1,45+0,63	l,45±0,50
20	2,32±0,56	2,16+0,39
30	2,51±0,50	2,30+0,55
50	3,51+0,69	3,10+0,55
100	3,69	3,39,

+ minden énék 10® sejtre vonatkozik középértékekre + standard eltérés

A NAF növekvő mennyiségeivel a szuperoxid-képződés maximális sebességének és összmennyiségének fokozatos növekedése érhető el. Mint ahogy összehasonlító kísérletek mutatják, a szuperoxid-termelés maximális szintjeit kiváltó NAF-mennyiségek megfelelnek azoknak a mennyiségeknek, amelyek a maximális exocitőzist indukálják.

14. példa

H₂O₂-képződés (a NAF összehasonlítása az fMLPvel és C5a-val, melyek a respirációs robbanás stimulátoraiként hatnak humán neutrofilekben)

A NAF, fMLP és C5a respirációs robbanást stimuláló tulajdonságait úgy hasonlítjuk össze, hogy meghatározzuk a stimulált sejtek által temelt szuperoxidot vagy hidrogén-peroxidot. A szuperoxíd képződést a 13. példában leírtak szerint határozzuk meg. A hidrogén-peroxid képződést kemilumineszcencia segítségével határozzuk meg [Μ. P. Wymann és mtsai, Anal. Biochem., 165, 371-378 (1987)]. A vizsgálandó reakcióelegyet, mely 0,1 M nátrium-azid tartalmú PBS-BSA-t, 0,01 mM luminolt, 9 egység/ml torma-peroxidg ázt és 10® neutrofil sejtet tartalmaz, 10 percig 37 ’Con előinkubáljuk, majd a reakciót a stimulálók hozzáadásával - mikrofecskendő - indítjuk meg.

A 10. ábra a NAF növekvő mennyiségével indukált szuperoxid képződését ábrázolja. A reakció gyors beindulása, nagy sebessége és korai egyenletessé válása alapján a NAF által kiváltott válasz erősen hasonlít az fMLP és C5a által kiváltott válaszhoz. A NAF-ra adott választ határozottan fokozza a sejtek PAF-fal való előkezelése (10. ábra), amely az fMLP-vel vagy C5aval indukált szuperoxid-termelést szintén fokozza. A NAF-ra, fMLP-re és C5a-ra adott válaszok közvetlen összehasonlítását a 9. ábrán látjuk. A H₂O₂-képzódés sebességét jelző kemilumineszcenciának az idő függvényében való ábrázolása alátámasztja a válaszok hasonlóságát.

Ez és ezenkívül más mérések is azt mutatják, hogy a stimulátor hozzáadása és a NAF, fMLP és C5a által indukált H₂O₂ képződésének beindulása között eltelt idők azonosak. Ez az idő körülbelül 2 másodperc, mint ezt előzőleg az fMLP, C5a, PAF és a leukotrién B₄ kapcsán már közölték [Μ. P. Wymann és mtsai, J. Bioi. Chem., 262, 12048 (1987)]. A NAF-ra, fMLP-re és C5a-ra adott neutrofílválasz kvalitatív és kvantitatív hasonlósága arra mutat, hogy a NAF azáltal aktiválja a neutrofilsejteket, hogy egy felületi receptorhoz kötődik és így úgy viselkedik, mintegy receptorra ható szer.

15. példa

A NAF és a C5a megkülönböztetése

Mint a 14. példában leírtuk, a NAF-aktivitás jellege a humán neutrofilekkel szemben, a C5a aktivitásához hasonló. E két peptid közti hasonlóság kiterjed a fizikokémiai tulajdonságokra is, így a hővel és savval szembeni ellenállásra. Minthogy a C5a és a NAF hasonló hatást gyakorol a neutrofilekre, további vizsgálatokat volt szükséges elvégezni a két peptid teljes megkülönböztetése céljából. NAF- és C5a-mintákat friss

HU 205 617 Β humánplazma hatásának teszünk ki. Ismert, hogy ez a kezelés a C5a-t egy viszonylag inaktív dezarginil-származékká konvertálja, karboxi-peptidázzal való hasítás révén. A 11. ábrából látható, hogy a szérum-kezelés tökéletesen megszünteti a C5a aktivitását, de a NAF-ra nincs hatása. Ez mutatja, hogy a két anyag szerkezetileg különböző.

16. példa

Annak bizonyítása, hogy a NAF-nak saját specifikus receptorai vannak a neutrofilsejteken Ha neutrofileket kétszer stimulálunk ugyanazon receptorra ható anyag (például fMLP) azonos mennyiségeivel és regisztráljuk a szuperoxid-képződést mint a neutrofilválasz mértékét, a második stimulálás jóformán hatástalan marad. Másrészt, ha a különböző receptorokra ható anyagokat egymás után (például az fMLP után a C5a-t) használjuk, ezek a stimulációk normál választ váltanak ki. Az ilyen típusú kísérleteket azért végeztük el, hogy megállapítsuk, vajon a NAF saját receptorai révén fejti-e ki hatását, vagy pedig egy olyan receptoron keresztül, amelyet más hatóanyagok is használnak.

A 12a ábrán bemutatjuk, hogy a neutrofilek normálisan válaszolnak az fMLP-re, ha először NAF-fal vagy C5a-val történt a challenge. A 12b ábra a NAF-fal és C5a-val végzett ismételt stimulációk eredményét ábrázolja. A sejteket először NAf-fal és C5a-val stimuláljuk olyan koncentrációkban, amelyek körülbelül azonos mennyiségű szuperoxid-képződést váltanak ki, majd másodszor vagy ugyanazt vagy egy más stimulust kapnak. Ha ugyanazt a hatóanyagot használjuk kétszer, a sejtek nem válaszolnak a második stimulusra. Ezzel szemben normál választ kapunk C5a-ra azoknál a sejteknél, amelyeket először NAF-fal stimuláltunk, és normál választ kapunk a NAF-ra, amikor először C5aval stimuláltunk. Minthogy a neutrofilek teljes deszenzitizálódást mutatnak bármely stimulusra, de keresztszenzitizálódás nem történik, úgy tűnik, hogy a NAF és a C5a külön receptorokon keresztül fejtik ki stimuláló hatásukat, jelezvén ezzel, hogy szerkezetileg különböznek. A NAF kombinációi PAF-fal, fMLP-vel leukotrién B₄-gyeJ szintén nem mutatnak keresztdeszenzitizáló hatást. Ennélfogva a NAF egy szelektív, bár eddig ismeretlen receptoron keresztül fejti ki hatását.

17, példa

NAF által indukált neutrofilakkumuláció és plazmaszivárgás nyálban

A gyulladásos válaszokat 2,0-2,5 kg-os nem kábított New Zeeland albínó nyulak bőrén vizsgáljuk. A donor nyulak vörösvérsejtjeit hidroxietil-cellulózzal (Polysciences, Warrington, PA., USA) ülepítjük és a kapott, leukocitákban dúsított plazma neutrofilsejtjeit (> 94% neutrofil) sűrűség gradiens centrifugálással, Percoll használatával (Pharmacia, Uppsala, Svédország) tisztítjuk. A sejteket 10% trombocitaszegény plazmát tartalmazó Ca²⁺- és Mg²⁺-mentes Tyrode oldatban reszuszpendáljuk oly módon, hogy koncentrációjuk 10⁶ leukocita/ml legyen, majd a sejteket 15 percen át szobahőmérsékleten 40gCi ^H1indium-oxin (Amersham)/10⁶ sejt alkalmazásával jelezzük. A jelzett sejteket 10% trombocitaszegény plazmával való centrifugálással mossuk és recipiensként körülbelül 10⁶ sejtet keverünk 10 pCi ¹²⁵jóddal jelzett humán szérumalbuminnal (Amersham). Az elegyet intravénásán fecskendezzük be olyan nyulak laterális fülvénájába, amelyeknél a gyulladásos léziókat tanulmányozzuk. Ezután gyulladáskeltő anyagokat injiciálunk a állatoknak intradermálisan, majd az actinomycin D-vel és polymyxin B-vel végzett kísérletekben 2 óra múlva, a dózis-válasz kísérletekben 4 óra múlva öljük el az állatokat. A jelzett sejtek keringési félidejében vérmintákat veszünk és meghatározzuk a neutrofileknek és a vérplazmának a specifikus aktivitását. Minden kísérlet végén a gyulladásos léziókban meghatározzuk a radioaktivitást egy többcsatornás gammaszámlálóban, levonjuk a kontroll bőmész aktivitását és a specifikus aktivitásokból kiszámítjuk a gyulladásos léziókban összegyűlt neutrofilek abszolút számát és a plazmamennyiségét. A gyulladásos léziókban jelen lévő neutrofilek számát az állatok közt úgy standardizáljuk, hogy az eredményeket Cybulsky és mtsai módszere szerint [Am. 1 PathoL, 124, 367 (1986)] sejtszám per 10⁶ keringő neutrofil per ml perifériás vér alakban fejezzük ki.

A 19. példában leírt módon előállított rekombináns NAF-ból 400 pg/ml-es oldatot készítünk 0,45 M NaCltartalmú MÉM (50 mM) oldatban (pH = 6,5). Az endotoxint (E. coli 055:B5 szerotípus, Sigma, St. Luis, MO., USA) pirogénmentes izotóniás konyhasóoldatban (pyrogen-free saline=PFS) oldjuk fel. Az fMLP-t dimetil-szulfoxidban oldjuk ΙΟ^-2 M koncentrációban és PFS-sel készítjük a munkahígítást. A polymyxin B-t és az actinomycin D-t 1 ml etanolban oldjuk és hússzorosára hígítjuk, amikor PFS-ben oldott NAF-fal, endotoxinnal vagy fMLP-vel keverjük. A gyulladás-válasz gátlási vizsgálatokban 40 μg polymyxin B-t és 10 ⁷ mól actinomycin D-t oltunk egy-egy bőrrészbe 10 ⁶ mól endotoxinnal. Minden vizsgálatban a gyulladáskeltő anyagból 0,2 ml-t oltunk intradermálisan a bőrrészekben, 26-os tűk használatával. Minden kezelést 5 párhuzamos vizsgálattal végzünk minden állatban.

A NAF a vizsgált dózistartományban (10^ⁿ—10 ⁹ mól/bőrrész) dózistól függően növeli a plazmaszivárgást (16. ábra) és a neutrofilek akkumulációját (17. ábra). Ehhez viszonyítva az endotoxin hasonló intenzitású plazmaszivárgást (16. ábra) és neutrofilakkumulációt (17. ábra) okoz, bőrrészenként 10‘¹³ mól esetén. Öt nyúlban a NAF 3-10-szer hatásosabb volt az fMLPnél, amely a plazmaszivárgás és a neutrofilakkumuláció stimulátora. A NAF oldására használt puffemek azon hígítása által indukált neutrofilakkumuláció, amivel a IO'⁹ mól/bőrrész koncentrációjú oldatot készítettük, nem különbözött azoktól a válaszoktól, amelyeket a kizárólag PFS-sel kezelt bőrterületek adtak. Azt az eshetőséget, hogy netán a NAF-készítmény aktivitása endotoxin-szennyezésnek volna betudható, úgy vizsgáltuk meg, hogy polymyxin B-t (40 μg/bőrrész) injici11

HU 205 617 Β altunk NAF-fal, fMLP-vel vagy endotoxinnal együtt. A polymyxin B az endotoxinra CIO¹³ mól) adott választ 84%-ban gátolta, míg a NAF CIO'⁹ mól) vagy az fMLP (10‘⁹ mól) által indukált neutrofilakkumulációra hatástalan volt (18. ábra).

Az actinomycin D-t (10‘⁷ mól/bőrrész) - mely az RNS-transzkripció egy irreverzíbilis inhibitora - 10' ¹³ mól endotoxinnal együtt injiciálva, a neutrofilakkumuláció 90%-os gátlását idézi elő (19. ábra). Ezzel szemben a NAF (10'⁹ mól) vagy fMLP (10'⁹ mól) által indukált neutrofilakkumuláciőjára az actinomycin Dnek nincs hatása.

Az eredmények azt mutatják, hogy a NAF in vivő hat, kiváltja a neutrofilsejtek dózisfüggő akkumulációját és plazmaszivárgást indít meg a gyulladásos lézió helyén. A NAF moláris hatékonysága a C5a és LTB (leukotrién b) klasszikus kemotaktikus faktorokéhoz hasonlítható és 3-5-ször nagyobb hatékonyságú, mint az fMLP. A NAF által indukált neutrofilakkumulációt nem gátolja, ha a NAF-ot egy proteinszintézist gátló anyaggal (actinomycin D) együtt adják intradermálisan. Tehát a NAF közvetlenül, mint kemotaktikus hatóanyag - ilyen az fMLP - hat, és nem úgy, mint egy endotoxin.

18. példa

NAF indukálta exocitózis (hatása nyúl neutrofilekre)

Nyúl neutrofil sejteket perifériás vérből izolálunk (fülvénából vagy artériából) dextránnal való ülepítéssel, majd Hypaque-Ficoll sűrűség gradiens centrifugálással. Tisztított, természetes NAF-ot használunk.

Az exocitózis körülményei: 5 percig 37 °C-on cytochalasin B-vel előkezelt 0,6xl0⁶ sejtet (0,15 ml összmennyiségben) NAF-fal (0,1-100 nM) vagy fMLP-vel (100 nM) stimulálunk 15 percig. A sejtmentes közegben meghatározzuk az N-acetil-béta-glükózaminidázt, amely az azurofíl granulumok markere. Az eredményeket az 5. táblázat foglalja össze.

5. táblázat

NAF indukálta exocitózis

Stimulus	Koncentráció (nM)	N-acetil-béta-glükózaminidáz (pmőVperc)
nincs		41
NAF	0,1	53
	1,0	99
	10,0	139
	100,0	157
fMLP	100,0	181

IV. rész

Rekombináns NAF

19. példa

NAF szintézise és kifejezése E. coliban a) Oligonukleotid-szintézis és -tisztítás Az 0N-1-0N-6 oligonukleotidokat (lásd a 13. ábrát) automata DNS-szintetizátorban szintetizáljuk standard kémiai eljárással, monomerként 3’-p-cianoetilΝ,Ν-diizopropil-foszfoamiditet használva, szilárd hordozón, mint a Fractosil szilikagél vagy a kontrollált porozitású üveg (CPG) [S. L. Beaucage és Μ. H. Caruthers, Tetr. Letters 22, 1859 (1981): N. D. Sinha és mtsai, Nucleic Acids Rés., 12,4539 (1984)].

A detricilált anyagokat szobahőmérsékleten 25%-os ammóniával 2 órán át tartó kezeléssel választjuk le a hordozóról. Ezután lehasítjuk az összes védőcsoportot oly módon, hogy az ammóniás oldatot 20 órán át 55 °C-on melegítjük, majd a termékeket liofilizáljuk. A nyers terméket poliakrilamid gél elektroforézissel (PAGE) választjuk el (12% akrilamid, 0,3% biszakrilamid, 7 M karbamid, 0,089 M írisz-borát, 0,089 M bórsav, 0,002 M EDTA: 20 V/cm). A teljes hosszúságú oligonukleotidokat szilikagéllemezeken UV-fényben való fluoreszcenciájuk alapján lokalizáljuk, a géldarabokat kivágjuk és elúciós kamrában elektroeluáljuk. A koncentrált oldatokat Biogel P2 oszlopon (30x0,9 cm) sótalanítjuk. Az eluálőoldat 10%-os etanol. A kapott eluátumot liofilizáljuk. Az 0N-1-0N-6 mintákat radioaktív-jelezzük ³²P-y-ATP-vel és polinukleotid kinázzal. PAGE analízissel és autoradiográfiával vizsgáljuk a homogenitást. A korrekt szekvenciákat MaxomGilbert szerint szekvenáljuk úgy, hogy az oligonukleotidokat módosított szűrőpapíron immobilizáljuk [A. Rosenthal és mtsai, Nucl. Acids. Rés., 13, 1173-1184 (1985)].

b) Egymáshoz illesztés (annealing) és összekapcsolás (ligálás).

Az oligonukleotidok 250 pmól-os részleteit egymáshoz illesztés és összekapcsolás céljából 4 pCi ³²P-ATPvel (5000 pCi/mmól) és 9 egység polinukleotid kinázzal foszforiláljuk 20 μΐ kináz-pufferben [T. Maniatis és mtsai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1982)] 40 percig 37 °C-on, majd 20 perces kezelés következik 5 mM jelzetlen ATP-vel. A reakciót 1 pl 0,5 mólos EDTA-val állítjuk le 70 °C-on. A foszforilált oligonukleotidokat úgy tisztítjuk, hogy NENSORB 20 patronokra (DuPont) adszorbeáljuk és 20% etanollal eluáljuk. A kitermelés körülbelül 90%-os. Az ON-2-ON-5,5’-foszforilált és az ON-l-ON-6 nem foszforilált oligonukleotidok 30—100 pmólos azonos mennyiségeivel szimultán végezzük és egymáshoz illesztést és összekapcsolást 25 mM MgCIi-tartalmú 25 μΐ pufferben (125 mM trisz.HCl, pH=7,6). Areakcióelegyet 90 °C-on hevítjük 4 percig, majd 3 órán belül 14 °C-ra hűtjük és ezután további 14 órán át 14 °C-on inkubáljuk. A térfogatot 60 μΐ-re egészítjük ki 5 mM trisz.HCl (pH=7,6), 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 0,1 mg/ml bovin szérumalbumin és 1600-2000 egység T4-ligáztartalmú oldattal. A ligálás 14 órán át 14 °C-on történik és a reakciót 1 μΐ 0,5 mólos EDTA hozzáadásával és 70 °C-ra való hevítéssel állítjuk le. Fenolos extrahálás után a vizes oldathoz 0,3 M nátrium-acetátot és 0,01 M magnézium-acetátot adunk, a DNS-t etanollal kicsapjuk, és a terméket PAGE (8% akrilamid, 7 M karbamid) segítségével tisztítjuk. Maximálisan 10 pmól DNS-t viszünk be egy 0,5 mm vastag gél 1,5 cm-es vájataiba. A korrekt hosszúságú terméket autoradiográfiával azonosítjuk, a géldarabot kimetsszük, és a DNS-t Biotrap BT 100 készülékben 200 V-nál 6 órán keresztül

HU 205 617 Β elektroeluáljuk. Az eluátumot etanollal kicsapjuk. Kitermelés: 5-8 pmól tisztított kétszálas DNS/100 pmól oligonukleotid.

c) A szintetikus gén klónozása

Az izolált szintetikus NAF-gén 110 ng-nyi mintáját 260 ng agarózgélben tisztított SphI/BamHI-gyel hasított pBS M13 plazmid DNS-sel (Stratagene) ligáljuk. E ligázos keverék egy tized részét használjuk fel 200 μΐ E. coli K törzs kompetens sejtjeinek transzformálásához [D. Hanahan módszere: J. Mól. Biok, 166, 557580 (1983)]. Körülbelül 320 ampicillinrezisztens telepet kapunk 1 ng bevitt DNS-re számítva. Hat kiónt kiszúrunk, amelyeket L-Broth/ampicillin tápoldatban [összetétele: 10 g Bacto-tripton (Difco), 5 g Bactoyeast extrakt (Difco), 2 g NaCl és 2 g glükóz literenként; továbbá 100 mg/1 ampicillint (Bayer) is tartalmaz] tenyésztünk egy éjszakán át. A plazmid DNS-t izoláljuk [H. C. Bimbóim and J. Doly, Nucl. Acids Rés., 7, 1513-1523 (1979)], és 1%-os agarózgélben megfuttatjuk. A tiszta szuperspiralizált DNS-t úgy kapjuk meg, hogy a sávokat 3MM papírra (Whatman) elektroforetizáljuk, és Eppendorf-csövekbe centrifugáljuk. Fenolos extrahálás és etanolos kicsapás után a DNS-t a lúggal denaturált plazmid-lánc-terminációs módszerrel szekvenáljuk [E. J. Chen et al., DNS 4, 165-170 (1985)] T3 és T? primerek (Stratagene) és a szekvenáz enzim (US Biochemical Corporation) alkalmazásával.

A hat kiónból három, az 1., 2. és 6. tartalmazza a korrekt NAF szekvenciát. A többi három klón hibás volt; a 3. klón egy extra G csoportot tartalmazott az ATG startkodon után beépítve, és ezáltal a teljes kódolószekvencia kizökkent a fázisból. Az 5. kiónban a 34. pozícióban a C helyett T állt, és így a 6. aminosav után egy stopkodon képződött. Végül a 4. kiónban a 13. pozícióban egy G hiányzik. Ez a pozíció nem a kódolószekvenciában van, hanem a startkodon és a riboszóma kötőhely között levő szakaszban.

A 6. kiónból származó, korrekt szekvenciát tartalmazó plazmidot Clal és BamHI restrikciós enzimekkel hasítjuk. A hasítási elegyet agarózgélben 250 mg/liter etídium-bromidot [(2,7-diamino-10-etil-9-fenil-fenantridium-bromid)] (SIGMA) tartalmazó TBE pufferban (trisz/borát/EDTA elektrofórézis puffer) elektroforetizáljuk [Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., (1982), 454. old.]. Az ultraibolya fényben azonosított 237 bp hosszú fragmentumok elektroelucióval Whatman 3MM papírra eluálva izoláljuk az előbb leírtak szerint.

Ezt a 237 bp hosszú fragmentumot ezután egy lineáris DNS-fragmentummal ligáljuk, amely a pIL402 (Term) E. coli expressziós plazmidból származik. A pIL402 expressziós plazmid egy egységben tartalmazza az E. coli triptofán promotert, a humán granulocita-makrofág telep stimuláló faktor (hGMCSF) gént és egy szintetikus transzkripciós terminátort a pAT153 plazmid EcoRI és Sáli hasítási helyei közé inszertálva. A plazmid DNS-t Clal-gyel és BamHI-gyel hasítva kivágjuk a GM-CSF gént, és a nagyobb fragmentumot agarózgélből izoláljuk. Ez a lineáris fragmentum balról jobbra haladva a következőket tartalmazza:

- egy BamHI restrikciós hasítási helyet;

- egy CCCGGGCGATGAATCGCCCGGG vagy CCCGGGCGATTCATCGCCCGGG szekvenciájú szintetikus transzkripciós terminátort;

- a pAT153 plazmidnak a 651. nukleotidnál levő Sáli helytől a replikációs origón és ampicillinrezisztencia-génen (A^R) át a 0. nukleotidnál levő EcoRI helyig terjedő darabját;

- az E. coli triptofán promotert;

- egy Clal hasítási helyet, amely a promoterben helyezkedik el a riboszóma kötőhelytől downstream körülbelül 5 bázispárral.

Az így kapott lineáris fragmentummal ligáljuk a NAF-gént tartalmazó 237 bp hosszú Clal/BamHI fragmentumot. A kapott ampicillinrezisztens, p(NAF)-6T3nak nevezett expressziós plazmid (14. ábra) a GM-CSF gén helyére, a Clal és BamHI hasítási helyek közé inszertálva, a promoterben levő transzkripciós iniciációs helytől downstream tartalmazza a NAF-gént.

A p(NAF)-6T3 expressziós plazmiddal E, coli HB101 törzsből (ATCC 33694) származó sejteket transzformálunk.

A transzkripciós terminátor nem lényeges a NAF expressziója szempontjából E. coliban. Ez a NAFmRNS eredményes terminációját teszi lehetővé az E. coli polimerázzal együtt, és így nő a kifejeződés hozama. A NAF kifejezhető azonban ugyanebben a vektorban transzkripciós terminátor nélkül is, de ekkor a kitermelés 30-50%-kal alacsonyabb lesz.

A NAF-ot kódoló ezen szintetikus gén, valamint más olyan gének, amelyek nukleotidszekvenciája ugyan más, de ugyanezt a bázikus peptidszekvenciát kódolják, vagy különböző hosszúságú peptideket kódolnak, szintén kifejezhetők E. coliban más promoterek - ilyenek például a lambda P_L vagy az E. coli Lac vagy Tac promoterei - alkalmazásával. A géneket más vektorokba is bevezethetjük és más szervezetekben is kifejezhetjük, például élesztőkben, gombákban, állati sejtekben, bakteriális sejtvonalakban, növényekben és gén szempontjából magasabb rendű szervezetekben.

d) Expresszió

A p(NAF)-6T3 expresszióját E. coli HB101 sejtekben a következőképpen valósítjuk meg:

Előtenyészet-1: a sejtvonal -20 °C-on tartott glicerines tenyészetéből 50 μΐ-t 10 ml steril LB tápoldathoz (10 g/1 Tryptone, 5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 NaCl) adunk, mely 100 pg/ml ampicillint tartalmaz. A tenyészetet inkubátorban 8 órán át 37 °C-on 200 ford/perc mellett rázatjuk.

Előtenyészet-2: az előtenyészet-1 8 ml-ével beoltunk 1 liter M9 táptalajt [J. H. Miller, Expreriments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 431-433. oldal (1972)], mely 0,2% glükóz, 0,5% Casamino acids (Difco), 25 mg/1 triptofán és 100 pg/ml ampicillintartalmú, A tenyésztést inkubátorban végezzük 15-16 órán át 37 °C-on 200 ford/perc mellett, rázatva.

HU 205 617 Β

Fermentálás: a fő fermentálást 70 Eteres fermentorban végezzük, 35 Éter mennyiségben. Ugyanazt a táptalajt használjuk, mint amit az előtenyészet-2-höz, azzal a különbséggel, hogy csak 5 g/1 triptofánt adunk hozzá. Az előtenyészet-2-vel beoltjuk ezt a táptalajt és a fermentálást 37 °C-on végezzük, amíg 600 nm-nél az optikai sűrűség a 2,8 értéket el nem éri (00600=2,8). Amikor az ODeoo elérte a 2,8 értéket, etanolos indolakrilsavat adunk a fermentorhoz 20 mg/ml végkoncentrációig. Négy óra múlva az ODgoo 13,5-ig nőtt, s centrifugálással 516 g üledéket kaptunk.

e) A rekombináns NAF tisztítása

A rekombináns NAF-ot tartalmazó E. coE sejteket -20 °C-on tároljuk. 100 g-os sarasokat mosunk 100 ml 50 mM NaCl-ot tartalmazó 20 mmólos trisz.HCl-dal (pH=8,0), a sejteket ugyanezen pufferben reszuszpendáljuk és roncsolásuk Amino French Press készülékben történik 170 atm nyomáson (2500 psi). Ezután centrifugálás következik 47 000 g mellett 40 percig, a kapott üledéket ugyanezen pufferben reszuszpendáljuk, újra centrifugáljuk és -20 °C-on tároljuk. 10 g-os részleteket szuszpendálunk 100 ml MES-NaOH (pH=6,5) és 6 M guanidin. HCl-tartabnú oldatban, 1 órát kevertetjük, majd 0,5%-os ecetsavval szemben dializáljuk. A diaEzátumot centrifugálással derítjük és alikvot mennyiségeit MonoS oszlopra (HR 5/5, Pharmacia) visszük fel. Az oszlopot 0,2 M NaCl-tartalmú 50 mmólos MES-NaOH-val (pH=6,5) mossuk, majd 0,5 ml/perc sebességgel, ugyanezen puffeiral előáUított Eneáris gradienssel (0,2-0,5 mól NaCl) eluáljuk. A legmagasabb NAF-tartabnú frakciókat egyesítjük és nagy porozitású reverz fázisú HPLC-oszlopon (0,46x125 mm Vydac C4TP) kromatografáljuk 0,1%-os trifluor-ecetsavval és 20-60% acetonitril gradienssel, 1 ml/perc átfolyási sebesség meUetL

V. rész

A természetes és rekombináns NAF azonosítása

20. példa

Fizikokémiai azonosság

A HPLC-oszlopról visszanyert NAF-ot (19. példa) tisztának tekintjük két kritérium alapján: az ezüsttel festett poUakrilamid géleken egyetlen sáv látható, mely egybeesik a természetes NAF sávjával [a HPLC-csúcsffakcióból származó rekombináns NAF 1 pg-ja a 2-es nyomsávon, a természetes NAF 1 pg-ja a 3-as nyomsávon, s a molekulatömeg standardok az 1-es nyomsávon: citokróm C (12,5 kD) és aprotinin (6,5 kD)], továbbá a hangyasavval hasított peptid Edman-degradációja olyan amino- és karboxiterminális szekvenciákat ereményez, amelyek megfelelek a 72 aminosavból álló természetes NAF-ból kapott szekvenciáknak. Az aminosav-anaEzis a szekvenciából várt összetétellel egyezik. Metionint nem találtunk, s ez arra utal, hogy ezt a csoportot a baktériumok valószínűleg eltávolították.

21. példa

Biokémiai azonosság

A természetes és a rekombináns NAF-ot parallel teszteljük humán neutrofíleken. Gyakorlatilag mindkettő azonos változásokat hoz létre a citoszol szabad Ca²⁺-tartalmában, azaz olyan alacsony koncentráció mellett, mint a 3 nM (15. ábra), maximáüs emelkedést okoznak. Mindkét készítménnyel válaszként közel azonos, koncentrációfuggő respirációs robbantást kapunk 1-30 mM tartományban, kemilumineszcenciával meghatározva. A természetes és rekombináns NAF egyenértékű voltát a kemotaxis és exocitózis mérések is tükrözik. Kemotaktikus vándorlás figyelhető meg 0,1 és 10 nM között. Maximális hatás 1 nM-nál észlelhető (6. táblázat). Mindkét peptid esetében 0,3 nM-nál a specifikus granulumokból jelentős B₁₂-vitaminkötő proteinkibocsátás és 1 nM-nál az azurofil granulumokból béta- és glükuronidázkibocsátás figyelhető meg. Ez a hatás a stimulus koncentrációjával növekszik, amint ez a 7. táblázatból kitűnik.

6. táblázat

NAF indukálta neutrofil kemotaxis

NAF(nM)	Természetes NAF	Rekombináns NAF
0,1	98+6	88+6
1,0	123±6	124+3
10,0	127+3	126+4
Az értékek a vezető migrációs front középértékeit reprezentálják (± standard eltérés) pm-ben (n=3). Akemotakti-
kus stimulus nélküli random migráció=61±5 pm.

7. táblázat

NAF indukálta exocitózis

NAF(nM)	B72-vitamin-kötő protein	Béta-gltlkuronidáz
Természetes NAF	Rekombináns NAF	Természetes NAF	Rekombináns NAF
0,3 3,0 30,0	7,8+3,6 2I,9±4,2 28,4+3,7	5,4+2,0 20,2+3,7 28,1+3,8	l,l±0,8 8,2+1,9 14,2±2,1	0,8+0,6 7,1±1,7 12,9+2,9
Természetes vagy rekombináns NAF-fal 10 percig stimulált citochalasin B-vel előkezelt neutrofil sejtekből (4106 sejt ml) való kibocsátás%-ban. A megfelelő nem stimulált kontrollokból való kibocsátást levontuk. Középértékek+standard eltérés (n=3).

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás neutrofilaktiváló faktor (NAF) - amelynek aminosav-szekvenciája

   Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-LysThr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-LysGlu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro-His-Cys-AlaAsn-Thr-Glu-Ile-Ile-Val-Lys-Leu-Ser-Asp-Gly-ArgGlu-Leu-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Glu-Asn-Trp-Val-Gln

   -Arg-Val-Val-Glu-Lys-Phe-Leu-Lys-Arg-Ala-Glu-Asn

   -Ser vagy N-terminális végén az Ala-Val-Leu-Pro-Argszekvenciával meghosszabbított vagy a Ser-AIa- vagy Ser-Ala-Lys-szekvenciával megrövidített változatai előállítására, azzal jellemezve, hogy donorvérek fehér14

   HU 205 617 Β vérsejt trombocitarétegéből izolált humán monocitákat lipopoliszachariddal, fitohemagglutininnal vagy konkanavalin A-val stimulálunk, tápoldatban tenyésztünk, a tenyészet felülúszóját elkülönítjük, és foszfocellulózoszlopon 7,2 pH-η végzett kromatografálással előtisztítjuk; majd vagy foszfocellulóz-oszlopon 7,0 pH-η kromatografáljuk, és a 6500 D molekulatömegnek megfelelő csúcs körül eluálódó frakciókat gyűjtjük; vagy hidroxil-apatiton 6,9 pH-η kromatografáljuk; vagy heparin-Sepharose-on 7,3-nál magasabb pH-η kromatografáljuk, majd fordított (reverz) fázisú hidrofil oszlopon 0-80% acetonitril-gradienssel és fordított fázisú ciano-propil oszlopon 0-50% propánok tartalmazó acetonitril-gradienssel eluálva nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) tisztítjuk; vagy 9,4 pH-n kromatofókuszáljuk, majd 7,0 pH-jú pufferral eluláljuk, és a 8,5-8,8 pH közötti tartományban eluálódó aktív frakciókat egyesítjük; vagy két vagy több előbb említett kromatográfiás módszer kombinálásával tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1988. 03. 03.)
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az N-terminálisán Ala-Val-Leu-Pro-Arg-Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-CysGln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-ProLys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-GlyPro- vagy

   Ser-Ala-Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-LysThr-Tyr-Ser-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-LysGlu-Leu-Arg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro- vagy

   Lys-Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-TyrSer-Lys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-LeuArg-Val-Ile-Glu-Ser-Gly-Pro- vagy

   Glu-Leu-Arg-Cys-Gln-Cys-Ile-Lys-Thr-Tyr-SerLys-Pro-Phe-His-Pro-Lys-Phe-Ile-Lys-Glu-Leu-ArgVal-Ile-Glu-Ser-Gly-Proszekvenciát tartalmazó neutrofilaktiváló faktor változatainak előállítására, azzal jellemezve, hogy a közvetlenül az aprotinin után, de jóval az aktinomicin D előtt eluálódó és körülbelül pH 8,6 izoelektromos pontú frakciókat gyűjtjük. (Elsőbbsége: 1987.11.19.)
3. 3. Eljárás az 1. igénypont tárgyi körében megadott neutrofilaktiváló faktor (NAF) vagy az 1. igénypontban megadott változatai előállítására, azzal jellemezve, hogy a 13. ábrán megadott ON-l-ON-6 oligonukleotidokat szintetizálunk, tisztítunk és ligálunk, majd a kapott szintetikus NAF-gént expressziós plazmid DNS-be klónozzuk, és a plazmidot, előnyösen a p(NAF)-6T3-at E. coliban, előnyösen E. coli HB 101-ben kifejezzük és a kifejeződött fehérjét a sejtek feltárásával kinyerjük, majd guanidínium-klorid pufferban reszuszpendálva, ecetsavoldattal szemben dializáljuk, szulfonsavcsoportokat tartalmazó kationcserélő oszlopon 63 pH-nál kromatografáljuk, és végül egy fordított fázisú oszlopon 20-60% acetonitril-gradienssel végzett nagynyomású folyadékkromatográfiával tisztítjuk. (Elsőbbsége: 1988.10.28.)
4. 4. Eljárás az 1. igénypont tárgyi körében megadott aminosav-szekvenciájú NAF vagy változatai E. coliban való kifejezésére alkalmas szintetikus gén előállítására, azzal jellemezve, hogy a

   Clal Tagi *44 <-_0N . ! CATCGATAGCT ATG AGT GCT AAA GAA CTT CGA TGT CAG TGC ATA GTACGTAGCTATCGA TAC TCA CGA TTT CTT GAA GCT ACA GTC ACG TAT <--ON-2 Met Ser Alá Lys Glu Leu Arg Cys Gin Cys Ile 1 10 *89

   ---> <AAG ACA TAC AGC AAA CCT TTC CAC CCC AAA TTT ATC AAA GAA CTG TTC TGT ATG TCG TTT GGA AAG GTG GGG TTT AAA TAG TTT CTT GAC

   --><Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu *134

   --ON - 3-AGA GTG ATT GAG AGT GGA CCA CAC TGC GCC AAC ACA GAA ATT ATT TCT CAC TAA CTC TCA CCT GGT GTG ACG CGG TTG TGT CTT TAA TAA

   --ON-4Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Alá Asn Thr Glu Ile Ile

   30 40 *179

   ----> < __GTA AAG CTT TCT GAT GGA AGA GAG CTC TGT CTG GAC CCC AAG GAA CAT TTC GAA AGA CTA CCT TCT CTC GAG ACA GAC CTG GGG TTC CTT

   -,---> <Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg .Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu

   HU 205 617 Β *224

   --ΟΝ- 5AAC TGG GTG CAG AGG GTT GTG GAG AAG TTT TTG AAG AGG GTC GAG TTG ACC CAC GTC TCC CAA CAC CTC TTC AAA AAC TTC TCC CGA CTC

   --ON-6Asn Trp Val Gin Arg- Val Val Glu Lys Phe Len Lys Arg Alá Glu

   60 70 *230 BamHI

   ->

   AAT TCA TAA TAA TGA G

   TTA AGT ATT ATT ACT CCTAG

   ->

   Asn Ser * * * képlettel ábrázolt nukleotidszekvenciájú oligonukleotidot vagy ugyanezen aminosavakat kódoló ekvivalensét szerkesztjük az ON-l-ON-6 oligonukleotidok szintetizálása, tisztítása és ligálása útján, és pBS M13' plazmid DNS-be klónozzunk.

   (Elsőbbsége: 1988.10.28.)
5. 5. Eljárás hatóanyagként az 1. igénypont tárgyi körében megadott neutrofilaktiváló faktort tartalmazó gyógyszerkészítményekelŐállítására,űzzű/ jellemezve, hogy a hatóanyagot a gyógyszertechnológiában szo20 kásosan alkalmazott hordozó-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagokkal keverjük, és a keveréket ismert módon gyógyszerré elkészítjük. (Elsőbbsége: 1987. 11.