CN107828797A

CN107828797A - 莱茵衣藻tic20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用

Info

Publication number: CN107828797A
Application number: CN201711228381.9A
Authority: CN
Inventors: 胡长峰; 胡潇; 章伟雄; 彭海; 陈斌; 刘艳玲; 王露; 丁梅; 刘致浩; 李甜甜
Original assignee: Jianghan University
Current assignee: Jianghan University
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2018-03-23

Abstract

本发明公开了莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，属于生物技术领域与环境污染治理领域。本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段（SEQ ID NO:3）随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到TIC20基因（CDS序列如SEQ ID NO:1所示）中造成的。通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因能够降低莱茵衣藻的镉耐受性；通过基因工程手段获得的镉敏感型莱茵衣藻藻株可应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的情况。

Description

莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域与环境污染治理领域，具体涉及莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。

背景技术

随着科技的飞速发展，我国的工业化程度不断提高，随之而来的一系列环境问题逐渐被人们所重视。由于不科学，不环保的工业发展，导致了一系列的环境污染，其中大气污染和水环境污染尤为严重，而这其中的污染就包括镉污染。镉污染属于重金属污染，镉的来源很广泛，废弃电池、汽车废气、重工业废水中都含有镉，其中废弃电池会造成土壤镉污染，汽车尾气会造成大气镉污染，而重工业排放的废水会造成水环境废污染。因此，如何对环境中的重金属镉进行监控和富集回收已经成为了研究的热点问题。

莱茵衣藻是一种单细胞真核生物，能够在水体环境和土壤中生长，利用衣藻的这种生物特性可以很容易的检测水体环境和土壤中的重金属镉。衣藻培养条件简单，所以相比于物理化学法来检测和治理重金属镉污染，生物法更为简单且成本低，利用微生物来检测和治理重金属镉被得到广泛的关注，包括细菌和藻类，利用这类微生物体积小，容易培养等特性，可以将微生物置于重金属环境中，利用微生物的代谢检测环境中的重金属。

野生型的莱茵衣藻对镉具有一定的吸附作用，而一些突变体对镉敏感，与野生型的莱茵衣藻相比，这些突变体在相同的条件下对镉的吸附能力更弱或是对镉没有吸附能力。莱茵衣藻突变体的筛选体系简单，培养方便，莱茵衣藻的基因组已经全部测序成功，这对其基因和编码蛋白的研究更加方便。

发明内容

本发明的首要目的在于提供莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于TIC20基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本发明的目的还在于提供莱茵衣藻TIC20基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到TIC20基因的3’UTR中造成的。TIC20基因在JGI莱茵衣藻基因数据库中的基因编号是Cre08.g379650，位于莱茵衣藻第8号染色体的4105757-4109255区域，其CDS序列如SEQ IDNO:1所示。

基于上述发现，本发明的目的之一是提供莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。

所述TIC20基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：

(1)包含如SEQ ID NO:1所示780bp的核苷酸序列；

(2)包含编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列；

(3)包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述TIC20基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：

(1)包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；

(2)包含由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。

本发明的目的之二是提供上述莱茵衣藻TIC20基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。

本发明的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻TIC20基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。

本发明的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述镉敏感型藻株为不含TIC20基因活性的TIC20基因突变株或TIC20基因缺失株，或TIC20基因表达下降的TIC20基因表达缺陷株。

本发明的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻TIC20基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻TIC20基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻TIC20基因表达缺陷株。

本发明的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测与检测的应用。根据莱茵衣藻的TIC20基因表达缺陷株、TIC20基因突变株或TIC20基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。所述莱茵衣藻镉敏感型藻株应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究TIC20基因在衣藻重金属镉代谢调控网络中的作用机制，可进一步为生物法治理污水提供理论基础。

本发明的有益效果是：

(1)本发明通过电击转化法将aphⅧ片段导入衣藻中，通过抗生素筛选得到对镉敏感的突变体藻株(tic20)方法简单，效率高。

(2)本发明通过RESDA-PCR技术鉴定出突变体突变基因TIC20及插入突变位点，用于研究衣藻重金属代谢机制。

(3)本发明通过0.4mM氯化镉筛选，并通过含0.4mM氯化镉固体培养基多次复筛得到对镉敏感的突变体藻株的方法可行且获得的突变体性状稳定。

(4)本发明所得到的镉敏感型藻株可用于水环境中镉污染的检测和监控，将藻株吸附在专门的材料载体上不会造成二次污染、便于回收。

附图说明

图1为pJMG-aphⅧ质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

图2为野生型莱茵衣藻21gr和镉敏感型衣藻突变体(tic20)经0.4mM氯化镉筛选的生长对照图。

图3为镉敏感型衣藻突变体(tic20)经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳图。

图4为镉敏感型衣藻突变体(tic20)中TIC20基因的插入突变位点示意图。

具体实施方式

为了让该领域或者相关人员能够更好的了解这个发明，下面结合以下几个实施例进行说明，这些方法只是为了更好的阐述该发明，并不限制本发明。以下实施例中，没有特殊说明的均为常规方法。

下述实施例中所用培养基配方如下：

TAP培养基配方：Tris 1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、SolutionⅡ(磷酸盐)0.188mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。固体培养基则加入7.5g Agar(琼脂)。

TAgP培养基配方：Tris 1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、甘油磷酸钠(1M)0.376mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。若要配制固体培养基则加入7.5g Agar(琼脂)。

实施例1：通过电转化法得到莱茵衣藻转化子

(1)将野生型莱茵衣藻(21gr)从固体TAP培养基上转接至高压蒸汽灭菌过的TAP液体培养基中，连续光周期下吹气培养至细胞浓度为1×10⁷细胞/mL(此过程大约需要三天),将在光周期下培养浓度至1×10⁷细胞/mL的细胞转接至含有TAP液体培养基的摇瓶中(摇瓶经过高压蒸汽灭菌)使细胞初始浓度为1×10⁶细胞/mL，在连续光周期和摇床转速为200rpm的条件下培养细胞，使细胞浓度为4×10⁶细胞/mL时做电转化。

(2)通过酶切pJMG-aphⅧ(Zhangfeng Hu,Yinwen Liang,Wei He,Junmin Pan^*,CiliaDisassembly with Two Distinct Phases of Regulation,Cell Reports,2015,10(11):1803-1810)(该质粒为氨苄抗性)得到的aphⅧ片段(序列SEQ ID NO:3所示，编码巴龙霉素(paromomycin)抗性基因)，图1为pJMG-aphⅧ质粒通过EcoRⅠ酶酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

(3)将准备好的aphⅧ片段和摇瓶中培养好的细胞进行电击转化实验(具体操作步骤参考专利201611022254.9)，电击转化实验涂板后，将藻均匀涂在TAP+paromomycin(paromomycin：巴龙霉素，10μg/mL)的固体培养基上，待其干燥后，用封口膜封闭平板并放在光周期下(14h光照/10h黑暗)培养3-5天使其长出转化子。

实施例2：通过筛选转化子得到镉敏感型莱茵衣藻突变体

(1)将转化子用灭过菌的牙签挑至TAgP固体培养基上，并进行编号，用封口膜封闭好培养皿，将其放至光周期下培养3-5天。

(2)将TAgP固体培养基上的转化子用灭过菌的牙签挑至镉浓度为0.4mM的TAgP固体培养基上(0.4mM氯化镉的筛选浓度为申请人前期实验获得的重金属镉敏感型突变体的最佳筛选浓度，具体见专利201611022254.9)，对应TAgP固体培养基上的转化子编号，用封口膜封闭好培养皿，将其放至光周期下培养3-5天。

(3)观察转化子的生长情况，若该转化子在镉浓度为0.4mM的TAgP固体培养基上不能正常生长，则初步认定它为镉敏感型莱茵衣藻突变体。

(4)将初步认定的镉敏感型莱茵衣藻突变体从TAgP固体培养基上挑至镉浓度为0.4mM的TAgP固体培养基上复筛，镉浓度为0.4mM的TAgP固体培养基上涂有野生型莱茵衣藻(21gr)与镉敏感型莱茵衣藻突变体对比。若初步认定的镉敏感型突变体在氯化镉浓度为0.4mM的TAgP固体培养基上不能正常生长而野生型衣藻21gr能正常生长则认定其为镉敏感型突变体。如此反复复筛3-5次进一步确定性状。图2为筛选所获得的镉敏感型突变体(tic20)和野生型莱茵衣藻在0.4mM氯化镉的TAgP平板上的生长对照图。

实施例3：鉴定镉敏感型莱茵衣藻突变体突变基因序列及插入突变位点

(1)将镉敏感型莱茵衣藻突变体从TAgP固体培养基上挑至TAP固体培养基上保种。

(2)3-5天后，将镉敏感型莱茵衣藻突变体从TAP固体培养基上挑至液体培养基中，光周期下培养3-5天，使细胞浓度为4×10⁶/mL。

(3)用CTAB法提取镉敏感型莱茵衣藻突变体DNA，将得到的DNA放置-80℃保存。

(4)根据插入片段aphⅧ的核酸序列设计特异引物F-Z2和F-Z8，根据衣藻基因组特点设计引物Q0和由Q0与AluI、PstI、SacII、TaqI限制性内切酶特异识别序列组成的简并引物DegAluI、DegPstI、DegSacII、DegTaqI。以镉敏感型莱茵衣藻突变体DNA为模板，利用RESDA-PCR技术进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳后，将500bp以上的条带切胶送测序。本发明获得的镉敏感型衣藻突变体DNA经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳结果见图3所示，其中A、P、S、T分别代表包含AluI、PstI、SacII、TaqI限制性内切酶的扩增产物。

RESDA-PCR引物序列见下表所示：

引物名称	5′—3′
		F-Z2	TTTTACCGGCTGTTGGAC
F-Z8	AGTTCTTCTGAGGGACCTG
		Q0	CCAGTGAGCAGAGTGACG
DegAluI	CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSWCAGCTT
		DegPstI	CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSCTGCAGW
DegSacII	CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSCCGCGGW
		DegTaqI	CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSWGTCGAA

(5)将测序结果与aphⅧ片段比对，获得插入片段及其侧翼序列信息。根据获得的部分突变基因序列，在Phytozome网站衣藻数据库中进行比对，获得插入突变基因及其插入突变位点等信息。

(6)本发明所获得的氯化镉敏感型突变体是由于aphⅧ片段反向(3’-5’端)插入到TIC20基因的3’UTR中而形成的突变体，TIC20基因结构及插入突变位点见图4。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江汉大学

<120> 莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> Chlamydomonas reinhardti

<400> 1

atgtccgcgc tgctctcgca agcgtcgggc ttttcggggc ttgcgctagg cagctctgct 60

agtagcaagc gtctatgtaa gcctctgtgc cggcggccgg ccgtctgtgt tcaggccgcg 120

catagaccag ccagcgccgt ctcgagcggg gtaccaagca caggcttcgg ccccgtctcg 180

ccgctccagc ggaggccgac cctaccgacc cggaaacttg tggtcgcctc gtcgcaaagc 240

gggggcaggg ccgaggatgc ggagaaacag gactggaaat tcgggcgcaa tgagggcccg 300

atgacctggc cctggaagct gatgtgcgca attctgtaca tgcttccctg ggtggatgtg 360

acggagaaga cagtgtactt cgtggagcgc ttccccgcct tcgtgtggac ggagtacttc 420

tcggagccgt tcgagcactg gtacaacatc cacgagtacg cgccgctctt catcttcttc 480

gccacctacc tgggcattgt gcgcaacaag aagatcccgc acgtggcgcg ctaccacgtc 540

atgatgggcg tgatgctgga catcgtggcc atgatcctga tcgtgacgga ggagaacctg 600

cccaccggcg tgctgtggac tccctggtcc gacctgttct acgcgctcat gttctggttc 660

atcttcctgc tcgtcatcta ctgcctcttc ttctgcttcc tgggctggta ctgcgagatc 720

ccgctcatca gcgagggcgt gtacctgcag atcgagcagg ccgagcagct gggccagtaa 780

<210> 2

<211> 259

<212> PRT

<213> Chlamydomonas reinhardti

<400> 2

Met Ser Ala Leu Leu Ser Gln Ala Ser Gly Phe Ser Gly Leu Ala Leu

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ala Ser Ser Lys Arg Leu Cys Lys Pro Leu Cys Arg Arg

20 25 30

Pro Ala Val Cys Val Gln Ala Ala His Arg Pro Ala Ser Ala Val Ser

35 40 45

Ser Gly Val Pro Ser Thr Gly Phe Gly Pro Val Ser Pro Leu Gln Arg

50 55 60

Arg Pro Thr Leu Pro Thr Arg Lys Leu Val Val Ala Ser Ser Gln Ser

65 70 75 80

Gly Gly Arg Ala Glu Asp Ala Glu Lys Gln Asp Trp Lys Phe Gly Arg

85 90 95

Asn Glu Gly Pro Met Thr Trp Pro Trp Lys Leu Met Cys Ala Ile Leu

100 105 110

Tyr Met Leu Pro Trp Val Asp Val Thr Glu Lys Thr Val Tyr Phe Val

115 120 125

Glu Arg Phe Pro Ala Phe Val Trp Thr Glu Tyr Phe Ser Glu Pro Phe

130 135 140

Glu His Trp Tyr Asn Ile His Glu Tyr Ala Pro Leu Phe Ile Phe Phe

145 150 155 160

Ala Thr Tyr Leu Gly Ile Val Arg Asn Lys Lys Ile Pro His Val Ala

165 170 175

Arg Tyr His Val Met Met Gly Val Met Leu Asp Ile Val Ala Met Ile

180 185 190

Leu Ile Val Thr Glu Glu Asn Leu Pro Thr Gly Val Leu Trp Thr Pro

195 200 205

Trp Ser Asp Leu Phe Tyr Ala Leu Met Phe Trp Phe Ile Phe Leu Leu

210 215 220

Val Ile Tyr Cys Leu Phe Phe Cys Phe Leu Gly Trp Tyr Cys Glu Ile

225 230 235 240

Pro Leu Ile Ser Glu Gly Val Tyr Leu Gln Ile Glu Gln Ala Glu Gln

245 250 255

Leu Gly Gln

<210> 3

<211> 2118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattcgatct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 60

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 120

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 180

tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct ccaccgcggt 240

ggcggccgct ctagaactag tggatccact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg 300

cggccgctct agagacggcg gggagctcgc tgaggcttga catgattggt gcgtatgttt 360

gtatgaagct acaggactga tttggcgggc tatgagggcg cgggaagctc tggaagggcc 420

gcgatggggc gcgcggcgtc cagaaggcgc catacggccc gctggcggca cccatccggt 480

ataaaagccc gcgaccccga acggtgacct ccactttcag cgacaaacga gcacttatac 540

atacgcgact attctgccgc tatacataac cactcagcta gcttaagatc ccatcaagct 600

tgcatgccgg gcgcgccaga aggagcgcag ccaaaccagg atgatgtttg atggggtatt 660

tgagcacttg caacccttat ccggaagccc cctggcccac aaaggctagg cgccaatgca 720

agcagttcgc atgcagcccc tggagcggtg ccctcctgat aaaccggcca gggggcctat 780

gttctttact tttttacaag agaagtcact caacatctta aaatggccag gtgagtcgac 840

gagcaagccc ggcggatcag gcagcgtgct tgcagatttg acttgcaacg cccgcattgt 900

gtcgacgaag gcttttggct cctctgtcgc tgtctcaagc agcatctaac cctgcgtcgc 960

cgtttccatt tgcaggatgg ccactccgcc ctccccggtg ctgaagaatt tcgaagcatg 1020

gacgatgcgt tgcgtgcact gcggggtcgg tatcccggtt gtgagtgggt tgttgtggag 1080

gatggggcct cgggggctgg tgtttatcgg cttcggggtg gtgggcggga gttgtttgtc 1140

aaggtggcag ctctgggggc cggggtgggc ttgttgggtg aggctgagcg gctggtgtgg 1200

ttggcggagg tggggattcc cgtacctcgt gttgtggagg gtggtgggga cgagagggtc 1260

gcctggttgg tcaccgaagc ggttccgggg cgtccggcca gtgcgcggtg gccgcgggag 1320

cagcggctgg acgtggcggt ggcgctcgcg gggctcgctc gttcgctgca cgcgctggac 1380

tgggagcggt gtccgttcga tcgcagtctc gcggtgacgg tgccgcaggc ggcccgtgct 1440

gtcgctgaag ggagcgtcga cttggaggat ctggacgagg agcggaaggg gtggtcgggg 1500

gagcggcttc tcgccgagct ggagcggact cggcctgcgg acgaggatct ggcggtttgc 1560

cacggtcacc tgtgcccgga caacgtgctg ctcgaccctc gtacctgcga ggtgaccggg 1620

ctgatcgacg tggggcgggt cggccgtgcg gaccggcact ccgatctcgc gctggtgctg 1680

cgcgagctgg cccacgagga ggacccgtgg ttcgggccgg agtgttccgc ggcgttcctg 1740

cgggagtacg ggcgcgggtg ggatggggcg gtatcggagg aaaagctggc gttttaccgg 1800

ctgttggacg agttcttctg agggacctga tggtgttggt ggctgggtag ggttgcgtcg 1860

cgtgggtgac agcacagtgt ggacgttggg atccccgctc cgtgtaaatg gaggcgctcg 1920

ttgatctgag ccttgccccc tgacgaacgg cggtggatgg aagatactgc tctcaagtgc 1980

tgaagcggta gcttagctcc ccgtttcgtg ctgatcagtc tttttcaaca cgtaaaaagc 2040

ggaggagttt tgcaattttg ttggttgtaa cgatcctccg ttgattttgg cctctttctc 2100

catgggcggg ctggaatt 2118

Claims

1.莱茵衣藻TIC20基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述TIC20基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：

（1）包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

（2）包含编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列；

（3）包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述TIC20基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：

（1）包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；

（2）包含由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。

3.莱茵衣藻TIC20基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因来降低莱茵衣藻镉耐受性。

4.一种降低莱茵衣藻镉耐受性的方法，其特征在于：通过降低莱茵衣藻TIC20基因的表达、使TIC20基因失活或缺失TIC20基因降来低莱茵衣藻镉耐受性。

5.一种莱茵衣藻镉敏感型藻株，其特征在于：所述镉敏感型藻株为不含TIC20基因活性的TIC20基因突变株或TIC20基因缺失株，或TIC20基因表达下降的TIC20基因表达缺陷株。

6.一种莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法，其特征在于：为下述方法中的一种：

通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻TIC20基因突变株；

通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻TIC20基因缺失株；

通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻TIC20基因表达缺陷株。

7.权利要求5所述的莱茵衣藻镉敏感型藻株在镉污染的监测或检测中的应用。

8.莱茵衣藻TIC20基因在镉污染的监测或检测中的应用。

9.莱茵衣藻TIC20基因在镉污染的治理中的应用。