JP2002218979A - シトクロムｃの生産方法 - Google Patents
シトクロムｃの生産方法Info
- Publication number
- JP2002218979A JP2002218979A JP2001014510A JP2001014510A JP2002218979A JP 2002218979 A JP2002218979 A JP 2002218979A JP 2001014510 A JP2001014510 A JP 2001014510A JP 2001014510 A JP2001014510 A JP 2001014510A JP 2002218979 A JP2002218979 A JP 2002218979A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cytochrome
- dna
- dna encoding
- sequence
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/80—Cytochromes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 真核生物のシトクロムｃを原核生物に生産さ
せる。 【解決手段】少なくともシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡと真核生物のシトクロムｃをコードするＤＮＡを
含むベクターで原核生物を形質転換し、形質転換された
原核生物を培養し、培養物からシトクロムｃを単離する
ことからなるシトクロムｃの生産方法。
せる。 【解決手段】少なくともシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡと真核生物のシトクロムｃをコードするＤＮＡを
含むベクターで原核生物を形質転換し、形質転換された
原核生物を培養し、培養物からシトクロムｃを単離する
ことからなるシトクロムｃの生産方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シトクロムｃの生
産方法に関する。
産方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シトクロムｃは、試薬または医薬品とし
て重要なタンパク質である。また、近年、ＮＯの生理機
能が着目されており、これを生体内で制御する医薬品の
開発が望まれているが、シトクロムｃはＮＯ捕獲能を有
するため、そのような医薬品の候補となり得る。さら
に、シトクロムｃのＮＯ捕獲能を汚染大気の浄化等の目
的に利用することも考えられる。
て重要なタンパク質である。また、近年、ＮＯの生理機
能が着目されており、これを生体内で制御する医薬品の
開発が望まれているが、シトクロムｃはＮＯ捕獲能を有
するため、そのような医薬品の候補となり得る。さら
に、シトクロムｃのＮＯ捕獲能を汚染大気の浄化等の目
的に利用することも考えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、シトク
ロムｃは工業的には主に動物心筋（主にウマ心筋）から
抽出して生産されているため、生産量が少なく、生産コ
ストも高い。遺伝子組換え法によるシトクロムｃの合成
法として、酵母を用いる方法が報告されているが、生産
効率が低いという問題がある。従って、シトクロムｃを
生産能力の高い原核生物、例えば大腸菌で合成すること
が望まれているが、現在のところシトクロムｃを大腸菌
で合成することに成功したとの報告はない。本発明の発
明者らは、これは、シトクロムｃの遺伝子組換え法によ
る合成において、成熟タンパク質のアミノ酸配列の多く
は知られているため、これから得られた配列を有するＤ
ＮＡを用いて形質転換することにより、タンパク質部分
は生産できるが、このタンパク質部分に、最後にヘムが
結合すると考えられ、ヘムのタンパク質への結合が適正
な位置に行われないためではないかと考えた。
ロムｃは工業的には主に動物心筋（主にウマ心筋）から
抽出して生産されているため、生産量が少なく、生産コ
ストも高い。遺伝子組換え法によるシトクロムｃの合成
法として、酵母を用いる方法が報告されているが、生産
効率が低いという問題がある。従って、シトクロムｃを
生産能力の高い原核生物、例えば大腸菌で合成すること
が望まれているが、現在のところシトクロムｃを大腸菌
で合成することに成功したとの報告はない。本発明の発
明者らは、これは、シトクロムｃの遺伝子組換え法によ
る合成において、成熟タンパク質のアミノ酸配列の多く
は知られているため、これから得られた配列を有するＤ
ＮＡを用いて形質転換することにより、タンパク質部分
は生産できるが、このタンパク質部分に、最後にヘムが
結合すると考えられ、ヘムのタンパク質への結合が適正
な位置に行われないためではないかと考えた。
【０００４】本発明の発明者らは、真核生物のシトクロ
ムｃを原核生物で生産させるべく、研究を重ねてきた。
その結果、原核生物の形質転換を、成熟タンパク質のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡだけでなく、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡを共に用いて行うことによ
り、ヘムをタンパク質の適正な位置に結合させ、シトク
ロムｃを生産させることに成功した。これは、ヘムをシ
トクロムｃのタンパク質部分に結合させるための酵素
が、大腸菌のペリプラズムに存在し、シグナルペプチド
がタンパク質の前駆体をペリプラズムに入れるのに寄与
するためではないかと考えられる。
ムｃを原核生物で生産させるべく、研究を重ねてきた。
その結果、原核生物の形質転換を、成熟タンパク質のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡだけでなく、シグナルペ
プチドをコードするＤＮＡを共に用いて行うことによ
り、ヘムをタンパク質の適正な位置に結合させ、シトク
ロムｃを生産させることに成功した。これは、ヘムをシ
トクロムｃのタンパク質部分に結合させるための酵素
が、大腸菌のペリプラズムに存在し、シグナルペプチド
がタンパク質の前駆体をペリプラズムに入れるのに寄与
するためではないかと考えられる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明において、本発明
者は、シグナルペプチドをコードする配列をＮ末端に付
加したシトクロムｃの成熟タンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡで原核生物を形質転換することによ
り、シトクロムｃを生産させることに成功した。また、
本発明者は、紅ソウ類のシトクロムｃ６が特に高いＮＯ
トラップ能を有することを見出した。
者は、シグナルペプチドをコードする配列をＮ末端に付
加したシトクロムｃの成熟タンパク質のアミノ酸配列を
コードするＤＮＡで原核生物を形質転換することによ
り、シトクロムｃを生産させることに成功した。また、
本発明者は、紅ソウ類のシトクロムｃ６が特に高いＮＯ
トラップ能を有することを見出した。
【０００６】本発明は下記のシトクロムｃの生産方法に
関する。 （１）少なくともシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
と真核生物のシトクロムｃをコードするＤＮＡを含むベ
クターで原核生物を形質転換し、形質転換された原核生
物を培養し、培養物からシトクロムｃを単離することか
らなるシトクロムｃの生産方法。 （２）上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡが、配
列番号１に示したアミノ配列または該アミノ配列の１〜
数個が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を
コードするＤＮＡである（１）の生産方法。 （３）上記真核生物が紅ソウ類の植物である（１）また
は（２）の生産方法。
関する。 （１）少なくともシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
と真核生物のシトクロムｃをコードするＤＮＡを含むベ
クターで原核生物を形質転換し、形質転換された原核生
物を培養し、培養物からシトクロムｃを単離することか
らなるシトクロムｃの生産方法。 （２）上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡが、配
列番号１に示したアミノ配列または該アミノ配列の１〜
数個が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列を
コードするＤＮＡである（１）の生産方法。 （３）上記真核生物が紅ソウ類の植物である（１）また
は（２）の生産方法。
【０００７】本発明は、上記生産方法に使用される、下
記のＤＮＡにも関する。 （４）配列表の配列番号１に示したアミノ配列または該
アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及び／又は付加され
たアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、真核生物
のシトクロムｃの成熟タンパク質をコードするＤＮＡと
共に原核生物を形質転換することにより、該原核生物に
よる真核生物シトクロムｃの生産を可能にするＤＮＡ。 （５）配列表の配列番号２のヌクレオチド番号７８〜１
５２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしくはこれに
相補的な配列を有するＤＮＡまたはこれらにストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、
真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡと共に原核生物を形質転換することにより、該原
核生物による真核生物シトクロムｃの生産を可能にする
ＤＮＡ。上記ＤＮＡは、シトクロムｃの生産方法におい
て、原核生物の形質転換のために使用することができ
る。また、該方法に使用するシグナルペプチドをコード
するオリゴヌクレオチドを得るためのプローブとして使
用することができる。また、本発明は、上記生産方法に
使用される、下記のベクターに関する。 （６）少なくともシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
と真核生物のシトクロムｃをコードするＤＮＡを含むベ
クター。 （７）前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡが
（４）または（５）のＤＮＡである（６）のベクター。 （８）前記真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質を
コードするＤＮＡが配列表の配列番号３のアミノ酸配列
または該アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及び／又は
付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡである
（６）または（７）のベクター。 （９）前記真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質を
コードするＤＮＡが配列表の配列番号２のヌクレオチド
番号１５３〜４０７のＤＮＡまたはこれに相補的な配列
を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズするＤＮＡである（６）または（７）のベクター。
上記のベクターは、本発明のシトクロムｃの生産方法に
おいて、原核生物の形質転換のために使用することがで
きる。
記のＤＮＡにも関する。 （４）配列表の配列番号１に示したアミノ配列または該
アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及び／又は付加され
たアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、真核生物
のシトクロムｃの成熟タンパク質をコードするＤＮＡと
共に原核生物を形質転換することにより、該原核生物に
よる真核生物シトクロムｃの生産を可能にするＤＮＡ。 （５）配列表の配列番号２のヌクレオチド番号７８〜１
５２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしくはこれに
相補的な配列を有するＤＮＡまたはこれらにストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、
真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡと共に原核生物を形質転換することにより、該原
核生物による真核生物シトクロムｃの生産を可能にする
ＤＮＡ。上記ＤＮＡは、シトクロムｃの生産方法におい
て、原核生物の形質転換のために使用することができ
る。また、該方法に使用するシグナルペプチドをコード
するオリゴヌクレオチドを得るためのプローブとして使
用することができる。また、本発明は、上記生産方法に
使用される、下記のベクターに関する。 （６）少なくともシグナルペプチドをコードするＤＮＡ
と真核生物のシトクロムｃをコードするＤＮＡを含むベ
クター。 （７）前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡが
（４）または（５）のＤＮＡである（６）のベクター。 （８）前記真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質を
コードするＤＮＡが配列表の配列番号３のアミノ酸配列
または該アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及び／又は
付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡである
（６）または（７）のベクター。 （９）前記真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質を
コードするＤＮＡが配列表の配列番号２のヌクレオチド
番号１５３〜４０７のＤＮＡまたはこれに相補的な配列
を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズするＤＮＡである（６）または（７）のベクター。
上記のベクターは、本発明のシトクロムｃの生産方法に
おいて、原核生物の形質転換のために使用することがで
きる。
【０００８】さらに、本発明は、（６）〜（９）のいず
れかのベクターで形質転換された原核生物の形質転換体
に関する。さらに、本発明は、上記本発明の生産方法に
より生産されるシトクロムｃに関する。
れかのベクターで形質転換された原核生物の形質転換体
に関する。さらに、本発明は、上記本発明の生産方法に
より生産されるシトクロムｃに関する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明は、少なくともシグナルペ
プチドをコードするＤＮＡと真核生物のシトクロムｃを
コードするＤＮＡを含むベクターで原核生物を形質転換
し、形質転換された原核生物を培養し、培養物からシト
クロムｃを単離することからなるシトクロムｃの生産方
法に関する。。
プチドをコードするＤＮＡと真核生物のシトクロムｃを
コードするＤＮＡを含むベクターで原核生物を形質転換
し、形質転換された原核生物を培養し、培養物からシト
クロムｃを単離することからなるシトクロムｃの生産方
法に関する。。
【００１０】本明細書において「シトクロムｃ」はシト
クロムｃ２、シトクロムｃ６等をも含む広義のシトクロ
ムｃを意味する。本発明において、「シグナルペプチ
ド」は、主に疎水性アミノ酸残基から構成された、膜輸
送に関わるペプチド、特に、細菌、例えば大腸菌のペリ
プラズムにタンパク質を入れることのできるシグナルペ
プチドである。例えば、シトクロムｃ、特にシトクロム
６の成熟タンパク質のＮ末端側に存在する約１５〜３０
アミノ酸残基のシグナルペプチドであり、より具体的に
は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドである。該ポリペプチドはその１〜数個
が置換、欠失及び付加されていてもよい。置換または付
加されるアミノ酸残基は疎水性であるのが好ましい。従
って、本発明において「シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ」は上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡで
あり、例えば配列表の配列番号２のヌクレオチド番号７
８〜１５２に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
を意味する。しかし、他の紅ソウ類、さらに他の藻類、
他の真核生物及び原核生物のシグナルペプチドをコード
するＤＮＡも同様に使用し得る可能性がある。該シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡは、各々のアミノ酸配列
の情報に基づいて合成することができる。そのようなＤ
ＮＡの合成は、市販のＤＮＡ合成機を用いて行うことが
できる。また、該シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
は、目的の生物、例えば藻類、特に紅ソウ類のゲノムＤ
ＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、核
酸プローブを用いて得ることができる。また、ＰＣＲ法
により得ることもできる。
クロムｃ２、シトクロムｃ６等をも含む広義のシトクロ
ムｃを意味する。本発明において、「シグナルペプチ
ド」は、主に疎水性アミノ酸残基から構成された、膜輸
送に関わるペプチド、特に、細菌、例えば大腸菌のペリ
プラズムにタンパク質を入れることのできるシグナルペ
プチドである。例えば、シトクロムｃ、特にシトクロム
６の成熟タンパク質のＮ末端側に存在する約１５〜３０
アミノ酸残基のシグナルペプチドであり、より具体的に
は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドである。該ポリペプチドはその１〜数個
が置換、欠失及び付加されていてもよい。置換または付
加されるアミノ酸残基は疎水性であるのが好ましい。従
って、本発明において「シグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ」は上記シグナルペプチドをコードするＤＮＡで
あり、例えば配列表の配列番号２のヌクレオチド番号７
８〜１５２に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ
を意味する。しかし、他の紅ソウ類、さらに他の藻類、
他の真核生物及び原核生物のシグナルペプチドをコード
するＤＮＡも同様に使用し得る可能性がある。該シグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡは、各々のアミノ酸配列
の情報に基づいて合成することができる。そのようなＤ
ＮＡの合成は、市販のＤＮＡ合成機を用いて行うことが
できる。また、該シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
は、目的の生物、例えば藻類、特に紅ソウ類のゲノムＤ
ＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから、核
酸プローブを用いて得ることができる。また、ＰＣＲ法
により得ることもできる。
【００１１】本発明において、「シトクロムｃの成熟タ
ンパク質」は、例えば紅ソウ類のシトクロムｃの成熟タ
ンパク質、より具体的には配列表の配列番号３に示すア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。従って、
本明細書において「シトクロムｃをコードするＤＮＡ」
または「シトクロムｃの成熟タンパク質をコードするＤ
ＮＡ」は上記シトクロムｃの成熟タンパク質をコードす
るＤＮＡ、例えば配列表の配列番号３に示すアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを意味する。しかし、他の紅ソウ
類、さらに他のソウ類、例えば緑ソウ類、ランソウ類
等、他の植物または動物、例えばマウス、ラット、ウ
シ、ウマ等の他の真核生物のシトクロムｃ、例えばシト
クロムｃ１、シトクロムｃ２、シトクロムｃ６、シトク
ロムｃ-551、の成熟タンパク質をコードするＤＮＡも同
様に使用し得る可能性がある。また、本発明は、上記で
列挙したシトクロムｃ、特にシトクロムｃ６、例えば紅
ソウ類のシトクロムｃ６の生産方法に関する。シトクロ
ムｃの成熟タンパク質をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡ
ライブラリーから、核酸プローブを用いて得ることがで
きる。また、ＰＣＲ法により得ることもできる。シグナ
ルペプチドまたはシトクロムｃの成熟タンパク質を得る
ための上記核酸プローブは、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
により得ることができる。該核酸プローブは、周知の方
法により放射性標識または非放射性標識で標識すること
ができる。該核酸プローブによるｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングは、例えばコロニーハイブリダイゼー
ションにより行うことができる。なお、シグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡと、シトクロムｃの成熟タンパク
質をコードするＤＮＡは同種の生物由来でも異種の生物
由来でもよい。同種の生物由来の場合は、シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡと成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡとが連結した状態でクローニングすることができ
る。異種の生物由来の場合は、各々のＤＮＡをベクター
に挿入して使用することができる。
ンパク質」は、例えば紅ソウ類のシトクロムｃの成熟タ
ンパク質、より具体的には配列表の配列番号３に示すア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。従って、
本明細書において「シトクロムｃをコードするＤＮＡ」
または「シトクロムｃの成熟タンパク質をコードするＤ
ＮＡ」は上記シトクロムｃの成熟タンパク質をコードす
るＤＮＡ、例えば配列表の配列番号３に示すアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを意味する。しかし、他の紅ソウ
類、さらに他のソウ類、例えば緑ソウ類、ランソウ類
等、他の植物または動物、例えばマウス、ラット、ウ
シ、ウマ等の他の真核生物のシトクロムｃ、例えばシト
クロムｃ１、シトクロムｃ２、シトクロムｃ６、シトク
ロムｃ-551、の成熟タンパク質をコードするＤＮＡも同
様に使用し得る可能性がある。また、本発明は、上記で
列挙したシトクロムｃ、特にシトクロムｃ６、例えば紅
ソウ類のシトクロムｃ６の生産方法に関する。シトクロ
ムｃの成熟タンパク質をコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡ
ライブラリーから、核酸プローブを用いて得ることがで
きる。また、ＰＣＲ法により得ることもできる。シグナ
ルペプチドまたはシトクロムｃの成熟タンパク質を得る
ための上記核酸プローブは、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ
により得ることができる。該核酸プローブは、周知の方
法により放射性標識または非放射性標識で標識すること
ができる。該核酸プローブによるｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングは、例えばコロニーハイブリダイゼー
ションにより行うことができる。なお、シグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡと、シトクロムｃの成熟タンパク
質をコードするＤＮＡは同種の生物由来でも異種の生物
由来でもよい。同種の生物由来の場合は、シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡと成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡとが連結した状態でクローニングすることができ
る。異種の生物由来の場合は、各々のＤＮＡをベクター
に挿入して使用することができる。
【００１２】本明細書において、「ストリンジェントな
条件」は、例えば、Sambrook等、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd. Vol.1, pp.1. 101-104, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, (1989) に記載さ
れている。本発明において、形質転換に用いるベクター
は、バイオテクノロジーの分野で慣用のプラスミド、フ
ァージ等であり得る。ベクターは上記シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ及びシトクロムｃの成熟タンパク質
をコードするＤＮＡに加えて、プロモーター配列、転写
終結シグナル等、遺伝子の発現に必要な配列を含んでい
るのが好ましい。また、該ベクターは適当な選択マーカ
ーを有しているのが望ましい。宿主細胞は、任意の原核
生物の細胞であるが、好ましくは細菌、特に大腸菌、で
ある。しかしながら、シトクロムｃの原核生物による生
産に適する限り、他の宿主を使用することもできる。形
質転換法は、周知の任意の方法、例えば、in vitroパッ
ケージング法であり得る。培養方法は、宿主細胞に適し
た方法を採用することができる。シトクロムｃの単離
は、例えば形質転換体の培養細胞を採取し、物理的に破
砕し、抽出し、精製することにより行うことができる。
培養細胞の採取は、固体培地の場合は培養細胞をかきと
ることにより、また液体培地の場合には遠心分離により
行うことができる。破砕物からのＤＮＡの抽出は、例え
ば適当な有機溶媒による抽出等の方法により行うことが
できる。抽出したＤＮＡの精製は、例えば各種クロマト
グラフィー、結晶化等により行うことができる。本発明
は、上記方法に用いるＤＮＡ、ベクター及び形質転換
体、並びに上記方法により生産されるシトクロムｃ、例
えば、シトクロムｃ１、シトクロムｃ２、シトクロムｃ
６、シトクロムｃ-551、好ましくはシトクロムｃ６、特
に紅ソウ類のシトクロムｃ６に関する。
条件」は、例えば、Sambrook等、Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd. Vol.1, pp.1. 101-104, Col
d Spring Harbor Laboratory Press, (1989) に記載さ
れている。本発明において、形質転換に用いるベクター
は、バイオテクノロジーの分野で慣用のプラスミド、フ
ァージ等であり得る。ベクターは上記シグナルペプチド
をコードするＤＮＡ及びシトクロムｃの成熟タンパク質
をコードするＤＮＡに加えて、プロモーター配列、転写
終結シグナル等、遺伝子の発現に必要な配列を含んでい
るのが好ましい。また、該ベクターは適当な選択マーカ
ーを有しているのが望ましい。宿主細胞は、任意の原核
生物の細胞であるが、好ましくは細菌、特に大腸菌、で
ある。しかしながら、シトクロムｃの原核生物による生
産に適する限り、他の宿主を使用することもできる。形
質転換法は、周知の任意の方法、例えば、in vitroパッ
ケージング法であり得る。培養方法は、宿主細胞に適し
た方法を採用することができる。シトクロムｃの単離
は、例えば形質転換体の培養細胞を採取し、物理的に破
砕し、抽出し、精製することにより行うことができる。
培養細胞の採取は、固体培地の場合は培養細胞をかきと
ることにより、また液体培地の場合には遠心分離により
行うことができる。破砕物からのＤＮＡの抽出は、例え
ば適当な有機溶媒による抽出等の方法により行うことが
できる。抽出したＤＮＡの精製は、例えば各種クロマト
グラフィー、結晶化等により行うことができる。本発明
は、上記方法に用いるＤＮＡ、ベクター及び形質転換
体、並びに上記方法により生産されるシトクロムｃ、例
えば、シトクロムｃ１、シトクロムｃ２、シトクロムｃ
６、シトクロムｃ-551、好ましくはシトクロムｃ６、特
に紅ソウ類のシトクロムｃ６に関する。
【００１３】
【実施例】実施例１：スサビノリ一本鎖ｃＤＮＡの作製 紅ソウ類スサビノリ（Porphyra yezoensis）２．５ｇか
らグアニジンチオシアネート法により全ＲＮＡを抽出
し、ショ糖密度勾配遠心（５〜３０％）を行うことによ
りｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡ２μｇをとり、PolyA
ポリメラーゼ（宝酒造社製）によりPolyAの付加を行っ
た。このPolyA付加ｍＲＮＡを鋳型として用いて、下記
の配列を有するプライマー（１）と、市販のキット
（５’−ＲＡＣＥシステム，ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を
用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。 プライマー（１）：5'-gcggatccttttttttttttttttttttt
tttt-3'（配列番号：４）
らグアニジンチオシアネート法により全ＲＮＡを抽出
し、ショ糖密度勾配遠心（５〜３０％）を行うことによ
りｍＲＮＡを得た。このｍＲＮＡ２μｇをとり、PolyA
ポリメラーゼ（宝酒造社製）によりPolyAの付加を行っ
た。このPolyA付加ｍＲＮＡを鋳型として用いて、下記
の配列を有するプライマー（１）と、市販のキット
（５’−ＲＡＣＥシステム，ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を
用いて、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。 プライマー（１）：5'-gcggatccttttttttttttttttttttt
tttt-3'（配列番号：４）
【００１４】実施例２：スサビノリのシトクロムｃ６の
ｃＤＮＡの一部の単離 スサビノリのシトクロムｃ６の成熟タンパク質のアミノ
酸配列（PIRnumber:JC5849)を基にして設計した下記の
混合プライマー（２）、（３）を用いてＰＣＲを行っ
た。 プライマー（２）5'-ga(tc)aa(tc)ggnga(ag)aa(ag)gg-
3'（配列番号：５） プライマー（３）5'-atngc(ag)tcnatnat(gat)gt(ag)ttc
at-3'（配列番号：６）(nはイノシンを表す。） ＰＣＲは、９４℃で４８秒、５０℃で４８秒及び７２℃
で１分２４秒のサイクルを３２回繰り返すことにより行
った。ＰＣＲ装置としては、PCR Thermal Cycler TP200
0（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ酵素としては、TaK
aRa Ex Taq（宝酒造社製）を使用した。得られたＤＮＡ
断片を市販のキット(Original TA cloning kit, Invitr
ogen社製）を用いてクローニングし、ジデオキシ法を利
用したDSQ1000DNAシーケンサー（（株）島津製作所製）
により、その配列を決定した。決定された配列は、配列
表の配列番号７の配列である。
ｃＤＮＡの一部の単離 スサビノリのシトクロムｃ６の成熟タンパク質のアミノ
酸配列（PIRnumber:JC5849)を基にして設計した下記の
混合プライマー（２）、（３）を用いてＰＣＲを行っ
た。 プライマー（２）5'-ga(tc)aa(tc)ggnga(ag)aa(ag)gg-
3'（配列番号：５） プライマー（３）5'-atngc(ag)tcnatnat(gat)gt(ag)ttc
at-3'（配列番号：６）(nはイノシンを表す。） ＰＣＲは、９４℃で４８秒、５０℃で４８秒及び７２℃
で１分２４秒のサイクルを３２回繰り返すことにより行
った。ＰＣＲ装置としては、PCR Thermal Cycler TP200
0（宝酒造社製）を使用した。ＰＣＲ酵素としては、TaK
aRa Ex Taq（宝酒造社製）を使用した。得られたＤＮＡ
断片を市販のキット(Original TA cloning kit, Invitr
ogen社製）を用いてクローニングし、ジデオキシ法を利
用したDSQ1000DNAシーケンサー（（株）島津製作所製）
により、その配列を決定した。決定された配列は、配列
表の配列番号７の配列である。
【００１５】実施例３：スサビノリのシトクロムｃ６の
ｃＤＮＡの５’上流域の配列の決定 スサビノリのシトクロムｃ６のｃＤＮＡの５’上流域の
配列を決定するため、５’ＲＡＣＥ(Rapid amplificati
on of cDNA ends)を、市販のキット(5'-RACE system, G
ibco BRL社製）を用いて下記のように行った。下記のプ
ライマー（４）を用いて、ＰＣＲを、９４℃で４８秒、
５６℃で４８秒及び７２℃で１分２４秒のサイクルを３
２回繰り返すことにより行った。ＰＣＲ装置としては、
PCR Thermal Cycler TP2000（宝酒造社製）を使用し
た。 プライマー（４）：5'-catactattagcttcaagtacatc-3'
（配列番号：８） なお、プライマー（４）は実施例２で得られた配列に基
づいて設計した。得られたＰＣＲ産物は３１３ｂｐの大
きさであった。その配列は、配列表の配列番号９に示し
た。
ｃＤＮＡの５’上流域の配列の決定 スサビノリのシトクロムｃ６のｃＤＮＡの５’上流域の
配列を決定するため、５’ＲＡＣＥ(Rapid amplificati
on of cDNA ends)を、市販のキット(5'-RACE system, G
ibco BRL社製）を用いて下記のように行った。下記のプ
ライマー（４）を用いて、ＰＣＲを、９４℃で４８秒、
５６℃で４８秒及び７２℃で１分２４秒のサイクルを３
２回繰り返すことにより行った。ＰＣＲ装置としては、
PCR Thermal Cycler TP2000（宝酒造社製）を使用し
た。 プライマー（４）：5'-catactattagcttcaagtacatc-3'
（配列番号：８） なお、プライマー（４）は実施例２で得られた配列に基
づいて設計した。得られたＰＣＲ産物は３１３ｂｐの大
きさであった。その配列は、配列表の配列番号９に示し
た。
【００１６】実施例４：スサビノリのシトクロムｃ６の
ｃＤＮＡの３’下流域の配列の決定 スサビノリのシトクロムｃ６のｃＤＮＡの3’下流域の
配列を決定するため、３’ＲＡＣＥ(Rapid amplificati
on of cDNA ends)を、市販のキット(3'-RACE system, G
ibco BRL社製）を用いて下記のように行った。下記のプ
ライマー（５）を用いて、ＰＣＲを、９４℃で４８秒、
５２℃で４８秒及び７２℃で１分２４秒のサイクルを３
２回繰り返すことにより行った。ＰＣＲ装置としては、
PCR Thermal Cycler TP2000（宝酒造社製）を使用し
た。 プライマー（５）：5'-agtttgttgacagcaagttac-3'（配
列番号：１０） なお、プライマー（５）は実施例３で得られた配列に基
づいて設計した。得られたＰＣＲ産物は５１６ｂｐの大
きさであった。その配列は、配列表の配列番号２に示し
た。この配列は、同じ紅ソウ類のPorphyra purpureaのp
etJ遺伝子(U38804)と高い相同性（８６％）を示す。こ
の配列中、ヌクレオチド番号７８〜１５２がシグナルペ
プチドをコードし、１５３〜４０７が成熟タンパク質を
コードする配列であると予測される。
ｃＤＮＡの３’下流域の配列の決定 スサビノリのシトクロムｃ６のｃＤＮＡの3’下流域の
配列を決定するため、３’ＲＡＣＥ(Rapid amplificati
on of cDNA ends)を、市販のキット(3'-RACE system, G
ibco BRL社製）を用いて下記のように行った。下記のプ
ライマー（５）を用いて、ＰＣＲを、９４℃で４８秒、
５２℃で４８秒及び７２℃で１分２４秒のサイクルを３
２回繰り返すことにより行った。ＰＣＲ装置としては、
PCR Thermal Cycler TP2000（宝酒造社製）を使用し
た。 プライマー（５）：5'-agtttgttgacagcaagttac-3'（配
列番号：１０） なお、プライマー（５）は実施例３で得られた配列に基
づいて設計した。得られたＰＣＲ産物は５１６ｂｐの大
きさであった。その配列は、配列表の配列番号２に示し
た。この配列は、同じ紅ソウ類のPorphyra purpureaのp
etJ遺伝子(U38804)と高い相同性（８６％）を示す。こ
の配列中、ヌクレオチド番号７８〜１５２がシグナルペ
プチドをコードし、１５３〜４０７が成熟タンパク質を
コードする配列であると予測される。
【００１７】実施例５：スサビノリのシトクロムｃ６の
大腸菌発現ベクターの構築 １）実施例４で決定された配列を基礎として、リボゾー
ム結合部位と開始コドンを含むセンスプライマー（６）
と終止コドンを含むアンチセンスプライマー（７）を設
計し、ＰＣＲによりシトクロムｃ６の翻訳領域の増幅を
行った。ＰＣＲは、９４℃で４８秒、６２℃で４８秒及
び７２℃で１分２４秒のサイクルを３２回繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ装置としては、PCR Thermal Cycl
er TP2000（宝酒造社製）を使用した。 センスプライマー（６）：5'-ccgcggagacgttaaattgaaga
agaagc-3'（配列番号：１１） アンチセンスプライマー（７）：5'-gcggatccttaccaacc
tttttcagattgag-3'（配列番号：１２） 得られたＰＣＲ産物は３５７ｂｐの大きさであった。得
られたＤＮＡ断片をSacII及びBamHIで消化した後、pBlu
escriptIISK(+)(Stratagene社製）を用いてクローニン
グし、配列を決定した。
大腸菌発現ベクターの構築 １）実施例４で決定された配列を基礎として、リボゾー
ム結合部位と開始コドンを含むセンスプライマー（６）
と終止コドンを含むアンチセンスプライマー（７）を設
計し、ＰＣＲによりシトクロムｃ６の翻訳領域の増幅を
行った。ＰＣＲは、９４℃で４８秒、６２℃で４８秒及
び７２℃で１分２４秒のサイクルを３２回繰り返すこと
により行った。ＰＣＲ装置としては、PCR Thermal Cycl
er TP2000（宝酒造社製）を使用した。 センスプライマー（６）：5'-ccgcggagacgttaaattgaaga
agaagc-3'（配列番号：１１） アンチセンスプライマー（７）：5'-gcggatccttaccaacc
tttttcagattgag-3'（配列番号：１２） 得られたＰＣＲ産物は３５７ｂｐの大きさであった。得
られたＤＮＡ断片をSacII及びBamHIで消化した後、pBlu
escriptIISK(+)(Stratagene社製）を用いてクローニン
グし、配列を決定した。
【００１８】実施例６：スサビノリのシトクロムｃ６の
大腸菌での発現 実施例５で構築した発現ベクターで大腸菌DH5αを形質
転換し、シングルコロニーをＬＢアンピシリン培地に接
種した。これを、３７℃で１２時間浸透しつつ(200rpm)
培養した。得られた培養物１０リットルを6000rpmで１
０分間の遠心分離にかけ、菌体を回収し、超音波破砕に
より菌体の破砕を行った。菌体破砕液を10000rpmで15分
間の遠心分離にかけ、得られた上清に６０〜１００％硫
安分画を行った。イオン交換クロマトグラフィー(DE52,
Whatman社製）、１０mM酢酸バッファー(pH5.0)、0-0.5M
NaClのリニアグラジェントによりタンパク質の分画を
行った。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィ(Sephacryl
S-200, Amersham Pharmacia社製）によりタンパク質の
分画を行い、電気泳動的に単一なリコンビナントシトク
ロムｃ６を得た。上記培養物１０リットルから約２ｍｇ
のリコンビナントシトクロムｃ６が得られた。リコンビ
ナントシトクロムｃ６はスサビノリ由来のものと同様の
ＮＯトラップ能を有していた。
大腸菌での発現 実施例５で構築した発現ベクターで大腸菌DH5αを形質
転換し、シングルコロニーをＬＢアンピシリン培地に接
種した。これを、３７℃で１２時間浸透しつつ(200rpm)
培養した。得られた培養物１０リットルを6000rpmで１
０分間の遠心分離にかけ、菌体を回収し、超音波破砕に
より菌体の破砕を行った。菌体破砕液を10000rpmで15分
間の遠心分離にかけ、得られた上清に６０〜１００％硫
安分画を行った。イオン交換クロマトグラフィー(DE52,
Whatman社製）、１０mM酢酸バッファー(pH5.0)、0-0.5M
NaClのリニアグラジェントによりタンパク質の分画を
行った。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィ(Sephacryl
S-200, Amersham Pharmacia社製）によりタンパク質の
分画を行い、電気泳動的に単一なリコンビナントシトク
ロムｃ６を得た。上記培養物１０リットルから約２ｍｇ
のリコンビナントシトクロムｃ６が得られた。リコンビ
ナントシトクロムｃ６はスサビノリ由来のものと同様の
ＮＯトラップ能を有していた。
【００１９】試験例１：シトクロムｃのＮＯトラップ能
の測定 サンプルとして、Porphyra yezoensis(紅ソウ類)、Chlo
rella vulgals CK-5(緑ソウ類)、Chlorella vulgals CK
-22(緑ソウ類)及びSpirulina platensis（ランソウ類）
のシトクロムｃ６、及びウマ心筋及びウシ心筋のシトク
ロムｃ（いずれもシグマ社製）を各々溶解した２０μＭ
シトクロム溶液を調製した。１０ｍｌのバイアルに、
０．４ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）、０．４ｍｌの１０ｍＭ亜硝酸ナトリウム、
０．４ｍｌの上記各シトクロム溶液、０．５ｍｌの３ｍ
Ｍメチルビオロゲンを入れ、ブチルゴム栓とアルミシー
ルで密封した。アルゴンを通気しながら３７℃で５分間
プレインキュベートした後、０．３ｍｌの１００ｍＭ亜
ジチオン酸ナトリウム（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムに
溶解したもの）を添加することにより、反応を開始し
た。３７℃でインキュベートし、一定の時間間隔で反応
液を０．２ｍｌずつ分取し、ボルテックスで空気酸化さ
せることにより反応を停止した。残存亜硝酸量をジアゾ
化法により測定した。反応液を０．０２ｍｌとり、超純
水を１．９８ｍｌ添加した後、１ｍｌの１％スルファニ
ルアミド、１ｍｌの０．０２％のN-1-ナフチルエチレン
ジアミン、１ｍｌの超純水を添加し、２０分間放置した
後、生成アゾ色素の５４０ｎｍにおける吸光度を測定
し、既知濃度の亜硝酸溶液から作製した検量線より、残
存亜硝酸量を算出した。測定は、SHIMADZU UV-1600 UV-
VISIBLE SPECTROPHOTOMETERを用いて行った。この反応
原理は、以下による。亜ジチオン酸ナトリウムによって
亜硝酸をＮＯに還元させ（１）、生じたＮＯをシトクロ
ムｃ６により捕捉させる（２）。次にシトクロムｃ６−
ＮＯ複合体は、メチルビオロゲンによってアンモニアま
で還元される（３）（下記式参照）。
の測定 サンプルとして、Porphyra yezoensis(紅ソウ類)、Chlo
rella vulgals CK-5(緑ソウ類)、Chlorella vulgals CK
-22(緑ソウ類)及びSpirulina platensis（ランソウ類）
のシトクロムｃ６、及びウマ心筋及びウシ心筋のシトク
ロムｃ（いずれもシグマ社製）を各々溶解した２０μＭ
シトクロム溶液を調製した。１０ｍｌのバイアルに、
０．４ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）、０．４ｍｌの１０ｍＭ亜硝酸ナトリウム、
０．４ｍｌの上記各シトクロム溶液、０．５ｍｌの３ｍ
Ｍメチルビオロゲンを入れ、ブチルゴム栓とアルミシー
ルで密封した。アルゴンを通気しながら３７℃で５分間
プレインキュベートした後、０．３ｍｌの１００ｍＭ亜
ジチオン酸ナトリウム（５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムに
溶解したもの）を添加することにより、反応を開始し
た。３７℃でインキュベートし、一定の時間間隔で反応
液を０．２ｍｌずつ分取し、ボルテックスで空気酸化さ
せることにより反応を停止した。残存亜硝酸量をジアゾ
化法により測定した。反応液を０．０２ｍｌとり、超純
水を１．９８ｍｌ添加した後、１ｍｌの１％スルファニ
ルアミド、１ｍｌの０．０２％のN-1-ナフチルエチレン
ジアミン、１ｍｌの超純水を添加し、２０分間放置した
後、生成アゾ色素の５４０ｎｍにおける吸光度を測定
し、既知濃度の亜硝酸溶液から作製した検量線より、残
存亜硝酸量を算出した。測定は、SHIMADZU UV-1600 UV-
VISIBLE SPECTROPHOTOMETERを用いて行った。この反応
原理は、以下による。亜ジチオン酸ナトリウムによって
亜硝酸をＮＯに還元させ（１）、生じたＮＯをシトクロ
ムｃ６により捕捉させる（２）。次にシトクロムｃ６−
ＮＯ複合体は、メチルビオロゲンによってアンモニアま
で還元される（３）（下記式参照）。
【式１】 従って、残存亜硝酸量を測定することにより亜硝酸還元
能、即ちＮＯトラップ能を算出することができる。この
結果に基づき、ＮＯ２ −に対する酵素の反応サイクルの
最大回転数（kｃ ａｔ(sec−１))を計算した。結果を表
１に示す。
能、即ちＮＯトラップ能を算出することができる。この
結果に基づき、ＮＯ２ −に対する酵素の反応サイクルの
最大回転数（kｃ ａｔ(sec−１))を計算した。結果を表
１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】表１より、紅ソウ類のシトクロムｃ６が特
に高いＮＯ捕捉能を有することが明らかである。
に高いＮＯ捕捉能を有することが明らかである。
【００２２】
【発明の効果】本発明の方法により、真核生物のシトク
ロムｃを原核生物により生産することが可能になる。こ
れにより、大量のシトクロムｃを効率良く生産すること
が可能になる。また、本発明により、高いＮＯ捕捉能を
有するシトクロムｃ６が提供される。 配列表フリーテキスト 配列番号５：ｎはイノシンを表す。 配列番号６：ｎはイノシンを表す。
ロムｃを原核生物により生産することが可能になる。こ
れにより、大量のシトクロムｃを効率良く生産すること
が可能になる。また、本発明により、高いＮＯ捕捉能を
有するシトクロムｃ６が提供される。 配列表フリーテキスト 配列番号５：ｎはイノシンを表す。 配列番号６：ｎはイノシンを表す。
【００２３】
【配列表】 SEQUENCE LISTING 〈110〉 NIHON UNIVERSITY 〈120〉 Method for producing cytochrome c 〈130〉 PANU004 〈160〉 12 〈210〉 1 〈211〉 25 〈212〉 PRT 〈213〉 Porphyra yezoensis 〈400〉 1 Met Lys Lys Lys Leu Ser Val Leu Phe Thr Val Phe Ser Phe Phe Val 1 5 10 15 Ile Gly Phe Ala Gln Ile Ala Phe Ala 20 25 〈210〉 2 〈211〉 516 〈212〉 DNA 〈213〉 Porphyra yezoensis 〈220〉 〈221〉 CDS 〈222〉 (78)..(410) 〈400〉 2 agtttgttga cagcaagtta ctttttaccc gaacttgttt acactattcg tctagttatt 60 aaaaaggaga cgttaaa ttg aag aag aag ctt tca gtt ctt ttc act gtt 110 Met Lys Lys Lys Leu Ser Val Leu Phe Thr Val 1 5 10 ttt agt ttt ttt gta ata ggt ttc gca caa att gct ttt gct gca gat 158 Phe Ser Phe Phe Val Ile Gly Phe Ala Gln Ile Ala Phe Ala Ala Asp 15 20 25 cta gat aat gga gaa aaa gtt ttt tct gct aat tgt gca gca tgt cat 206 Leu Asp Asn Gly Glu Lys Val Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala Cys His 30 35 40 gct ggc ggt aat aac gcc att atg cca gat aaa acc tta aaa aaa gat 254 Ala Gly Gly Asn Asn Ala Ile Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp 45 50 55 gta ctt gaa gct aat agt atg aat act att gat gct att act tat caa 302 Val Leu Glu Ala Asn Ser Met Asn Thr Ile Asp Ala Ile Thr Tyr Gln 60 65 70 75 gta caa aat ggt aaa aat gcc atg cct gct ttc gga ggt aga ctg gtt 350 Val Gln Asn Gly Lys Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg Leu Val 80 85 90 gat gaa gat att gaa gat gca gca aat tat gta tta tct caa tct gaa 398 Asp Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ala Asn Tyr Val Leu Ser Gln Ser Glu 95 100 105 aaa ggt tgg taa ttatacttga ttttatcctg tattaaagaa tagacaatct 450 Lys Gly Trp 110 atttagttgt tcattagatt gtctattctt tgtaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaagg 510 atccgc 516 〈210〉 3 〈211〉 85 〈212〉 PRT 〈213〉 Porphyra yezoensis 〈400〉 3 Ala Asp Leu Asp Asn Gly Glu Lys Val Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala 1 5 10 15 Cys His Ala Gly Gly Asn Asn Ala Ile Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys 20 25 30 Lys Asp Val Leu Glu Ala Asn Ser Met Asn Thr Ile Asp Ala Ile Thr 35 40 45 Tyr Gln Val Gln Asn Gly Lys Asn Ala Met Pro Ala Phe Gly Gly Arg 50 55 60 Leu Val Asp Glu Asp Ile Glu Asp Ala Ala Asn Tyr Val Leu Ser Gln 65 70 75 80 Ser Glu Lys Gly Trp 85 〈210〉 4 〈211〉 33 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 4 gcggatcctt tttttttttt tttttttttt ttt 33 〈210〉 5 〈211〉 17 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 5 gayaayggng araargg 17 〈210〉 6 〈211〉 23 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 6 atngcrtcna tnatdgtrtt cat 23 〈210〉 7 〈211〉 131 〈212〉 DNA 〈213〉 Porphyra yezoensis 〈400〉 7 gac aac ggg gag aag gtg ttt tct gct aat tgt gca gca tgt cat gct 48 Asp Asn Gly Glu Lys Val Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala Cys His Ala 5 10 15 ggc ggt aat aac gcc att atg cca gat aaa acc tta aaa aaa gat gta 96 Gly Gly Asn Asn Ala Ile Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp Val 20 25 30 ctt gaa gct aat agt atg aac acc atc gac gcc at 131 Leu Glu Ala Asn Ser Met Asn Thr Ile Asp Ala 35 40 〈210〉 8 〈211〉 24 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 8 catactatta gcttcaagta catc 24 〈210〉 9 〈211〉 275 〈212〉 DNA 〈213〉Porphyra yezoensis 〈400〉 9 agtttgttga cagcaagtta ctttttaccc gaacttgttt acactattcg tctagttatt 60 aaaaaggaga cgttaaa ttg aag aag aag ctt tca gtt ctt ttc act gtt 110 Met Lys Lys Lys Leu Ser Val Leu Phe Thr Val 1 5 10 ttt agt ttt ttt gta ata ggt ttc gca caa att gct ttt gct gca gat 158 Phe Ser Phe Phe Val Ile Gly Phe Ala Gln Ile Ala Phe Ala Ala Asp 15 20 25 cta gat aat gga gaa aaa gtt ttt tct gct aat tgt gca gca tgt cat 206 Leu Asp Asn Gly Glu Lys Val Phe Ser Ala Asn Cys Ala Ala Cys His 30 35 40 gct ggc ggt aat aac gcc att atg cca gat aaa acc tta aaa aaa gat 254 Ala Gly Gly Asn Asn Ala Ile Met Pro Asp Lys Thr Leu Lys Lys Asp 45 50 55 gta ctt gaa gct aat agt atg 275 Val Leu Glu Ala Asn Ser Met 60 65 〈210〉 10 〈211〉 21 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 10 agtttgttga cagcaagtta c 21 〈210〉 11 〈211〉 29 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 11 ccgcggagac gttaaattga agaagaagc 29 〈210〉 12 〈211〉 31 〈212〉 DNA 〈213〉 Artificail sequence 〈400〉 12 gcggatcctt accaaccttt ttcagattga g 31
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA11 AA17 BA80 CA04 CA20 DA06 EA04 FA18 GA11 HA03 4B064 AG35 CA02 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 DA16 4B065 AA26X AA88Y AB01 AC14 AC16 BA02 BB01 BC03 BC26 BD01 BD14 BD15 CA44 CA46 CA54
Claims (10)
- 【請求項１】 少なくともシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡと真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質を
コードするＤＮＡを含むベクターで原核生物を形質転換
し、形質転換された原核生物を培養し、培養物からシト
クロムｃを単離することからなるシトクロムｃの生産方
法。 - 【請求項２】 上記シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａが、配列表の配列番号１に示したアミノ配列または該
アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及び／又は付加され
たアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項１記載
の生産方法。 - 【請求項３】 上記真核生物が紅ソウ類の植物である請
求項１または２記載の生産方法。 - 【請求項４】 配列表の配列番号１に示したアミノ配列
または該アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及び／又は
付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって、
真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡと共に原核生物を形質転換することにより、該原
核生物による真核生物シトクロムｃの生産を可能にする
ＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号２のヌクレオチド番号
７８〜１５２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡもしく
はこれに相補的な配列を有するＤＮＡまたはこれらにス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡで
あって、真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質をコ
ードするＤＮＡと共に原核生物を形質転換することによ
り、該原核生物による真核生物シトクロムｃの生産を可
能にするＤＮＡ。 - 【請求項６】 少なくともシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡと真核生物のシトクロムｃの成熟タンパク質を
コードするＤＮＡを含むベクター。 - 【請求項７】 前記シグナルペプチドをコードするＤＮ
Ａが請求項４または５のＤＮＡである請求項６記載のベ
クター。 - 【請求項８】 前記真核生物のシトクロムｃの成熟タン
パク質をコードするＤＮＡが配列表の配列番号３のアミ
ノ酸配列または該アミノ配列の１〜数個が置換、欠失及
び／又は付加されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡで
ある請求項６または７記載のベクター。 - 【請求項９】 前記真核生物のシトクロムｃの成熟タン
パク質をコードするＤＮＡが配列表の配列番号２のヌク
レオチド番号１５３〜４０７のＤＮＡまたはこれに相補
的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハ
イブリダイズするＤＮＡである請求項６または７記載の
ベクター。 - 【請求項１０】 請求項６〜９のいずれかのベクターで
形質転換された原核生物の形質転換体。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001014510A JP2002218979A (ja) | 2001-01-23 | 2001-01-23 | シトクロムｃの生産方法 |
| PCT/JP2002/000467 WO2002059339A1 (fr) | 2001-01-23 | 2002-01-23 | Procede permettant la production de cytochrome c |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001014510A JP2002218979A (ja) | 2001-01-23 | 2001-01-23 | シトクロムｃの生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002218979A true JP2002218979A (ja) | 2002-08-06 |
Family
ID=18881196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001014510A Pending JP2002218979A (ja) | 2001-01-23 | 2001-01-23 | シトクロムｃの生産方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002218979A (ja) |
| WO (1) | WO2002059339A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1854879A1 (en) * | 2005-02-02 | 2007-11-14 | Nihon University | Method of constructing novel higher plant and mehtod of promoting the growth of higher plant |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2315039B1 (es) * | 2004-11-05 | 2009-12-30 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas | Construccion genica que codifica para el citocromo c y procedimiento de obtencion. |
| CN111411090A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-14 | 珀莱雅化妆品股份有限公司 | 一种耐高温超氧化物歧化酶的制备方法及其应用 |
-
2001
- 2001-01-23 JP JP2001014510A patent/JP2002218979A/ja active Pending
-
2002
- 2002-01-23 WO PCT/JP2002/000467 patent/WO2002059339A1/ja active Application Filing
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1854879A1 (en) * | 2005-02-02 | 2007-11-14 | Nihon University | Method of constructing novel higher plant and mehtod of promoting the growth of higher plant |
| EP1854879A4 (en) * | 2005-02-02 | 2008-05-07 | Univ Nihon | METHOD FOR CONSTRUCTING A NEW HIGHER PLANT AND PROCESS FOR PROMOTING THE GROWTH OF THE HIGHER PLANT |
| US8071842B2 (en) | 2005-02-02 | 2011-12-06 | Nihon University | Method of constructing novel higher plant and method of promoting the growth of higher plant |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002059339A1 (fr) | 2002-08-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6169174B1 (en) | Cotton plant gene | |
| CA2302644A1 (en) | Extended cdnas for secreted proteins | |
| EP0960201A1 (en) | Mammalian ribonuclease inhibitors and use thereof | |
| JP4158956B2 (ja) | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 | |
| JP2002218979A (ja) | シトクロムｃの生産方法 | |
| JP2001029082A (ja) | カンナビジオール酸シンターゼをコードするｄｎａ | |
| CN110819645B (zh) | 锦鲤Gtpch2基因、编码蛋白及其应用 | |
| EP0780472A2 (en) | Stress proteins | |
| JP3891323B2 (ja) | ルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質をコードする遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びルシフェリンを再生する能力を有するタンパク質の製造法 | |
| JPH09224672A (ja) | 新規なｄｎａ結合タンパク質をコードするｄｎａ | |
| JP2002034566A (ja) | ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体 | |
| Gaur et al. | Identification and expression of a homologue of the murine HoxA5 gene in the Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum) | |
| JP3624391B2 (ja) | イヌインターロイキン１２およびその製造法 | |
| CN114317547A (zh) | 一种花尾胡椒鲷抗菌肽Hepcidin基因及其编码的抗菌肽 | |
| Torigoe et al. | Localization of 67 exons on a YAC contig spanning 1.5 Mb around the multidrug resistance gene region of human chromosome 7q21. 1 | |
| JP2003259871A (ja) | 脳特異的発現を示す分泌タンパク質ｃｒｅｇ２とその利用 | |
| JPH1156368A (ja) | 猫トロンボポエチンの活性を有する因子 | |
| CN115261363A (zh) | Apobec3a的rna脱氨酶活性测定方法及rna高活性的apobec3a变体 | |
| JP2000516451A (ja) | 組換えキヌレニン―３―ヒドロキシラーゼ酵素およびその調製方法 | |
| EP0857732A1 (en) | Human pec-60-like protein and dna encoding the same | |
| JP2001103976A (ja) | カドミウム耐性遺伝子 | |
| CN104911190A (zh) | 一个与小麦垂直抗叶锈相关的TaPDRABCG基因 | |
| JPH09163987A (ja) | カボチャ由来キチナーゼをコードするｄｎａ | |
| CN116003542A (zh) | 生产柠檬酸的微生物及其构建方法和应用 | |
| JPH09275986A (ja) | 新規なプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041116 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050330 |