JPH1156368A - 猫トロンボポエチンの活性を有する因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 猫の血小板減少症、手術の予後、放射線治療
に有効であると思われる猫トロンボポエチン活性を有す
るタンパク質を大量に生産する技術を確立する。 【解決手段】 猫トロンボポエチン活性を有するタンパ
ク質をコードする遺伝子を含む組換え発現ベクターを有
する形質転換体を用いて、猫トロンボポエチン活性を有
するタンパク質を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は猫トロンボポエチン
の活性を有するタンパク質及びそれをコードする遺伝子
に関し、詳細には、猫における巨核球−血小板系造血の
促進因子として有用な猫トロンボポエチン活性を有する
タンパク質、その製造法、及びその使用に関するもので
ある。

【０００２】

【発明の背景と従来の技術】血小板は、血液中に存在す
る直径２〜３μｍの無核の細胞である。ヒトの場合は、
血液１ｍｍ³ あたり１５万〜４０万個存在し、その寿命
は約１１日である。血小板は外傷その他の出血に対し
て、止血メカニズムの中心的な役割を持つ。すなわち、
血管内皮細胞に障害が起こると血小板が接触して粘着
し、活性化されて凝集反応が起こる。これによって血小
板のみからなる血栓ができ、続いて血液凝固系が始動さ
れてフィブリン形成による血栓が形成され、完全に止血
される。したがって、血中の血小板濃度が減少したとき
は止血メカニズムが十分に機能せず、外傷や手術等の出
血を伴う事故や治療は時には致命的な結果をもたらす。

【０００３】血小板の寿命は約１１日と短いが、血液中
の血小板濃度は定常状態においてほぼ一定に保たれてい
る。例えば、実験動物において種々の方法で血小板を減
少させても、数日の内に血液中に血小板数の回復が認め
られている。１９５５年 Craddock ら（Craddock, C.
G. et al., J. Lab. Clin. Med., 45: 906-919, 1955）
は、イヌに急性の血小板減少を引き起こすと回復期には
リバウンドの血小板増多が起こることを、また１９６１
年には Cronkite ら（Cronkite, E. P. et al., in Blo
od platelets (Johson, S. A. et al. eds) p595, Litt
le Brown, Boston, 1961）が、血小板輸血によって引き
起こされた血小板増多のあとにはリバウンドの血小板減
少が起きることを報告している。⁷⁵Selenomethionine（
⁷⁵SeM ）や³⁵Ｓなどのアイソトープを使った血小板産生
の測定法によってその液性因子の活性が測定されるよう
になり、その因子は、血小板減少時には増加し、血小板
増多時には減少することが明らかにされた。すなわち、
他の各種血液細胞と同様、血中の血小板数の調節にも造
血幹細胞から成熟血球に至る過程において増殖と分化を
誘導する種々の造血因子が関与する。巨核球・血小板産
生過程については例えば総説（Stenberg, P. E., Levi
n, J. Blood Cells, 15: 23-47, 1989）に詳しく説明
されている。

【０００４】一般的には、巨核球・血小板産生の過程は
次のように考えられている。前駆細胞であるColony for
ming unit-megakaryocyte （CFU-M ）は数回の分裂を繰
り返し、巨核球へと分化する。以後は細胞分裂を行わず
ＤＮＡ合成だけが行われ、8-32N のＤＮＡを有する倍数
体の巨核芽球になる。その巨核芽球がそれぞれのＤＮＡ
量をもつ前巨核球、巨核球へ成熟し、巨核球の細胞質か
ら血小板が形成される。これらの分化・成熟過程には、
少なくとも２つ以上の液性因子（Meg-CSF, トロンボポ
エチン）が関与するとされている。Meg-CSF は、CFU-M
のレベルで巨核球造血を調節する因子であり、トロンボ
ポエチンは、巨核球の成熟、血小板の放出を促進して、
血小板産生を巨核球のレベルで調節する。

【０００５】その他にも、現在までに巨核球・血小板産
生に明らかに関与していることがわかっているものとし
ては、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＬ−６など
があげられる（Hill, R. J., Levin, J. Blood Cells,
15: 141-161, 1989）。しかし、これらの因子は巨核球
・血小板系の増殖や分化のみではなく、各系統の血球の
分化にも関与するなどきわめて多彩な生物活性を示す。
そのため、これらの因子を生体に投与すると種々の副作
用を生ずる。また、投与したヒト・動物における血小板
数の増強作用もトロンボポエチンの３分の１から４分の
１であり、効果も低い。

【０００６】そして上記の巨核球・血小板産生に関与す
る因子のなかでもトロンボポエチンは、血小板生産誘導
活性が強力でかつ特異的であるため治療薬として期待さ
れている。例えばヒト、マウスにおいて分離・同定され
たトロンボポエチン遺伝子（de Sauvage, F. J. et a
l., Nature, 369: 533-538, 1994; Bartley, T. D. eta
l., Cell, 77:1117-1124, 1994; Lok, S. et al., Natu
re, 369: 565-567, 1994 ）は、すぐにトロンボポエチ
ンの大量生産に利用され、精製されたトロンボポエチン
は、現在、動物試験に応用されており、その結果、実験
的な血小板減少を伴う疾患に対して、特に重篤な副作用
も起こさずに血小板を増加させることが報告されている
（寺村正尚，「医学の歩み」174 ；121-124, 1995 、石
橋敏幸，「医学の歩み」174 ；703-706, 1995 、河北
誠，「医学の歩み」174 ；1098-1102,1995 、石田陽
治，「実験医学」7 ；1784-1789 ，1989）。近い将来、
ヒトでの臨床投与が試みられ、ヒトの血小板減少を伴う
疾患（Fanconi 症候群、巨核球性血小板減少症、再生不
良性貧血等）に対して重篤な副作用も起こさずに血小板
を増加させることが期待される。また、造血疾患に限ら
ず、ガン化学療法や放射線療法時の血小板減少にもトロ
ンボポエチンは有効と思われる。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにトロンボ
ポエチンは血小板減少症に有効な治療薬として考えられ
る。

【０００８】ところで、ヒトの臨床治療の場合と同様
に、最近では、猫に高度な治療を施すようになっている
ため、血小板減少症、手術の予後、放射線治療に有効で
あると思われる猫トロンボポエチンを使用することにつ
いての要望が増しているが、実際には、猫トロンボポエ
チンは、猫を飼育したり、また、猫由来の細胞を培養す
るなどして大量に生産し、製薬として精製する技術が提
案されておらず、したがって猫に治療剤として使用する
のに必要な十分量を入手することは困難である。その対
策としては、ヒト用のトロンボポエチンを流用する事も
考えられるが、ヒトトロンボポエチンに対して免疫反応
を惹起して免疫病を引き起こす危険性があり、また、投
与によって中和抗体を誘導し治療効果がなくなる可能性
があるため適当でない。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記既知
因子の持つ問題点に鑑み、猫トロンボポエチンの活性を
有するタンパク質を安価に供給すべく、猫トロンボポエ
チン活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をクロ
ーニングし、さらに該遺伝子を有する発現ベクターを作
製し、上記特許請求の範囲の各請求項に記載した本発明
を完成するにいたった。

【００１０】すなわち、本願の請求項１の遺伝子の発明
は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする
ことを特徴とする。

【００１１】（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなる
タンパク質。

【００１２】（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における
１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ巨核球の増殖及び成熟
分化を促進する猫トロンボポエチンの活性を有するタン
パク質。

【００１３】また、本発明よりなる組換えタンパク質
は、以下の（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を有し、か
つ巨核球の増殖及び成熟分化を促進する猫トロンボポエ
チンの活性を有することを特徴とする。

【００１４】（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配
列。

【００１５】（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
における１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換あるい
は付加されたアミノ酸配列。

【００１６】本発明の上記のアミノ酸配列を有する猫ト
ロンボポエチンの生物活性を有するタンパク質は、配列
番号２の塩基配列を持つＤＮＡ断片、あるいは猫トロン
ボポエチンをコードするゲノム遺伝子から転写・翻訳さ
れたものである必要は必ずしもなく、例えば、化学合成
法等により生産されるものであってもよい。また、配列
番号１のアミノ酸配列をコードする配列番号２の塩基配
列も、化学合成法、逆転写法、ＰＣＲ法などいずれの方
法によって得たものであっても良いが、一般的には猫由
来の遺伝子であることが好ましい。

【００１７】本発明はさらに当該遺伝子を用いる遺伝子
組換え技術による猫トロンボポエチン活性を有するタン
パク質（以下「猫トロンボポエチンタンパク質」という
場合がある）の製造方法にも関する。

【００１８】すなわち、猫トロンボポエチン活性を有す
るタンパク質の生産細胞は次のようにして作出すること
ができる。

【００１９】形質転換体の宿主細胞が真核細胞の場合
は、例えば、配列番号１に示す猫トロンボポエチン活性
を有するタンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
断片をウイルス等のプロモータの制御下に発現するよう
に結合させ、組換え発現ベクターを作製し、その組換え
発現ベクターを用いて真核細胞を形質転換させて形質転
換体（形質転換細胞）を得、適当な選択薬剤存在下で形
質転換細胞を選択し、増殖してきた細胞クローンのう
ち、猫トロンボポエチン活性を有するタンパク質を生産
するクローンを選択することにより、該猫トロンボポエ
チン活性を有するタンパク質を生産する細胞株を作出す
ることができる。

【００２０】同様に、宿主細胞が原核細胞である場合
は、例えば、大腸菌のプロモータを有する組換え発現ベ
クターに配列番号１に示す猫トロンボポエチンン活性を
有するタンパク質をコードするＤＮＡ断片を連結し、作
製した発現ベクターで大腸菌を形質転換させて猫トロン
ボポエチン活性を有するタンパク質を生産する細胞を作
出することができる。

【００２１】また、バキュロウイルス等の組換えウイル
スベクターを用いた場合は、たとえば、Smith らの方法
（Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156-2165）に
基づいて、組換えウイルスベクターを作出することがで
きる。すなわち、猫トロンボポエチンタンパク質をコー
ドするＤＮＡ断片をバキュロウイルスの多核体プロモー
タと連結し、そのトランスファーベクターをバキュロウ
イルスＤＮＡとともに昆虫細胞に導入し、得られた組換
えバキュロウイルスのうち、猫トロンボポエチン活性を
有するタンパク質を産生する組換えウイルスクローンを
選択し、その組換えクローンを昆虫細胞もしくは昆虫に
感染させ、猫トロンボポエチンタンパク質を製造するこ
とができる。

【００２２】さらに、一般的な遺伝子操作技術・細胞工
学技術によって、たとえばシグナル配列の付加や改良、
宿主−ベクター系の好適選択、遺伝子の発現制御部位の
改良等により発現効率の調節などを図ることができる。
また、宿主の選択により糖鎖が結合されたものとして得
ても良い。

【００２３】なお、以上の操作は、Sambrookら（Sambro
ok et al, 1989, Molecular cloning: a laboratory ma
nual. 2nd edition, Cold Spring Harbor, New York: C
oldSpring Harbor Press ）等の既知の遺伝子操作技術
・細胞工学技術にしたがって行うことができる。

【００２４】本発明のその他の特徴は、上記形質転換さ
れた細胞を培養し、生産される猫トロンボポエチンタン
パク質を分離回収することによって該タンパク質を製造
する方法にある。大量に発現する形質転換細胞からの上
記タンパク質の分離は通常の方法、例えばイオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、疎水性カラムクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーを組み合わせ
て行うことができるが、特にアフィニティカラムクロマ
トグラフィーによる方法が好ましく用いられる。なお、
以上の操作は、例えば、Doonanら（Methods in Molecul
ar Biology, Vol. 59, Protein Purification Protocol
s, ed. S. Doonan, Humana Press, 1996）等の既知のタ
ンパク質精製技術にしたがって行うことができる。

【００２５】本発明によれば、形質転換させた細胞等を
用いて猫トロンボポエチンタンパク質を大量に生産する
ことができる。

【００２６】本発明はさらに、猫トロンボポエチンを有
効成分として含有する動物医薬組成物、特に猫の血小板
減少治療薬として好ましく用いられる。また、猫トロン
ボポエチンを用いれば、公知の手法により特異抗体を得
ることもできる。この特異抗体は猫トロンボポエチンを
測定する手法に特に有効で、それにより、猫の血小板減
少症の診断等に関する情報を得ることができる。

【００２７】

【発明の実施の形態】配列番号１のアミノ酸配列を有す
る猫トロンボポエチンの生物活性を有するタンパク質は
以下のように同定される。

【００２８】猫の肝臓もしくは腎臓からＲＮＡを抽出
し、そのＲＮＡに対してｃＤＮＡを作製し、ヒト・マウ
スですでに報告されている遺伝子配列を元に作製した合
成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ チ
ェーン リアクション）法により目的とする遺伝子領域
を増幅する。これを市販のベクターに組み込んで塩基配
列を決定し、ヒト・マウスのトロンボポエチン遺伝子と
相同性のあるクローンを選択する。さらに、得られたク
ローンの塩基配列をもとにＤＮＡプライマーを作製し、
ＰＣＲにより増幅し、タンパク質をコードする全塩基配
列を決定する。クローン化されたｃＤＮＡのタンパク質
をコードする遺伝子断片を発現ベクターに組み込み、ヒ
ト培養細胞で発現させ、生物活性を確認する。

【００２９】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００３０】（１）ｃＤＮＡの合成 トロンボポエチンは正常マウスでは主として腎臓、肝臓
で生産されることが報告されている（Lok, S. et al.,
Nature, 369: 565-567）。したがって、猫トロンボポエ
チンのｍＲＮＡを得るために、正常な猫から摘出した腎
臓および血小板減少を呈した猫から摘出した肝臓を使用
直前まで液体窒素で凍結保存した。凍結臓器サンプルを
液体窒素で冷却しながら乳鉢で粉砕し、直ちにＩｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社から販売されているＦａｓｔＴＲＡＣＫ
^TM ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔに添付され
ているＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒで組織を溶解した。次
に、本キットに添付されているプロトコールにしたがっ
てポリＡ⁺ ＲＮＡを分離し、エタノール沈殿状態とし
た。

【００３１】次に、得られたポリＡ⁺ ＲＮＡ ５μｇ
を滅菌蒸留水に溶解し、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社より販売
されているｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔを用
いて、添付のプロトコール通りに反応を行い、ｃＤＮＡ
を合成した。

【００３２】（２） プライマーの合成 ヒトおよびマウスのトロンボポエチン遺伝子の間でよく
保存されている領域の塩基配列をもとに、下記の塩基配
列を有するＤＮＡプライマー、２Ｓ、２Ｒ、３Ｓ、３Ｒ
を合成した。

【００３３】 ２Ｓ 5'-CTGCTGCCTGCTGTGGACTT-3' ２Ｒ 5'-TCTCCAACAATCCAGAAGTC-3' ３Ｓ 5'-GGAGAGGCCCCAAACAGGGAG-3' ３Ｒ 5'-GTGAGCTGTGGTCCTGCCCTG-3' これらのプライマーはヒトトロンボポエチン遺伝子の塩
基配列に次のように対応する。２Ｓは３６９番目から４
１５番目の塩基配列に、２Ｒは８２９番目から８０９番
目の塩基配列に、３Ｓは１６８番目から１８８番目の塩
基配列に、３Ｒは６４１番目から６２１番目の塩基配列
に対応する。

【００３４】なお、理解を容易にするために以降の操作
に用いたプライマーをも含め、ｍＲＮＡとそのコードす
るトロンボポエチンタンパク質のドメインとの位置関係
を図２に示した。

【００３５】（３） ＰＣＲによる増幅 ２Ｓ、２Ｒ、３Ｓ、３Ｒを組み合わせ、ｃＤＮＡ（１μ
ｇ）、２組のプライマー（それぞれ０．５μｇ）、Ｔａ
ｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／ｍｌ）を用いて、市販
のＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｋｉ
ｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製）にて全量５０μｌ
で、３０サイクルからなるＰＣＲを行った。引き続き、
このＰＣＲ産物５μｌを用いて別のプライマーペアでＰ
ＣＲを行った。

【００３６】１サイクルの内容は以下の表１の通りであ
る。

【００３７】

【表１】

【００３８】最終産物である２Ｓ２ＲーＰＣＲ断片（３
９４ｂｐ）および３Ｓ３ＲーＰＣＲ断片（４３２ｂｐ）
を３％アガロースゲルで電気泳動を行い、分離し、エチ
ジウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下でＤＮＡ断
片を切り出し、Ｔａｋａｒａｓｕｐｒｅｃ−０１カラム
（宝酒造社製）にて、添付のプロトコルにしたがってｃ
ＤＮＡを回収した。

【００３９】（４） ＰＣＲ産物のクローニングおよび
塩基配列の決定 上記（３）で得られたｃＤＮＡフラグメントをそれぞ
れ、ＴＡ−ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社製）にてｐＣＲＩＩプラスミドベクターへ組み込
んだ後、大腸菌ＩＮＶαＦ’株（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ、Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）へ遺伝子導入し、これをアン
ピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、５−ブロモ−４−クロロ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（３６μｇ／
ｍｌ）および イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシ
ド（４０μｇ／ｍｌ）を含んだ２ｘＹＴ培地のプレート
にまいた。３７℃に１２時間程度放置し、現れてきたコ
ロニーをランダムに選択し、２ｍｌのアンピシリン（５
０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で一晩培養した。遠心に
より大腸菌を集菌した後、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１
０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭエチレンジア
ミン４酢酸（ＥＤＴＡ）、５％トリトンＸ−１００を含
むバッファに大腸菌を浮遊させ、２５０μｇのリゾチー
ムを加えて大腸菌の細胞壁を破壊した。大腸菌の浮遊液
を１００℃の温浴で４０秒間熱することで溶菌し、１２
０００ｇで１０分間遠心し、ペレットを除いた。上清に
１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と等量
のイソプロパノールを加え、核酸を沈殿とし、１２００
０ｇで５分間遠心して沈殿を回収した。沈殿を７０％エ
タノールで洗浄し乾燥させた後、２０μｇ／ｍｌのＲＮ
ａｓｅを含むＴＥバッファ（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ
８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解した。プラスミド
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル
で電気泳動することにより、目的のｃＤＮＡが組み込ま
れているプラスミドＤＮＡを持つ大腸菌クローンを選択
した。

【００４０】ｃＤＮＡが組み込まれていた大腸菌クロー
ンを５０ｍｌのアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む
ＬＢ培地で一晩培養し、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ
ＭｉｄｉＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．製）にて、
添付のプロトコールに従い、プラスミドＤＮＡを抽出し
た。

【００４１】プラスミドに組み込まれたｃＤＮＡの塩基
配列をＡｕｔｏ Ｒｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋ
ｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付のプラ
イマーで決定した。

【００４２】２Ｓ２Ｒフラグメントは３９４ｂｐのN-te
rminal region の後半部分に相当し、また、３Ｓ３Ｒフ
ラグメントは４３２ｂｐの塩基からなり、５’非翻訳領
域からN-terminal region の途中までを含む部分に相当
した（図２）。

【００４３】（５） Ｃ末端部分のクローニングおよび
塩基配列の決定 上記（４）で塩基配列を決定したＰＣＲ断片にはＣ末端
部分が入っていないと予想されたので、さらに、以下の
プライマーを追加し、上記（３）のプロトコールに従
い、ＰＣＲを行った。

【００４４】４Ｒ 5'-AATTTCTGCAGAAAATAGACG-3' ４Ｒはヒトトロンボポエチン遺伝子の１５０８番目から
１５２８番目の塩基配列に対応する。また、上記（４）
で決定した猫トロンボポエチンの塩基配列から以下の６
Ｓ、７Ｓを合成した。

【００４５】 ６Ｓ 5'-CCTACCTGCCTCTCATCCCTCCTGGGACAG-3' ７Ｓ 5'-CAACTGCTCCGAGGAAAGGTGCGCTTCCTG-3' これらのプライマーを用いたＰＣＲのサイクル条件は下
記表２に示した。

【００４６】

【表２】

【００４７】得られた７Ｓ４Ｒ−ＰＣＲ断片は上記
（４）で示した方法でプラスミドにクローニングし、塩
基配列を決定した。

【００４８】（６）塩基配列の特徴 上記（４）、（５）で得られた塩基配列を結合編集して
１３１３塩基からなるｃＤＮＡ配列を作製した。この配
列中には１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）が存在した。その配列の特徴とクローニングに用い
たプライマーとの位置関係を示した模式図を図２に示
す。さらに、この塩基配列およびコードされる３４９ア
ミノ酸残基からなるタンパク質のアミノ酸配列を配列番
号１に示した。また、このアミノ酸配列とヒト、マウ
ス、ラット、イヌのトロンボポエチンの塩基配列、アミ
ノ酸配列とを比較して図１に示し、これら遺伝子の相同
性を数値化して下記表３に示した。

【００４９】

【表３】

【００５０】本ｃＤＮＡの塩基配列、コードするアミノ
酸配列はヒト、マウス、ラット、イヌのトロンボポエチ
ンと高い相同性を示し、それぞれ、塩基配列で７５〜８
５％、アミノ酸配列で７０〜８３％であり、この遺伝子
が猫のトロンボポエチンであることを強く示す。また、
N-terminal region がこれらの動物種でよく保存されて
おり、C-terminal region では保存性が低いという分子
内保存性の点、また、N-terminal region のシステイン
残基の位置が保存されている点もこの遺伝子が猫のトロ
ンボポエチンであることを強く示す。

【００５１】この遺伝子が猫のトロンボポエチンである
ことを確認するために動物細胞での発現を試みた。

【００５２】（７）遺伝子産物の動物細胞での発現 上記（４）、（５）で得られた塩基配列から、ＯＲＦ全
体をＰＣＲで増幅できるように以下のプライマーを合成
した。

【００５３】 ＦＳ３ 5'-CCAACCAGACAGCGTGGCCAG-3' ＦＲ 5'-ATCTCGAGGGGCCCTAGTACCTTA-3' これらのプライマーを用い、上記（１）で調整したｃＤ
ＮＡを鋳型として、９４℃１分、５０℃１分、７２℃２
分を１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、全
ＯＲＦを含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ産
物のｐＣＲＩＩベクターへの結合、大腸菌への導入、お
よび、プラスミドの調製方法は上記（４）の第一段落に
示した一連のプロトコールに従った。

【００５４】さらに、このプラスミドよりＯＲＦを含む
ＥｃｏＲＩ- ＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩベクターより切り
出し、動物細胞での発現ベクターｐＤＬ−ＳＲα２９６
ベクター（Takebe et al., Mol. Cell. Biol., 8: 466-
472, 1988 ）のＥｃｏＲＩ部位に導入した。構築したプ
ラスミドの大腸菌への導入と、プラスミドの調製方法は
上記（４）の第一段落に示した一連のプロトコールに従
った。インサートのプロモータに対する方向は制限酵素
ＫｐｎＩもしくは制限酵素ＰｓｔＩによる切断で確認し
た。

【００５５】次に、宿主として、ヒト由来２９３細胞
（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）を用い、この２９３
細胞を１０％の非動化牛胎児血清（ＦＢＳ）を含むDulb
ecco変法イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）で維持し、
形質転換の前日に２９３細胞を組織培養用６穴プレート
に１穴あたり２ｘ１０⁵ 細胞ずつ分注し、一晩、培養し
た。

【００５６】形質転換に用いたＤＮＡ−リン酸カルシウ
ム沈殿は１穴分を次のように準備した。精製した５μｇ
の発現ベクターＤＮＡを１３２μｌの滅菌蒸留水に溶解
し、１５０μｌの２ｘＨＢＳ（１．８ｍＭ リン酸ナト
リウム、１０ｍＭ 塩化カリウム、２８０ｍＭ 塩化ナ
トリウム、４０ｍＭ ４−（２−ハイドロキシエチル）
ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ｐＨ７．０５））
に混合した。その中にゆっくりと２０．４μｌの２．０
Ｍ塩化カルシウムを撹拌しながら滴下した。室温で３０
分間静置した後、やや白濁した混合液を２９３細胞の培
養ディッシュに滴下した。沈殿を加えたまま、細胞を１
２時間、５％炭酸ガス存在下、３７℃で培養した。培養
液を捨て、ＤＭＥＭで一回洗浄した後、１０％ＦＢＳを
含むＤＭＥＭを加えてさらに７２時間培養した。培養上
清を回収し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心して上清を
トロンボポエチンタンパク質の活性測定に用いた。

【００５７】（８） トロンボポエチン活性の測定 猫トロンボポエチンタンパク質の生物活性は、ヒトＴＰ
Ｏ依存性増殖を示すＵＴ−７／ＴＰＯ細胞（Komatsu et
al., Blood, 87: 4552-4560, 1996）を用いたバイオア
ッセイにより検討した。

【００５８】この定量系は猫細胞を用いた系ではない
が、対象とするサイトカイン・リンフォカイン等の生物
活性の種特異性が低い場合には、一般的に異種で用いら
れているアッセイ系を利用し生物活性を測定する、例え
ば、インターロイキン−４（Howard et al., J. Exp. M
ed., 155: 914, 1982 ）、インターロイキン−７（Conl
on et al., Blood, 74: 1368, 1989）、顆粒球コロニー
刺激因子（Shirafuji etal., Exp. Hematol., 17: 116,
1989）など、多数のサイトカイン・リンフォカイン等
の活性測定で採用されている。

【００５９】ＵＴ−７／ＴＰＯ細胞は１０％ＦＢＳを含
むIscove変法ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）に１０ｎｇ／ｍｌの
ヒトトロンボポエチンを加えた培養液で維持した。ＵＴ
−７／ＴＰＯ細胞を１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭで３回
洗浄し、５×１０³ ／穴の濃度になるように９６穴マイ
クロプレートに播種し、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭで
５倍段階希釈した猫トロンボポエチンサンプルを等量添
加した。アッセイは一希釈につき２穴で行った。

【００６０】以上のように調整した培養でＵＴ−７／Ｔ
ＰＯ細胞を３７℃、５％ 炭酸ガス存在下で７２時間培
養した。細胞の増殖は次のようにヘキソアミダーゼ活性
を測定する方法で判定した。

【００６１】すなわち、培養終了後、各穴に６０μｌの
発色液（３．７５ｍＭ ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニド、０．２５％ トリト
ンＸ−１００、５０ｍＭ クエン酸バッファ（ｐＨ５．
０））を加え、細胞を溶解すると同時にヘキソアミダー
ゼを細胞より遊離させ、３７℃で４時間、ヘキソアミダ
ーゼによる発色反応を行わせた。９０μｌの停止液（５
ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ グリシンバッファ（ｐＨ１
０．４））を反応液に添加することで酵素反応を停止
し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて反応物である
色素の吸収波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。結果を
図３に示した。

【００６２】この結果により、猫トロンボポエチンｃＤ
ＮＡを発現した細胞の培養上清を加えた場合、濃度依存
的に細胞が増殖して高い吸光度を示すことが確認され、
以上のことから本例の遺伝子がトロンボポエチン活性を
有するタンパク質を産生すると判断され、該遺伝子が猫
トロンボポエチンタンパク質をコードすることが証明さ
れた。

【００６３】

【発明の効果】本発明によれば、従来、特に猫の血小板
減少時の治療薬等の動物用医薬組成物として使用するの
に必要な十分量を入手することが困難であった、ネコト
ロンボポエチンの活性を有するタンパク質を、このタン
パク質をコードする遺伝子を含む形質転換体を用いて大
量に製造することができるという効果が奏される。

【００６４】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：328 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：アミノ酸
（amino acid） トポロジー：直鎖状（linear） 配列の種類：タンパク質（protein ） 起源 生物名：猫（feridae felis catus ） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：２８−８０ 特徴を決定した方法：ｐ 配列の特徴 特徴を表す記号：猫トロンボポエチン 存在位置：1-328 特徴を決定した方法：ｐ 配列 Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala -20 -10 Arg Leu Asn Leu Cys Leu Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu 1 10 Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Lys Leu Ser 20 Gln Cys Pro Asp Val Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 30 40 Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Lys Glu Gln Thr Lys 50 Ala Gln Asp Val Leu Gly Ala Ala Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 60 70 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 80 90 Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu 100 Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Glu 110 120 Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val 130 Arg Phe Leu Leu Ile Val Val Gly Pro Thr Leu Cys Ala Lys Gln Ala 140 150 Leu Pro Thr Thr Ala Gly Pro Ser Asn Thr Ser Val Val Leu Thr Leu 160 170 His Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Phe Leu Glu Thr Asp Ser Arg 180 Val Ala Ala Arg Thr Thr Gly Phe Gly Leu Leu Lys Arg Leu Gln Gly 190 200 Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Arg Leu Asn Gln Thr Ser Arg Tyr Leu 210 Asp Gln Ile Pro Gly His Val Asn Arg Thr His Gly Pro Leu Thr Gly 220 230 Thr His Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Pro Arg Ala Leu Gly Ala Leu 240 250 Pro Gly Thr Ser Asp Met Ser Ser Leu Pro Pro Asp Leu Trp Pro Gly 260 Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe 270 280 Ser Pro Ser Pro Thr Ser Pro Thr Pro Pro Ile Gln Leu His Pro Leu 290 Leu Pro Asp Pro Ser Val Thr Pro Asn Ser Ala Ser Pro Leu Leu Ile 300 310 Ala Pro His Pro His Phe Gln Asn Leu Ser Gln Glu Glu 320 328 配列番号：２ 配列の長さ（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＥＮＧＴＨ）：1313 配列の型（ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＴＹＰＥ）：核酸（Nucl
eic acid） 鎖の数（ＳＴＲＡＮＤＥＤＮＥＳＳ）：二本鎖（doubl
e） トポロジー：直鎖状（linear） 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：猫（feridae felis catus ） 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：28-1074 特徴を決定した方法：ｐ 配列の特徴 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：28-80 特徴を決定した方法：ｐ 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：81-1074 特徴を決定した方法：ｐ 配列の特徴：猫トロンボポエチンをコードするＤＮＡ 配列 ＣＣＡＣＴＣＣＡＡＣ ＣＡＧＡＣＡＧＣＧＴ ＧＧＣＣＡＧＡ ＡＴＧ ＧＡ
Ｇ ＣＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ５１ Ｍｅｔ Ｇｌ
ｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ −２
０ ＧＴＧ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＴＣ ＣＴＡ ＡＣＣ ＧＣＡ ＡＧＡ
ＣＴＧ ＡＡＴ ＣＴＡ ＴＧＣ ＣＴＴ ＣＣＡ ＧＣＴ ９９ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｌａ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ −１０
１ ＣＣＴ ＣＣＡ ＧＣＣ ＴＧＴ ＧＡＣ ＣＣＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＣＴＡ
ＡＡＴ ＡＡＡ ＣＴＧ ＣＴＴ ＣＧＴ ＧＡＴ ＴＣＣ １４７ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ １０ ＣＡＴ ＧＴＣ ＣＴＴ ＣＡＣ ＡＧＣ ＡＡＡ ＴＴＧ ＡＧＣ ＣＡＧ
ＴＧＣ ＣＣＡ ＧＡＣ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＣＴ ＴＴＧ １９５ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ ２０
３０ ＴＣＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＧＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＧＴＧ
ＧＡＣ ＴＴＴ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＡＡ ＴＧＧ ２４３ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｒｐ ４０
５０ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＡＡＧ ＧＣＡ
ＣＡＧ ＧＡＣ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ２９１ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ ６０ ＡＣＣ ＣＴＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＴＡ ＡＴＧ ＧＣＡ
ＧＣＡ ＣＧＧ ＧＧＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＣＴ ３３９ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ
Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ７０
８０ ＡＣＣ ＴＧＣ ＣＴＣ ＴＣＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＡＧ
ＣＴＴ ＴＣＴ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＣＴＣ ３８７ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｅｕ ９０ ＣＴＣ ＣＴＴ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＣＴＡ
ＧＧＡ ＡＣＣ ＣＡＧ ＣＴＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＣＡＧ ４３５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ １００
１１０ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＣＣ ＡＣＡ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＣＣＣ
ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＴＡ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＴＴＣ ４８３ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ １２０
１３０ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＣＴＣ ＣＧＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＧＴＧ ＣＧＣ
ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＴＡ ＧＴＡ ＧＧＧ ５３１ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ １４０ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＴＣ ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ
ＣＣＣ ＡＣＴ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＧＣ ＣＣＡ ＡＧＣ ５７９ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ １５０
１６０ ＡＡＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＧＴＡ ＧＴＣ ＣＴＣ ＡＣＡ ＣＴＡ ＣＡＣ
ＡＡＧ ＣＴＣ ＣＣＡ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＣＴ ＴＣＴ ６２７ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｓｅｒ １７０ ＧＧＡ ＴＴＴ ＴＴＧ ＧＡＧ ＡＣＡ ＧＡＣ ＴＣＣ ＣＧＴ ＧＴＣ
ＧＣＡ ＧＣＣ ＡＧＡ ＡＣＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ＴＴＴ ６７５ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ １８０
１９０ ＧＧＡ ＣＴＴ ＣＴＧ ＡＡＧ ＡＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＧＡ ＴＴＣ
ＡＧＡ ＧＣＣ ＡＡＧ ＡＴＴ ＣＣＴ ＧＧＴ ＣＧＧ ７２３ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ ２００
２１０ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＡＡ ＡＣＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＴＡＣ ＣＴＡ ＧＡＣ
ＣＡＡ ＡＴＣ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＡＣ ＧＴＧ ＡＡＣ ７７１ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｓｎ ２２０ ＡＧＧ ＡＣＡ ＣＡＣ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＣＴ
ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＣ ＴＴＴ ＣＣＴ ＧＧＡ ＣＣＣ ８１９ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｔｈｒ
Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ２３０
２４０ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＧＧ ＧＣＣ ＣＴＡ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＴＴ ＣＣＡ
ＧＧＡ ＡＣＴ ＴＣＡ ＧＡＣ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ８６７ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ２５０ ＣＴＧ ＣＣＡ ＣＣＣ ＧＡＣ ＣＴＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＴＡＴ
ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＣＣＡ ＡＣＣ ＣＡＴ ＣＣＴ ９１５ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｐｒｏ ２６０
２７０ ＣＣＴ ＡＣＴ ＧＧＧ ＣＡＡ ＴＡＣ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＣＴ
ＣＣＴ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＣＣ ＡＣＴ ９６３ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ２８０
２９０ ＣＣＣ ＣＣＧ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＣＣ ＣＴＧ ＣＴＴ
ＣＣＴ ＧＡＣ ＣＣＣ ＴＣＴ ＧＴＣ ＡＣＡ ＣＣＣ １０１１ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｐｒｏ ３００ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＣＣＴ ＣＴＴ ＣＴＡ ＡＴＴ ＧＣＡ
ＣＣＣ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＡＡＴ １０５９ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ａｓｎ ３１０
３２０ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＡＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＴＡＡＧＧＴＡＣＴＡ ＧＧＧＣＣ
ＣＴＧＣＣ ＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡ ＣＴＧＴＣＴＣＣＣＡ １１１４ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｕ ３２８ ＴＧＴＡＡＡＧＴＴＣ ＣＣＴＴＡＡＣＣＧＧ ＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣ ＣＴＧ
ＧＧＡＡＴＣＡ ＡＧＴＴＡＴＡＣＣＡ ＧＡＴＴＴＣＣＴＧＣ １１７４ ＴＴＴＣＡＣＣＴＧＡ ＡＡＣＣＣＡＡＡＧＣ ＣＣＴＧＣＴＡＡＡＧ ＣＧＧ
ＧＡＴＡＣＡＣ ＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡ ＡＧＧＧＧＡＴＣＡＴ １２３４ ＴＴＴＴＣＡＣＴＧＴ ＡＴＡＡＴＧＴＡＡＡ ＡＣＴＴＣＡＧＧＡＧ ＣＴＡ
ＴＴＴＴＴＴＴ ＡＡＧＣＴＡＴＣＡＡ ＴＡＡＴＡＴＴＣＡＣ １２９４ ＴＡＧＡＧＣＡＴＣＴ ＡＧＴＴＡＴＣＴＴ
１３１３

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト、マウスのトロンボポエチン遺伝子と猫ト
ロンボポエチン遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ
酸配列を相同部分が最大となるように並記した結果を示
した図。なおこの図中において、（・） は猫トロンボ
ポエチンの配列と比べて同じアミノ酸であることを示
し、(-) は該当するアミノ酸がないことを示す。

【図２】猫トロンボポエチンｍＲＮＡとそのコードする
タンパク質の性質、およびクローニングに用いたＰＣＲ
プライマーの位置を示した図。

【図３】猫トロンボポエチンｃＤＮＡを発現した細胞の
培養上清中に存在するトロンボポエチン活性を測定した
結果を示した図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 辻本 元 東京都杉並区成田東５−４−24 (72)発明者 長谷川 篤彦 東京都武蔵野市吉祥寺北町４−７−16 (72)発明者 山元 哲 東京都羽村市羽2446−１ ＴＫレシデンス 301号 (72)発明者 岩田 晃 東京都青梅市野上661−６ サンハイツ河 辺パート2401号

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を
   コードする遺伝子 （ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質 （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列における１もしくは数
   個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつ巨核球の増殖及び成熟分化を促進す
   る猫トロンボポエチンの活性を有するタンパク質。
2. 【請求項２】 以下の（ｃ）又は（ｄ）のアミノ酸配列
   を有し、かつ巨核球の増殖及び成熟分化を促進する猫ト
   ロンボポエチンの活性を有する組換えタンパク質 （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列 （ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列における１も
   しくは数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加された
   アミノ酸配列。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の遺伝子を含む組換え発
   現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組換え発現ベクターを
   含む形質転換体。
5. 【請求項５】 請求項２に記載の猫トロンボポエチンの
   活性を有するタンパク質を有効成分として含有する動物
   用医薬組成物。
6. 【請求項６】 請求項２に記載の猫トロンボポエチンの
   活性を有するタンパク質を有効成分として含有する猫の
   血小板減少症治療薬。
7. 【請求項７】 請求項４に記載の形質転換体を培養また
   は飼育し、産生された猫トロンボポエチンの活性を有す
   るタンパク質を採取することを特徴とする猫トロンボポ
   エチンの活性を有するタンパク質の製造方法。