JP2001103976A - カドミウム耐性遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カドミウム耐性遺伝子の各種遺伝子材料と、
カドミウム耐性生物、並びに遺伝子の発現産物であるカ
ドミウム結合タンパク質を提供する。 【解決手段】 配列番号１または配列番号１における翻
訳領域の塩基配列を有するポリヌクレオチド、これらの
ポリヌクレオチドを保有する組換えベクター、これらの
ポリヌクレオチドを形質導入したカドミウム耐性生物、
並びに配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、カドミウ
ム耐性遺伝子に関するものである。さらに詳しくは、こ
の出願の発明は、カドミウム汚染環境の浄化等に有用な
新規カドミウム耐性遺伝子（ポリヌクレオチド）と、こ
の遺伝子が発現するカドミウム結合タンパク質（ポリペ
プチド）に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】カドミウム（cadmium）は金属や合金と
して広く利用されており、メッキ、溶接、電池、顔料、
合成樹脂の安定剤、原子炉制御棒などに使用されている
が、人体には有毒であり、腎臓障害や、カルシウムおよ
びリン代謝の異常に起因する骨粗鬆症、発癌性や高血圧
等との関係が指摘されている。また、染色体ＤＮＡに対
する変異原としての危険性も示唆されている（例えば、
IARC Sci. Publ 118:367-375, 1992）。

【０００３】このような有毒なカドミウムは、経口また
は経気道的に生体内に取り込まれ、排泄には長期間を要
するため、高濃度のカドミウムに汚染された土壌や水域
からの農産物や水産物の摂取は人体に深刻な影響を及ぼ
す。このため、カドミウムそれ自体やカドミウム含有物
質の処分には十分な配慮が求められことは当然として、
既にカドミウムに汚染された土壌や水域の浄化・修復が
強く望まれている。

【０００４】近年、汚染環境の浄化・修復方法として、
生物の働きを利用した技術（バイオ・レメディエーショ
ン）の実用化が本格化しつつある。カドミウム汚染の浄
化・修復についても、カドミウム耐性生物に土壌中や水
中のカドミウムを蓄積させ、回収・除去する方法が提案
されている。しかしながら、カドミウム中で生存可能な
生物は限られているため、実施可能な環境や規模が制限
されてしまう。また、任意の生物にカドミウム耐性を獲
得させることも可能ではあるが、耐性獲得には長期間を
要し、しかも実用化に耐えうる耐性獲得の保証はない。

【０００５】このような理由から、カドミウム耐性遺伝
子と、この遺伝子による形質転換生物の利用が注目を集
めている。カドミウム耐性遺伝子としては、細胞内の金
属結合タンパク質であるメタロチオネイン（ＭＴ）遺伝
子が最も広範に検討されている。例えば、マウスのＭＴ
−１遺伝子を導入したカドミウム耐性大腸菌（Biochem.
Biophys. Acta 951:230-234, 1988）、マウスＭＴ−１
遺伝子を形質導入したカドミウム耐性トランスジェニッ
ク・タバコ（Plant Mol. Biol. 24:341-351, 1994）、
ヒトＭＴ−２遺伝子を導入したカドミウム耐性大腸菌
（J. Biochem. 118:1131-1137, 1995）、ＭＴ遺伝子を
導入したカドミウム耐性トランスジェニック・ショウジ
ョウバエ（Environ. Health Perspect 103:1116-1118,
1995）、マウスＭＴ遺伝子を導入したカドミウム耐性cy
anobacterium Synechoccus（J. Ind.Microbiol. 17:41-
46, 1996）、ＭＴ遺伝子を導入したカドミウム耐性ヒラ
メ幼生（Fundam. Appl. Toxicol. 33:91-99, 1996）等
が知られている。

【０００６】また、他のカドミウム耐性遺伝子として
は、例えば、Schizosaccharomyces pombeのプリン合成
遺伝子（Mol. Cell Biol. 12:5301-5310, 1992）、Stap
hylococcus lugdunesisのカドミウム耐性プラスミドに
存在する遺伝子（Plasmid 36:1-8, 1996）、Candida gl
abrataのＨＥＭ２遺伝子（J. Inorg. Biochem. 69:293-
3-3, 1998）、グルタチオン合成酵素をコードする大腸
菌gshII遺伝子と、この遺伝子を導入したカドミウム耐
性／蓄積カラシ（Plant Physiol. 119:73-80, 1999）、
シロイヌナズナ、Schizosaccharomyces pombeおよびCae
norhabditis elegansのフィトケラチン合成酵素遺伝子
群（EMBO J. 18:3325-3333, 1999）等が知られている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、カドミ
ウム汚染土壌／汚染水に対する生物学的浄化・修復のた
めの遺伝子材料として様々なカドミウム耐性遺伝子と、
これらの遺伝子を導入した形質転換生物が知られている
が、実用化にまではいたっていない。

【０００８】この出願の発明者らは、新たなカドミウム
耐性遺伝子の探索を目的として、様々な生物種の遺伝子
をスクリーニングした結果、緑藻クラミドモナス（Chla
mydomonas）からカドミウム耐性遺伝子のｃＤＮＡを単
離することに成功した。

【０００９】この出願は、この発明者らが単離した新規
のカドミウム耐性遺伝子ｃＤＮＡを産業上利用可能なも
のとして提供することを課題としている。またこの出願
は、このカドミウム耐性遺伝子の各種遺伝子材料と、形
質転換生物、並びに遺伝子の発現産物であるカドミウム
結合タンパク質を提供することを課題としてもいる。

【００１０】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の各課
題を解決するものとして、以下の(1)〜(9)の発明を提供
する。 (1) 配列番号１の塩基配列を有するポリヌクレオチ
ド。 (2) 配列番号１における翻訳領域の塩基配列を有する
ポリヌクレオチド。 (3) 前記発明(1)または(2)のポリヌクレオチドを保有
する組換えベクター。 (4) 前記発明(1)または(2)のポリヌクレオチドを形質
導入したカドミウム耐性生物。 (5) 前記発明(1)または(2)のポリヌクレオチドの発現
産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチド。

【００１１】以下、各発明の実施の形態について詳しく
説明する。

【００１２】

【発明の実施の形態】この出願の発明(1)のポリヌクレ
オチドは、後記の実施例に記載したように、耐塩性クラ
ミドモナス属緑藻Ｗ80株（J. Ferment. Bioeng. 85:123
-125, 1998）の遺伝子ｃＤＮＡを保有する組換えベクタ
ーによって大腸菌を形質転換し、カドミウム含有培地で
生育する大腸菌から回収したベクターのインサートをク
ローニングした遺伝子ｃＤＮＡであり、配列番号１に示
した塩基配列を有することを特徴とするポリヌクレオチ
ドである。

【００１３】この出願の発明(2)は、発明(1)のポリヌク
レオチド翻訳領域（配列番号１の109−897位置）をコー
ドするポリヌクレオチドである。発明(1)のポリヌクレ
オチドは、化学合成による方法やクラミドモナスＷ80株
のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法など
を用いて取得することができる。

【００１４】ｃＤＮＡライブラリーから目的のポリヌク
レオチドをクローン化するには、この出願によって提供
される配列番号１の任意部分の塩基配列に基づいてオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用い
て、公知の方法によりコロニーあるいはプラークハイブ
リダイゼーションによるスクリーニングを行えばよい。
また、目的とするポリヌクレオチドの両末端にハイブリ
ダイズするオリゴヌクレオチドを合成し、これをプライ
マーとして用いて、クラミドモナスから単離したゲノム
ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、前記発明(1)のポ
リヌクレオチドを調製することもできる。

【００１５】発明(2)のポリヌクレオチドは、発明(1)の
ポリヌクレオチドを適当な制限酵素等によって切断する
方法や、この配列の両端に対応するプライマーを用い、
発明(1)のポリヌクレオチドを鋳型とするＰＣＲ法によ
り調製することができる。

【００１６】なお、発明(1)および(2)の各ヌクレオチド
配列においては、１または複数個のヌクレオチドの付
加、欠失および／または他のヌクレオチドによる置換が
なされている場合もこの発明の範囲に含まれる。

【００１７】この出願の発明(3)の組換えベクターは、
各々、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細
胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞のそれぞれに
適した発現ベクターに、発明(1)または(2)のポリヌクレ
オチドを挿入させることによって構築することができ
る。例えば、大腸菌などの微生物用の発現ベクターを構
築する場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロ
モーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部
位、ターミネーター等を有する発現ベクターに、前記発
明(1)または(2)のポリヌクレオチドを挿入して構築する
ことができる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ
系、ｐＢluescript II、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ
発現システムなどが例示できる。

【００１８】また、真核細胞用の発現ベクターの場合に
は、前記発明(1)または(2)のポリヌクレオチドを、プロ
モーター、スプライシング領域、ポリ(A)付加部位等を
有する真核細胞用発現ベクターに組換えることによって
構築することができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ
１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐ
ＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲ
Ｓ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。

【００１９】これら発明(3)の組換えベクターは、例え
ば、発明(5)のポリペプチドを遺伝子工学的に大量生産
する場合に使用することができる。すなわち、これらの
発現ベクターによって形質転換した原核細胞や真核細胞
を培養することによって、この培養細胞から発明(5)の
ポリペプチドを大量に取得することができる。

【００２０】この出願の発明(4)のカドミウム耐性生物
は、発明(1)または(2)のポリヌクレオチドを形質導入し
た大腸菌、枯草菌等の原核細胞、あるいは酵母、昆虫、
哺乳動物、植物である。カドミウム耐性の原核細胞や酵
母等は、前記発明(3)の組換えベクターによる形質転換
細胞として作成することができる。また、カドミウム耐
性の昆虫や哺乳動物等は、前記ポリヌクレオチドを導入
した全能性細胞を仮親の体内で個体発生させ、出生させ
た生物個体（トランスジェニック生物）として作成する
ことができる。さらに植物の場合には、例えば、形質転
換した細胞のカルス培養や、あるいはアグロバクテリウ
ム等を用いたポリヌクレオチドの形質導入によってカド
ミウム耐性植物とすることができる。

【００２１】これらのカドミウム耐性生物は、カドミウ
ム汚染土壌・水域の浄化および修復に用いることができ
る。発明(5)のポリペプチドは、例えば、配列番号２の
アミノ酸配列に基づいて化学合成する方法や、発明(1)
または(2)のポリヌクレオチドをインビトロ翻訳する方
法、あるいは前記発明(3)の組換えベクターによる形質
転換細胞を培養する方法等によって取得することができ
る。

【００２２】形質転換細胞を培養したのち、培養物から
目的のポリヌクレオチドを単離精製するためには、公知
の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、
尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処
理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限
外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳
動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグ
ラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相ク
ロマトグラフィーなどがあげられる。

【００２３】このようにして得たポリヌクレオチドは、
例えば他の成分との化合物として、あるいは適当な担体
等と結合させてカドミウム汚染土壌・水域に散布するな
どにより、その浄化・修復に用いることができる。

【００２４】なお、この発明(5)のポリペプチドには、
配列番号２のアミノ酸配列のいかなる部分アミノ酸配列
からなるペプチド断片（５アミノ酸残基以上）も含まれ
る。特に、配列番号２の126−142位置にはヒスチジン残
基（His）とアスパラギン残基（Asp）を多く含み、カド
ミウム結合能が高いと予想されるため、この配列領域を
含むペプチド断片は有用である。

【００２５】以下、発明(1)のポリヌクレオチド（ｃＤ
ＮＡ）の取得方法について説明する。 (a) ｃＤＮＡライブラリーの構築 耐塩性クラミドモナ属緑藻Ｗ80株からｍＲＮＡを単離
し、このｍＲＮＡを定法に従って逆転写させてｃＤＮＡ
を調製した。次いで、これらのｃＤＮＡ断片をλＺＡＰ
IIファージベクターに挿入し、λＵni−ＺＡＰ ＸＲラ
イブラリーを構築した。 (b) 形質転換大腸菌の作成 λＵni−ＺＡＰ ＸＲライブラリーからin vivo mass ex
cisionによってＢluescriptファージミッドを組換え、
この組換えベクターによって大腸菌を形質転換した。 (c) カドミウム耐性コロニーの選択 １mＭのカドミウムを含むＬＢ−Ｃbプレート（Cb：カル
ベニシリン）に形質転換大腸菌を播き、このプレートで
生育するコロニーを選択し、分離した。 (d) カドミウム耐性遺伝子ｃＤＮＡの特定 選択したコロニーから組換えベクターを単離し、そのイ
ンサート部分を切り出して定法により塩基配列を決定し
た。その結果、このｃＤＮＡクローンは配列番号１の塩
基配列を有することが確認された。また、データベース
検索の結果、既知遺伝子には相同のものが存在しないこ
とから、このクローンは新規遺伝子のｃＤＮＡであるこ
とも確認された。

【００２６】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、新規のカドミウム耐性遺伝子が提供され
る。この遺伝子は、カドミウムに汚染された土壌や水域
のバイオ・レメディエーションの実用化に大きく貢献す
る。

【００２７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 関西電力株式会社（The Kansai Electric Power Co.） <120> カドミウム耐性遺伝子 <130> OP99364 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1290 <212> DNA <213> Chlamydomonas <220> <221> CDS <222> (109)..(897) <400> 1 gaattcggca cgagctgcct cgcacctccg cccccccttc ccccgcacgg agctcccccc 60 cggtcgggcg cacccaccgc aatcgctttg acgaagaacg tgctcgcc atg tcc gcc 117 Met Ser Ala 1 gac gcc gag aag cag tcg ctg ctg gcg acg ggc gtg ccc gcg cac gct 165 Asp Ala Glu Lys Gln Ser Leu Leu Ala Thr Gly Val Pro Ala His Ala 5 10 15 gcg ggc gat gcg ccg aag gtc gcg ccg cgc gag tgg cgc cac cgc tgg 213 Ala Gly Asp Ala Pro Lys Val Ala Pro Arg Glu Trp Arg His Arg Trp 20 25 30 35 tac gcc atc ctc ggc gac tgc tcc gcg ccc gac gtc gtg tca tgc ctg 261 Tyr Ala Ile Leu Gly Asp Cys Ser Ala Pro Asp Val Val Ser Cys Leu 40 45 50 ctg gcg tgg aag ctt ccg ttt gtg gcg tgg gcg tgg aac cag aac cgc 309 Leu Ala Trp Lys Leu Pro Phe Val Ala Trp Ala Trp Asn Gln Asn Arg 55 60 65 gca ctg ggg atg tcg ttc tgg cgc gag ctg ctg cgc ttc gcg gtc atc 357 Ala Leu Gly Met Ser Phe Trp Arg Glu Leu Leu Arg Phe Ala Val Ile 70 75 80 gtc gtt ggc ttt gtg gtg gcc acg cac gtc gcg tac tgc ggc gtc atg 405 Val Val Gly Phe Val Val Ala Thr His Val Ala Tyr Cys Gly Val Met 85 90 95 atg gcc atg tgc ccg gag atc cat gac cgc gat ggt gcc agc gtc gac 453 Met Ala Met Cys Pro Glu Ile His Asp Arg Asp Gly Ala Ser Val Asp 100 105 110 115 ggc ggc cca ggc atg atg cgc aag ctg ctg cac atg cac cag cac cac 501 Gly Gly Pro Gly Met Met Arg Lys Leu Leu His Met His Gln His His 120 125 130 agt cac cac cac gac gac gac tcc acc gac gac tcc acc gac agc cac 549 Ser His His His Asp Asp Asp Ser Thr Asp Asp Ser Thr Asp Ser His 135 140 145 gac cac ggc atg tgg ggc gaa gac ggc ccg cac ggc atc ccg agg gag 597 Asp His Gly Met Trp Gly Glu Asp Gly Pro His Gly Ile Pro Arg Glu 150 155 160 tgc gtc gcg cgc gtc gcg cca gcc tac gtg gcc atc acc ggc gtc ttc 645 Cys Val Ala Arg Val Ala Pro Ala Tyr Val Ala Ile Thr Gly Val Phe 165 170 175 ctc gcg ctc gcg gtc tac atg acc ctg ttc ttc gca cgc cgc cgc aca 693 Leu Ala Leu Ala Val Tyr Met Thr Leu Phe Phe Ala Arg Arg Arg Thr 180 185 190 195 gcg ctg cgc gag cgc tac ggc atc gcc ggc acc gcg cgc gag gac tgc 741 Ala Leu Arg Glu Arg Tyr Gly Ile Ala Gly Thr Ala Arg Glu Asp Cys 200 205 210 ctg ctg tac gcg ttc tgc acg ccg tgc gcg ctc gca cag gag acg cgc 789 Leu Leu Tyr Ala Phe Cys Thr Pro Cys Ala Leu Ala Gln Glu Thr Arg 215 220 225 acg ctc atc cac gag cag gtg cac gac ggc atc tgg tac ggc gcg ctg 837 Thr Leu Ile His Glu Gln Val His Asp Gly Ile Trp Tyr Gly Ala Leu 230 235 240 ccg ggc gtc gcg ccg ccg gcc gcg acg gtc gcc gcc ccc gcg ccg cag 885 Pro Gly Val Ala Pro Pro Ala Ala Thr Val Ala Ala Pro Ala Pro Gln 245 250 255 aag atg gcg gtg tgaccgtgcg atgggcgcat ccccgcggcg ccacgtgagg 937 Lys Met Ala Val 260 ctgcgagtgc cccgcgaatg cgtgaccggc gcccgtggct gctgacctag gatcggcaca 997 tcccttttct gtgaccatgt accatcgggg gattgagtgt cgttgcccca cctaaacgca 1057 gctgcggcga cgtgcacgtg tgtacccgat aagaggaaaa caagtttgca catacgttat 1117 gcaagccgtg agacgacctg gcttgcagct tgcacaaaat accttgttca tttgcaggct 1177 gcatgccggg cgggcttgca attctaaaag acaggagtcg attgcaagct gcgcgccaaa 1237 cgcgactgta actcgagaag acggaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaactc gag 1290 <210> 2 <211> 263 <212> PRT <213> Chlamydomonas <400> 2 Met Ser Ala Asp Ala Glu Lys Gln Ser Leu Leu Ala Thr Gly Val Pro 1 5 10 15 Ala His Ala Ala Gly Asp Ala Pro Lys Val Ala Pro Arg Glu Trp Arg 20 25 30 His Arg Trp Tyr Ala Ile Leu Gly Asp Cys Ser Ala Pro Asp Val Val 35 40 45 Ser Cys Leu Leu Ala Trp Lys Leu Pro Phe Val Ala Trp Ala Trp Asn 50 55 60 Gln Asn Arg Ala Leu Gly Met Ser Phe Trp Arg Glu Leu Leu Arg Phe 65 70 75 80 Ala Val Ile Val Val Gly Phe Val Val Ala Thr His Val Ala Tyr Cys 85 90 95 Gly Val Met Met Ala Met Cys Pro Glu Ile His Asp Arg Asp Gly Ala 100 105 110 Ser Val Asp Gly Gly Pro Gly Met Met Arg Lys Leu Leu His Met His 115 120 125 Gln His His Ser His His His Asp Asp Asp Ser Thr Asp Asp Ser Thr 130 135 140 Asp Ser His Asp His Gly Met Trp Gly Glu Asp Gly Pro His Gly Ile 145 150 155 160 Pro Arg Glu Cys Val Ala Arg Val Ala Pro Ala Tyr Val Ala Ile Thr 165 170 175 Gly Val Phe Leu Ala Leu Ala Val Tyr Met Thr Leu Phe Phe Ala Arg 180 185 190 Arg Arg Thr Ala Leu Arg Glu Arg Tyr Gly Ile Ala Gly Thr Ala Arg 195 200 205 Glu Asp Cys Leu Leu Tyr Ala Phe Cys Thr Pro Cys Ala Leu Ala Gln 210 215 220 Glu Thr Arg Thr Leu Ile His Glu Gln Val His Asp Gly Ile Trp Tyr 225 230 235 240 Gly Ala Leu Pro Gly Val Ala Pro Pro Ala Ala Thr Val Ala Ala Pro 245 250 255 Ala Pro Gln Lys Met Ala Val 260

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０２Ｆ 3/34 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｄ０４０ Ｃ０７Ｋ 14/405 1/19 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｂ０９Ｂ 3/00 ＺＡＢＥ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2B030 AD05 CA14 CA17 4B024 AA03 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 CA02 CA08 CA19 CC24 DA16 4B065 AA26X AA83Y AB01 AC20 BA02 BA22 CA24 CA56 4D004 AA41 AB03 CA17 CC07 4D040 DD01 DD20 4H045 AA10 AA30 BA10 CA10 DA89 EA60 FA74

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１の塩基配列を有するポリヌク
   レオチド。
2. 【請求項２】 配列番号１における翻訳領域の塩基配列
   を有するポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項１または請求項２のポリヌクレオ
   チドを保有する組換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項１または請求項２のポリヌクレオ
   チドを形質導入したカドミウム耐性生物。
5. 【請求項５】 請求項１または請求項１のポリヌクレオ
   チドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列を
   有するポリペプチド。