CN107815456A - 莱茵衣藻cenpe1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用 - Google Patents
莱茵衣藻cenpe1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了莱茵衣藻CENPE1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，属于生物技术领域和污水治理领域。本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段（SEQ ID NO:3）随机插入衣藻中得到了明显抗氯化镉的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的抗镉性是由于aphⅧ片段插入到CENPE1基因（CDS序列如SEQ ID NO:1所示）中造成的。通过降低莱茵衣藻CENPE1基因的表达、使CENPE1基因失活或缺失CENPE1基因能够提高莱茵衣藻的镉耐受性；通过基因工程手段获得的镉耐受性增强的莱茵衣藻藻株可应用于镉污染水域的监控与治理中，为污水治理提供新的思路与生物材料。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域和污水治理领域，具体涉及莱茵衣藻CENPE1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
背景技术
随着社会经济和工业化生产的飞速发展，环境污染问题日趋严重，特别是重金属污染问题。重金属污染的来源有很多，工厂排出的“三废”(废水、废渣和废气)、汽车尾气、农药残留以及人们日常活动中产生的各种生活垃圾和废旧电子产品等均含有重金属，“三废”的超标违规排放以及生活垃圾、废旧电子产品的随意丢弃等极容易造成有毒有害的重金属在土壤、空气和水体中大量积累。而重金属具有长期性和不可降解性，难以被微生物进行降解，能够长时间存在土壤和水体中，随着饮用水和食物链最终会在人体中逐步积累，直接危害人类健康。镉污染是一种常见的重金属污染，主要是随着电镀、冶金、采矿、电池和化学工业等的废水和废渣的排放积累到水体和土壤中。镉不是人体必需元素，正常人的血液中的镉浓度小于5μg/L，尿液中小于1μg/L。镉可以在人体内不断积累，通过与金属硫蛋白形成镉硫蛋白积累到肾脏和肝脏中，影响泌尿系统的正常功能，镉还能够影响骨镉中的钙，造成骨骼严重软化，引起骨痛病，另外镉还可以干扰人体对二价金属元素的吸收，造成铁、铜、锌等元素的缺乏。早在1984年，联合国环境规划署就已经将镉列入具有全球意义的12种危害物之一。
目前，对重金属污染的治理主要有物理化学法(化学沉淀法、活性炭吸附法、高分子捕集剂法、溶剂萃取法、离子交换法、膜分离等)和生物法(微生物絮凝法、生物吸附法、植物修复法等)。相比较而言，传统的物理化学法往往成本较高、操作复杂，适合集中处理高浓度的重金属污染区域，如果大面积的使用则容易造成二次污染。而对于大流域、低浓度的重金属污染生物法治理具有更多的优势，不仅投入成本低、操作简单，而且容易避免和减少二次污染的问题。目前，利用微生物进行重金属污水治理成为的研究人员的关注热点，与动植物相比，微生物体积小、表面积大、繁殖快、适应能力强、易于培养等特点，被广泛研究用于重金属污水处理中。能够吸附和代谢重金属的微生物种类很多，主要包括一些工程细菌、真菌和藻类等。藻类是进行重金属污染水体修复的理想生物材料之一，目前被报道的可用于重金属污水治理的藻类种类很多，例如：莱茵衣藻、小球藻、马尾藻、四尾栅藻、团扇藻和螺旋藻等。不同的藻类往往对不同重金属的吸附效果也不同，许多研究表明藻类对多种重金属均有很好吸附能力，可以广泛应用于重金属污染水域的重金属富集回收及水体改造等方面。
莱茵衣藻是一种单细胞的真核生物，直径约10μm，细胞质中有一个大型杯状叶绿体，能够进行光合作用，因此被称为“绿色酵母”。在衣藻细胞的顶端具有两根鞭毛，可以游动，在细胞侧面还有可感光的眼点。莱茵衣藻同时具有动物细胞和植物细胞的特征，核基因为单倍体且基因组测序工作也已经完成，更重要的是莱茵衣藻有成熟的遗传转化体系，突变体容易获得，且细胞培养容易，生长速度快，繁殖快，已成为了科学研究的重要模式生物。
本发明利用电转化法将aphⅧ片段随机插入衣藻中，得到了对氯化镉具有明显抗性的突变藻株，进一步鉴定得到了与重金属镉耐受性调控相关的基因CENPE1及其编码蛋白，可应用于镉污染水域的监控与治理中，为污水治理提供新的思路与生物材料，同时也为进一步研究衣藻对重金属镉的耐受机制奠定基础。
发明内容
本发明的首要目的在于提供莱茵衣藻CENPE1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于CENPE1基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本发明的目的还在于提供莱茵衣藻CENPE1基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法以及镉耐受性增强藻株的应用等。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了明显抗氯化镉的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的抗镉性是由于aphⅧ片段插入到CENPE1(centromeric protein E(1of 4))基因第13个内含子中造成的。CENPE1基因在JGI莱茵衣藻基因数据库中的基因编号为Cre17.g741350，位于莱茵衣藻第17号染色体的6087210-6097515区域，其CDS序列如SEQ ID NO:1所示。
基于上述发现，本发明的目的之一是提供莱茵衣藻CENPE1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。
所述CENPE1基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：
(1)包含如SEQ ID NO:1所示5307bp的核苷酸序列；
(2)包含编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列；
(3)包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
所述CENPE1基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：
(1)包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
(2)包含由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。
本发明的目的之二是提供上述莱茵衣藻CENPE1基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻CENPE1基因的表达、使CENPE1基因失活或缺失CENPE1基因提高莱茵衣藻镉耐受性。
本发明的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻CENPE1基因提高莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻CENPE1基因的表达、使CENPE1基因失活或缺失CENPE1基因提高莱茵衣藻镉耐受性。
本发明的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株。所述镉耐受性增强藻株为不含CENPE1基因活性的CENPE1基因突变株或CENPE1基因缺失株，或CENPE1基因表达下降的CENPE1基因表达缺陷株。
本发明的目的之五是提供一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻CENPE1基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻CENPE1基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻CENPE1基因表达缺陷株。
本发明的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉耐受性增强藻株在重金属镉污染的监测、检测与治理中的应用。根据莱茵衣藻的CENPE1基因表达缺陷株、CENPE1基因突变株或CENPE1基因缺失株可以在较高浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测、检测和治理中，尤其可应用于污水中镉的监测、检测和治理中，为生物法污水处理提供一种的新的思路与新的材料。同时，研究CENPE1基因调控衣藻对重金属镉的耐受性的机制，可以进一步为生物法污水治理奠定理论基础。
本发明的有益效果是：
(1)本发明发现的CENPE1基因及其编码蛋白，是一种新的与重金属镉耐受性代谢调控相关的基因及蛋白，目前尚未见相关的研究报道。
(2)本发明中采用的获得与莱茵衣藻中重金属镉调控相关的基因和突变体的方法简单、技术体系成熟，能够进一步改进和应用到其他的藻类或模式植物中。
(3)藻类是研究生物法治理重金属水体污染的重要模式生物，本发明中获得的CENPE1基因具有插入约2k左右片段(aphⅧ)的插入突变体(cenpe1)能够在含较高浓度氯化镉的条件下正常生长，其可应用于镉污染水域的监控与治理中，为污水治理提供新的思路与生物材料。
(4)莱茵衣藻CENPE1基因突变体表现出了明显的抗氯化镉的特性，有利于进一步研究CENPE1基因在衣藻重金属镉吸附和代谢调控中的作用机制，可以进一步为生物法污水治理奠定理论基础。
附图说明
图1为pJMG-aphⅧ质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图。
图2为野生型莱茵衣藻21gr和氯化镉抗型衣藻突变体cenpe1在含0.6mM氯化镉的固体平板上的生长对比图，图中显示突变体能够正常生长，野生型的生长受到抑制。
图3为氯化镉抗型衣藻突变体经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳图。
图4为氯化镉抗型衣藻突变体的CENPE1基因插入突变位点示意图。
具体实施方式
为了使相关人员能够更好的理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明进行详细的说明。实施例中没有明确说明的方法均为常规的实验方法。
下述实施例中所用培养基配方如下：
TAP培养基配方：Tris 1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、SolutionⅡ(磷酸盐)0.188mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。固体培养基则加入7.5g Agar(琼脂)。
TAgP培养基配方：Tris 1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、甘油磷酸钠(1M)0.376mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。若要配制固体培养基则加入7.5g Agar(琼脂)。
实施例1
一、通过电转化法获得莱茵衣藻转化子
(1)准备aphⅧ片段
将含有aphⅧ片段的PJMG-aphⅧ质粒(Zhangfeng Hu,Yinwen Liang,Wei He,Junmin Pan*,Cilia Disassembly with Two Distinct Phases of Regulation,CellReports,2015,10(11):1803-1810)用EcoRⅠ酶37℃酶切过夜，1％琼脂糖凝胶电泳分离aphⅧ片段(2118bp，序列如SEQ ID NO:3)，酶切后电泳结果如图1所示。用生工公司凝胶回收试剂盒(货号为B518191-0100)进行胶回收aphⅧ片段，Q5000超微量核酸检测仪测定回收DNA片段的浓度，-20℃保存备用。
(2)准备用于电转化的衣藻细胞
莱茵衣藻21gr在TAP固体平板上进行活化，然后转接至TAP液体培养基中进行吹气培养，置于连续光照条件下吹气培养3-4天可达到1×107细胞/mL。取10mL上述衣藻细胞转接至含100mL TAP液体培养基的三角瓶中使初始浓度为1×106细胞/mL，置于摇床上(200rpm)，在连续光照条件下培养20h左右，使衣藻细胞浓度达到5×106细胞/mL。
(3)电击转化衣藻细胞
用50mL离心管收集衣藻细胞，加入预冷的TAP+60mM山梨醇溶液(含60mM山梨醇的TAP液体培养基)重悬，2500rpm离心3min，再加入适量的预冷的TAP+60mM山梨醇溶液重悬使衣藻细胞的终浓度为1-2×108细胞/mL，冰上放置10min。
于超净工作台内洗电击杯，先用无水乙醇洗一次，再用TAP+60mM山梨醇溶液洗三次，随后预冷电击杯。向电击杯中加入250μL预冷过的1-2×108细胞/mL的衣藻细胞，再加入150ng aphⅧ片段DNA，轻轻吸打混匀，于冰上放置10min。
调整电击仪(型号BTX ECM630)的参数为电压800V，电阻1575Ω，电容50μF。擦干电击杯外壳的水分，使电击杯带有金属条的两侧与电击仪的电击夹接触并夹紧电击杯，放下安全罩，开始电击(电击时间应控制在10-14ms)。电击完毕后，将电击杯在冰上放置10min。
将电击的衣藻细胞转移至含有10mL TAP+60mM山梨醇溶液的50mL离心管中，置于摇床上100rpm、弱光(锡箔纸包住)摇过夜。
2500rpm离心3min收集过夜修复的衣藻细胞，加入1mL 20％的玉米淀粉(淀粉用无水乙醇洗1遍，再用无菌蒸馏水洗3遍，最后用TAP+60mM山梨醇溶液洗4次，并用TAP+60mM山梨醇溶液重悬。)，吸打混匀，平铺于含有巴龙霉素(10μg/mL)的TAP固体平板上，于超净工作台中吹干液体，封口，倒置于光周期下(14h光照/10h黑暗)培养，大约7天左右可长出转化子。
二、筛选衣藻转化子获得氯化镉抗型突变体
将衣藻转化子用灭菌的牙签挑至TAgP固体平板上并进行编号，在光周期下生长3天后，再将转化子挑至含有0.6mM氯化镉的TAgP固体平板上进行筛选，野生型21gr作为对照。0.6mM氯化镉的筛选浓度由前期实验研究获得，参见专利201611022254.9。
将获得的衣藻转化子在含0.6mM氯化镉的TAgP固体平板上筛选3-4天，观察转化子的生长情况。若野生型衣藻21gr死亡时突变体能够正常生长，说明突变体具有一定抗氯化镉的能力，将对应的转化子从TAgP固体平板上挑至含0.6mM氯化镉的TAgP固体平板上进行复筛。如此反复复筛3-5次后，突变体依旧能够正常生长而21gr不能正常生长或者死亡，则说明该突变体为氯化镉抗型突变体。图2为野生型莱茵衣藻21gr和所筛选氯化镉抗型衣藻突变体cenpe1在含0.6mM氯化镉的TAgP固体平板上的生长对比图。
三、氯化镉抗型突变体的突变基因的鉴定
(1)提取氯化镉抗型突变体的基因组DNA
将上述获得的氯化镉抗型突变体cenpe1从TAgP固体平板上接种到TAP液体培养基进行吹气培养，在光周期下培养4天左右可达到生长对数期。收集衣藻细胞，采用CTAB法提取突变体衣藻的基因组DNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，Q5000超微量核酸蛋白测定仪测定所提取的DNA浓度，-20℃储存备用。
(2)突变体基因组DNA进行RESDA-PCR(Restriction enzyme site-direcedamplification PCR)扩增获得插入片段及其侧翼序列信息
根据插入片段aphⅧ的核酸序列设计特异引物F-Z2和F-Z8，根据衣藻基因组特点设计引物Q0和由Q0与AluI、PstI、SacII、TaqI限制性内切酶特异识别序列组成的简并引物DegAluI、DegPstI、DegSacII、DegTaqI。引物序列见下表所示：
| 引物名称 | 5′—3′ |
| F-Z2 | TTTTACCGGCTGTTGGAC |
| F-Z8 | AGTTCTTCTGAGGGACCTG |
| Q0 | CCAGTGAGCAGAGTGACG |
| DegAluI | CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSWCAGCTT |
| DegPstI | CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSCTGCAGW |
| DegSacII | CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSCCGCGGW |
| DegTaqI | CCAGTGAGCAGAGTGACGIIIIINNSWGTCGAA |
RESDA-PCR分为两轮扩增。第一轮扩增：以突变体基因组DNA为模板，以正向引物F-Z2和反向引物DegAluI、DegPstI、DegSacII、DegTaqI分别进行PCR扩增。第二轮扩增：将第一轮PCR产物稀释25倍后作为模板，用正向引物F-Z8和反向引物Q0进行第二轮PCR扩增。第二轮PCR结束后，将第二轮PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，切500bp以上条带送去测序。图3为氯化镉抗型突变体经RESDA-PCR后的电泳图，其中A、P、S、T分别代表含有AluI、PstI、SacII、TaqI限制性内切酶识别序列的简并引物扩增产物，M为Marker DL2000。
(3)氯化镉抗型突变体突变基因序列和插入突变位点的分析与鉴定
将测序结果与aphⅧ片段序列进行比对，得到被插入突变的基因的部分序列，在Phytozome网站上的衣藻数据库中进行序列比对，可获得突变基因的核酸序列及其编码蛋白氨基酸序列，进一步分析可获得具体插入位点。如图4所示，本发明所获得的氯化镉抗型突变体是由于aphⅧ片段正向插入到CENPE1基因的第13个内含子中而形成的突变体。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 莱茵衣藻CENPE1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5307
<212> DNA
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 1
atgaagcccg acgcagcatc agagccaatt cgggtgagcc tccgcgtccg cccgttgcgc 60
tccgatgagg ttcgcggcgg cacggcctgg gagctggacc cacaacgttg taccgtccag 120
caaaagcctg agaagtcggt gctggacgtc ttccgctcct tcggctcgtc aacggcctcc 180
gccgaccggc gccgccaagg caagtcctac cagctagacc agatattcgg accagacgtc 240
tgtaccgccc atgtatacga cacggtggtc cggcccatgg tggcgagtct ggtcaacgga 300
gtcaacgcca cggttcttgc cttcggtcag acgggcagcg gcaagacgca caccatgatg 360
gggggtagca ctggcgggcc gccatccgcg acaacagcag cagcaggcgc ggccacgacc 420
tctgctggcg atgcgggggg tagcaatggc cgccgcagcc gcaatgaaag cggcaacgag 480
gcaagcggca ccgcccctac tgaagttgga actgccgctg ccagcaacaa tcacaccacg 540
aacgcgacca acacggcggt ggtggcggcg gctgttgagc cgggtcttat tcccctggct 600
gtggctgacg tgtttgcgcg gctgcggggt atggctgcgg agcgcgacgc caccgtgacg 660
gccagctacg tcgagatcta caacgaggag attaatgact tgctcgaccc agttcgcaat 720
cgcaacatga aaatcatcag cgcgggcgac gagctagctt cctacagctc cgggcccgcc 780
gccgccggct cctctgccag cggcagcggc gccagcggca gcggctcatc gctgatgccg 840
gtgctgccgg ggctgcgcga ggtggaggtg gcggcggctg ctgacgtggc ggcgctgctg 900
gcggcgggcc aggcggcgcg gcacgtgggc gccacggcgc tgaatgagcg cagcagccgc 960
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gcagtcgccg cctcagcaag tgtcacgcca ggccgccagg gcccacaggg cccacacggc 1260
catcagggcc atcagggcgt gtttcgctcc acactggtcc tggttgacct ggcgggaagc 1320
gagtgcgcgg ccaggtcggg tgctgagggc gtgcggctca aggagagcgg cgccatcaat 1380
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ggcgcgcacg tgccgtaccg cgactccaag ctgacgcggc tgctgcagcc ggcactgggc 1500
ggcaacaccc agaccgccat catcgccacc attgcgccgg ggcccgcaca agtcagcgag 1560
agccacaaca cgctggagtt tgccacggct gcaaagcgca tcaccaaccg agtggaggtc 1620
aactcagtgc ccgccgaccc cgcggcggcg gcggcggcgc tggtggcgcg gcaggcacgg 1680
cagatcgagg agctcaagcg ccagctactg gagatcagga cttgcagcgc ccgcagcgcc 1740
accgtcagcg gcctgggggc ctccgccgcc agccccaccg ccagcggccg cctgcgccgc 1800
tcctccgcag tcgactacgg ccacggccac atacacggcg ccgccacgcc gccgccgggc 1860
ctaagcgcag gctacggccg gccacagctg cacgcgggca tggcgggctc gcgctccggc 1920
ggcgtgcggc gctcggcgga cttcagctcg gcgctgtcgg cctgcggcag ccgcctgggc 1980
gccggagcct tcgcgggcgc gctcggccct gcagcaacgg ccgcgggcga tagcgccagt 2040
gcgcctcgcg ggctgtggct ggaggagacg gcctccggca gcggctgggt agacgcacgc 2100
ggctgcttca cgccgcggtc cgccaccacg gccgacggcg gcgtcagtcc cggcggcagc 2160
agcagcgtcc tggcctcgcc cagcctgagc ttcggtgcgc ggcggcgggt gctgcggacg 2220
gaggaggggg aggcggactc gtcaccggag attgtggagc gggaggacgt ggaggagcaa 2280
agcaaagcga ccgccgctat gagcagcgcc gccgctgcca ccgcggccgc agccgcgagc 2340
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cgagaggagg cgctggcggc ggcgcgggcg cgtgtgtcct acctcgaagc ccaggcgagc 2520
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agtgtgtcgg tgcagctgtc accgatcaag tccccagtca acgggagctc tcccgtctcc 2880
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ggcgacagcg gcgccggctc gagtgtgggc agctgtgcct cgggcagcgt cagcaagcac 3060
acgtctcgcc gcaccagcgc cgcactcgac gaccaccacc accccggcca ccaccagcac 3120
cagcagcacc gcttgccgcg cctgcgtctg cctctgcccg catgcctggg cggcggcgcc 3180
gcggctgagg cgcaagccga ggcggaggcg gaggcccggg cgcgggacgc ggcggcggcg 3240
gccgagcggg tgcagcagga ggaggagcgg cagcggttgg tggtggcgct ggcgtccgta 3300
accgtggagc gcgacgtcgc gctctccgag gcagaggcgc gtggcgccga gtgtgagggg 3360
ctgcgggcgt cgctggcggc aagccgctcc gacggcgccg ccgccatttc gatggccaag 3420
gcgtctgccc aggtggaggt ggaggcggcg aggcgcacgc tggcggaggc tgaggcggcg 3480
cgggcgcagc tggaggaggc gctgcatgcg gcgcgggagg acgcggcggc ggcggcggcg 3540
gcgcaggcgg aggaagtggc ggcggccgcc gtgggggcgc agcgggcgct ggaggcacag 3600
gtggcggcgt tgacgtcgga ccggacggcg gcgaaggccg gtgccgcgga agcgctggcg 3660
gcggcggagc agaaggcagc agcgtcagtg gcggcagtgg agctgcgagc agccacgtct 3720
acggcggcgg cgcaggcggc atgcgaggcg ctggcggcgg cggagcggcg tgccggggag 3780
agggaggcgg cgctgcggcg tgatgccacg gaggcgcgcg cggcagcgga ggccgctacc 3840
gccgctgccg ctgcagccgc gctgtcagcg gcggcggagc gcgagcagct gctgacgcgg 3900
ctgctggtgg cagaggcggc atcggcgtcg gctgagtcct ctgtggtggc ggcggaggcg 3960
cgggcgcagc agctggcgca ggcgctggag gatgaagtgg agagggagcg cagcctagag 4020
gcggaggtgg gtacgggtcg gtcgggcctg gcggcggcgg aggcgatgcg tgaggacttg 4080
aagcggcagc tggaagaggc ggaggccgcc gcagctgcgg ttaaggtgag gtttgaagag 4140
gagctggcgg cggcggcggc gagggagcag cggcttacgg agcagctggc ggcagctgag 4200
gccgctgcgg tggcggctgc agagtcgttg gcagttgcga agggggccgc cgagggcgcc 4260
gctgaggccg ccgcgcagca actggcgact gcggaggcgc gctgtgcggc gctcgtgaca 4320
gaggtcagcg ggagtgcagc gaaggtggaa gagctgcaaa agcagcttgc ggcagcagca 4380
gagcaggcag cttcggcggc ggccgcagcc gctgcaacgc tggctgcacg cgaagagagc 4440
gctgcagcgg cgacgtcggc ggcggccgcg caggcggcgg agaaggagcg cgccgccgcg 4500
gccgcggcac gagcgcatgg ggaggcgctg gcgtctcgtg acgcggtgac gtccgcgctt 4560
cgggaccagc tggcggccat ggacgcggag gcgaagcggt cggcggcggc gctggaggca 4620
tcgcaggcct gggtcactga cctgcgccag cgcctggcgg cggccgaggc ggcggcggcg 4680
gccgccgcca cgcggcacga cgaggcgctg gcggcggcgg cggcccggga gaagcagcta 4740
ggtgagcggc tggcggcggt ggagcagcag cttaaggccg gcgccgccac ggtcgccgcc 4800
gccgcctctc ggctcaaggg aatggacaca gaggtcgctc gggagcgcgc ggcggcggcg 4860
cgccaggccg tgacgtcgta cgccgccgcc tctacggagg agcggcgtgc gctggaggcg 4920
gcggcgcagg tggcggcggc ggaggccggc ggcgccgccg cggaggcggc ggcgcgcgcg 4980
gaggcggcgg aggtgcggtg cggcgagctg gcggcggcgc tggcggctgc gaagggccgg 5040
gtggcggatg cagacaggga gctggcggct cgggaggcga cgctgttgga gctggcagcg 5100
gagttggaaa tcttcaagaa gaagcaggag gcggtggacg ccgacacgga ggtcttgcgc 5160
gggcagctgc ggcgccaggc ggcggacgcg gcggcggcgg cggaggcgct gcgtgagcgc 5220
gaggcggcgc tgacgcggct gcagcgggag cacatggaca atgtgctgtt cgagcagagc 5280
gccgtgcggc agcgcatgct gctgtag 5307
<210> 2
<211> 1768
<212> PRT
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 2
Met Lys Pro Asp Ala Ala Ser Glu Pro Ile Arg Val Ser Leu Arg Val
1 5 10 15
Arg Pro Leu Arg Ser Asp Glu Val Arg Gly Gly Thr Ala Trp Glu Leu
20 25 30
Asp Pro Gln Arg Cys Thr Val Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ser Val Leu
35 40 45
Asp Val Phe Arg Ser Phe Gly Ser Ser Thr Ala Ser Ala Asp Arg Arg
50 55 60
Arg Gln Gly Lys Ser Tyr Gln Leu Asp Gln Ile Phe Gly Pro Asp Val
65 70 75 80
Cys Thr Ala His Val Tyr Asp Thr Val Val Arg Pro Met Val Ala Ser
85 90 95
Leu Val Asn Gly Val Asn Ala Thr Val Leu Ala Phe Gly Gln Thr Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Thr His Thr Met Met Gly Gly Ser Thr Gly Gly Pro Pro
115 120 125
Ser Ala Thr Thr Ala Ala Ala Gly Ala Ala Thr Thr Ser Ala Gly Asp
130 135 140
Ala Gly Gly Ser Asn Gly Arg Arg Ser Arg Asn Glu Ser Gly Asn Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gly Thr Ala Pro Thr Glu Val Gly Thr Ala Ala Ala Ser Asn
165 170 175
Asn His Thr Thr Asn Ala Thr Asn Thr Ala Val Val Ala Ala Ala Val
180 185 190
Glu Pro Gly Leu Ile Pro Leu Ala Val Ala Asp Val Phe Ala Arg Leu
195 200 205
Arg Gly Met Ala Ala Glu Arg Asp Ala Thr Val Thr Ala Ser Tyr Val
210 215 220
Glu Ile Tyr Asn Glu Glu Ile Asn Asp Leu Leu Asp Pro Val Arg Asn
225 230 235 240
Arg Asn Met Lys Ile Ile Ser Ala Gly Asp Glu Leu Ala Ser Tyr Ser
245 250 255
Ser Gly Pro Ala Ala Ala Gly Ser Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Ser
260 265 270
Gly Ser Gly Ser Ser Leu Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Arg Glu Val
275 280 285
Glu Val Ala Ala Ala Ala Asp Val Ala Ala Leu Leu Ala Ala Gly Gln
290 295 300
Ala Ala Arg His Val Gly Ala Thr Ala Leu Asn Glu Arg Ser Ser Arg
305 310 315 320
Ser His Thr Val Phe Arg Leu Val Val Glu Ser Arg Pro Val Ala Val
325 330 335
Gln Arg Gln Pro Ala Asp Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Leu His Ser
340 345 350
Ala Arg Ser Ser Phe Ser Gly Ser Ala Ser Val Gly Ala Val Ala Gly
355 360 365
Gly Gly Thr Arg Ser Cys Pro Ala Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Ser
370 375 380
Ala Glu Pro Gln Pro Pro Pro Ser Pro Ser Leu Thr Ala Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Val Ala Ala Ser Ala Ser Val Thr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Gln
405 410 415
Gly Pro His Gly His Gln Gly His Gln Gly Val Phe Arg Ser Thr Leu
420 425 430
Val Leu Val Asp Leu Ala Gly Ser Glu Cys Ala Ala Arg Ser Gly Ala
435 440 445
Glu Gly Val Arg Leu Lys Glu Ser Gly Ala Ile Asn Lys Ser Leu Leu
450 455 460
Thr Leu Arg Asn Val Val Ala Lys Leu Ala Glu Gly Ala Ala Glu Ser
465 470 475 480
Gly Ala His Val Pro Tyr Arg Asp Ser Lys Leu Thr Arg Leu Leu Gln
485 490 495
Pro Ala Leu Gly Gly Asn Thr Gln Thr Ala Ile Ile Ala Thr Ile Ala
500 505 510
Pro Gly Pro Ala Gln Val Ser Glu Ser His Asn Thr Leu Glu Phe Ala
515 520 525
Thr Ala Ala Lys Arg Ile Thr Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Val Pro
530 535 540
Ala Asp Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Val Ala Arg Gln Ala Arg
545 550 555 560
Gln Ile Glu Glu Leu Lys Arg Gln Leu Leu Glu Ile Arg Thr Cys Ser
565 570 575
Ala Arg Ser Ala Thr Val Ser Gly Leu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Pro
580 585 590
Thr Ala Ser Gly Arg Leu Arg Arg Ser Ser Ala Val Asp Tyr Gly His
595 600 605
Gly His Ile His Gly Ala Ala Thr Pro Pro Pro Gly Leu Ser Ala Gly
610 615 620
Tyr Gly Arg Pro Gln Leu His Ala Gly Met Ala Gly Ser Arg Ser Gly
625 630 635 640
Gly Val Arg Arg Ser Ala Asp Phe Ser Ser Ala Leu Ser Ala Cys Gly
645 650 655
Ser Arg Leu Gly Ala Gly Ala Phe Ala Gly Ala Leu Gly Pro Ala Ala
660 665 670
Thr Ala Ala Gly Asp Ser Ala Ser Ala Pro Arg Gly Leu Trp Leu Glu
675 680 685
Glu Thr Ala Ser Gly Ser Gly Trp Val Asp Ala Arg Gly Cys Phe Thr
690 695 700
Pro Arg Ser Ala Thr Thr Ala Asp Gly Gly Val Ser Pro Gly Gly Ser
705 710 715 720
Ser Ser Val Leu Ala Ser Pro Ser Leu Ser Phe Gly Ala Arg Arg Arg
725 730 735
Val Leu Arg Thr Glu Glu Gly Glu Ala Asp Ser Ser Pro Glu Ile Val
740 745 750
Glu Arg Glu Asp Val Glu Glu Gln Ser Lys Ala Thr Ala Ala Met Ser
755 760 765
Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ser Lys Leu Arg Glu
770 775 780
Ile Ala Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ala Arg Arg Glu Arg Glu Gln Gln
785 790 795 800
Gln Glu Leu Leu Arg Gln Gln Arg Glu Ala Arg Ala Ala Leu Glu Ala
805 810 815
Glu Lys Val Glu Arg Glu Glu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Ala Arg Val
820 825 830
Ser Tyr Leu Glu Ala Gln Ala Ser Ala His Cys Leu Glu Leu Gln Gln
835 840 845
Val Arg Ser Glu Cys Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Thr Ala
850 855 860
Ala Thr Lys Tyr Lys Ala Glu Gln Ile Thr Ala Ala Gln Glu Ala Ala
865 870 875 880
Val His Leu Ala Ala Val Glu Ala Ala Ala Gln Glu Ala Ala Thr Ala
885 890 895
Ala Ala Ala Arg Glu Ser Ala Leu Arg Glu Ala Leu Ala Ala Ala Gln
900 905 910
Ala Thr Ser Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gln Ala Arg Leu Glu
915 920 925
Leu Arg Ala Arg Glu Ser Ser Ala Gly Ala Pro Ala Ser Val Ser Val
930 935 940
Gln Leu Ser Pro Ile Lys Ser Pro Val Asn Gly Ser Ser Pro Val Ser
945 950 955 960
Lys Arg Asn Leu Phe Gly Arg Trp Gln Thr Asp Pro Val Pro Val Leu
965 970 975
Gly Ser Pro Pro Gly Gly Val Gln Pro Gly Ser Ala Arg Ala Leu Gly
980 985 990
Gly Asp Ser Ala Gly Gly Val Ser Gly Asp Ser Gly Ala Gly Ser Ser
995 1000 1005
Val Gly Ser Cys Ala Ser Gly Ser Val Ser Lys His Thr Ser Arg Arg
1010 1015 1020
Thr Ser Ala Ala Leu Asp Asp His His His Pro Gly His His Gln His
1025 1030 1035 1040
Gln Gln His Arg Leu Pro Arg Leu Arg Leu Pro Leu Pro Ala Cys Leu
1045 1050 1055
Gly Gly Gly Ala Ala Ala Glu Ala Gln Ala Glu Ala Glu Ala Glu Ala
1060 1065 1070
Arg Ala Arg Asp Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Val Gln Gln Glu Glu
1075 1080 1085
Glu Arg Gln Arg Leu Val Val Ala Leu Ala Ser Val Thr Val Glu Arg
1090 1095 1100
Asp Val Ala Leu Ser Glu Ala Glu Ala Arg Gly Ala Glu Cys Glu Gly
1105 1110 1115 1120
Leu Arg Ala Ser Leu Ala Ala Ser Arg Ser Asp Gly Ala Ala Ala Ile
1125 1130 1135
Ser Met Ala Lys Ala Ser Ala Gln Val Glu Val Glu Ala Ala Arg Arg
1140 1145 1150
Thr Leu Ala Glu Ala Glu Ala Ala Arg Ala Gln Leu Glu Glu Ala Leu
1155 1160 1165
His Ala Ala Arg Glu Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Ala Glu
1170 1175 1180
Glu Val Ala Ala Ala Ala Val Gly Ala Gln Arg Ala Leu Glu Ala Gln
1185 1190 1195 1200
Val Ala Ala Leu Thr Ser Asp Arg Thr Ala Ala Lys Ala Gly Ala Ala
1205 1210 1215
Glu Ala Leu Ala Ala Ala Glu Gln Lys Ala Ala Ala Ser Val Ala Ala
1220 1225 1230
Val Glu Leu Arg Ala Ala Thr Ser Thr Ala Ala Ala Gln Ala Ala Cys
1235 1240 1245
Glu Ala Leu Ala Ala Ala Glu Arg Arg Ala Gly Glu Arg Glu Ala Ala
1250 1255 1260
Leu Arg Arg Asp Ala Thr Glu Ala Arg Ala Ala Ala Glu Ala Ala Thr
1265 1270 1275 1280
Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala Glu Arg Glu Gln
1285 1290 1295
Leu Leu Thr Arg Leu Leu Val Ala Glu Ala Ala Ser Ala Ser Ala Glu
1300 1305 1310
Ser Ser Val Val Ala Ala Glu Ala Arg Ala Gln Gln Leu Ala Gln Ala
1315 1320 1325
Leu Glu Asp Glu Val Glu Arg Glu Arg Ser Leu Glu Ala Glu Val Gly
1330 1335 1340
Thr Gly Arg Ser Gly Leu Ala Ala Ala Glu Ala Met Arg Glu Asp Leu
1345 1350 1355 1360
Lys Arg Gln Leu Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Val Lys Val
1365 1370 1375
Arg Phe Glu Glu Glu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu Gln Arg Leu
1380 1385 1390
Thr Glu Gln Leu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Glu
1395 1400 1405
Ser Leu Ala Val Ala Lys Gly Ala Ala Glu Gly Ala Ala Glu Ala Ala
1410 1415 1420
Ala Gln Gln Leu Ala Thr Ala Glu Ala Arg Cys Ala Ala Leu Val Thr
1425 1430 1435 1440
Glu Val Ser Gly Ser Ala Ala Lys Val Glu Glu Leu Gln Lys Gln Leu
1445 1450 1455
Ala Ala Ala Ala Glu Gln Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1460 1465 1470
Thr Leu Ala Ala Arg Glu Glu Ser Ala Ala Ala Ala Thr Ser Ala Ala
1475 1480 1485
Ala Ala Gln Ala Ala Glu Lys Glu Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg
1490 1495 1500
Ala His Gly Glu Ala Leu Ala Ser Arg Asp Ala Val Thr Ser Ala Leu
1505 1510 1515 1520
Arg Asp Gln Leu Ala Ala Met Asp Ala Glu Ala Lys Arg Ser Ala Ala
1525 1530 1535
Ala Leu Glu Ala Ser Gln Ala Trp Val Thr Asp Leu Arg Gln Arg Leu
1540 1545 1550
Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Arg His Asp Glu
1555 1560 1565
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu Lys Gln Leu Gly Glu Arg Leu
1570 1575 1580
Ala Ala Val Glu Gln Gln Leu Lys Ala Gly Ala Ala Thr Val Ala Ala
1585 1590 1595 1600
Ala Ala Ser Arg Leu Lys Gly Met Asp Thr Glu Val Ala Arg Glu Arg
1605 1610 1615
Ala Ala Ala Ala Arg Gln Ala Val Thr Ser Tyr Ala Ala Ala Ser Thr
1620 1625 1630
Glu Glu Arg Arg Ala Leu Glu Ala Ala Ala Gln Val Ala Ala Ala Glu
1635 1640 1645
Ala Gly Gly Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala Glu Ala Ala Glu
1650 1655 1660
Val Arg Cys Gly Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Lys Gly Arg
1665 1670 1675 1680
Val Ala Asp Ala Asp Arg Glu Leu Ala Ala Arg Glu Ala Thr Leu Leu
1685 1690 1695
Glu Leu Ala Ala Glu Leu Glu Ile Phe Lys Lys Lys Gln Glu Ala Val
1700 1705 1710
Asp Ala Asp Thr Glu Val Leu Arg Gly Gln Leu Arg Arg Gln Ala Ala
1715 1720 1725
Asp Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Leu Arg Glu Arg Glu Ala Ala Leu
1730 1735 1740
Thr Arg Leu Gln Arg Glu His Met Asp Asn Val Leu Phe Glu Gln Ser
1745 1750 1755 1760
Ala Val Arg Gln Arg Met Leu Leu
1765
<210> 3
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aattcgatct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 60
aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 120
atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 180
tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct ccaccgcggt 240
ggcggccgct ctagaactag tggatccact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg 300
cggccgctct agagacggcg gggagctcgc tgaggcttga catgattggt gcgtatgttt 360
gtatgaagct acaggactga tttggcgggc tatgagggcg cgggaagctc tggaagggcc 420
gcgatggggc gcgcggcgtc cagaaggcgc catacggccc gctggcggca cccatccggt 480
ataaaagccc gcgaccccga acggtgacct ccactttcag cgacaaacga gcacttatac 540
atacgcgact attctgccgc tatacataac cactcagcta gcttaagatc ccatcaagct 600
tgcatgccgg gcgcgccaga aggagcgcag ccaaaccagg atgatgtttg atggggtatt 660
tgagcacttg caacccttat ccggaagccc cctggcccac aaaggctagg cgccaatgca 720
agcagttcgc atgcagcccc tggagcggtg ccctcctgat aaaccggcca gggggcctat 780
gttctttact tttttacaag agaagtcact caacatctta aaatggccag gtgagtcgac 840
gagcaagccc ggcggatcag gcagcgtgct tgcagatttg acttgcaacg cccgcattgt 900
gtcgacgaag gcttttggct cctctgtcgc tgtctcaagc agcatctaac cctgcgtcgc 960
cgtttccatt tgcaggatgg ccactccgcc ctccccggtg ctgaagaatt tcgaagcatg 1020
gacgatgcgt tgcgtgcact gcggggtcgg tatcccggtt gtgagtgggt tgttgtggag 1080
gatggggcct cgggggctgg tgtttatcgg cttcggggtg gtgggcggga gttgtttgtc 1140
aaggtggcag ctctgggggc cggggtgggc ttgttgggtg aggctgagcg gctggtgtgg 1200
ttggcggagg tggggattcc cgtacctcgt gttgtggagg gtggtgggga cgagagggtc 1260
gcctggttgg tcaccgaagc ggttccgggg cgtccggcca gtgcgcggtg gccgcgggag 1320
cagcggctgg acgtggcggt ggcgctcgcg gggctcgctc gttcgctgca cgcgctggac 1380
tgggagcggt gtccgttcga tcgcagtctc gcggtgacgg tgccgcaggc ggcccgtgct 1440
gtcgctgaag ggagcgtcga cttggaggat ctggacgagg agcggaaggg gtggtcgggg 1500
gagcggcttc tcgccgagct ggagcggact cggcctgcgg acgaggatct ggcggtttgc 1560
cacggtcacc tgtgcccgga caacgtgctg ctcgaccctc gtacctgcga ggtgaccggg 1620
ctgatcgacg tggggcgggt cggccgtgcg gaccggcact ccgatctcgc gctggtgctg 1680
cgcgagctgg cccacgagga ggacccgtgg ttcgggccgg agtgttccgc ggcgttcctg 1740
cgggagtacg ggcgcgggtg ggatggggcg gtatcggagg aaaagctggc gttttaccgg 1800
ctgttggacg agttcttctg agggacctga tggtgttggt ggctgggtag ggttgcgtcg 1860
cgtgggtgac agcacagtgt ggacgttggg atccccgctc cgtgtaaatg gaggcgctcg 1920
ttgatctgag ccttgccccc tgacgaacgg cggtggatgg aagatactgc tctcaagtgc 1980
tgaagcggta gcttagctcc ccgtttcgtg ctgatcagtc tttttcaaca cgtaaaaagc 2040
ggaggagttt tgcaattttg ttggttgtaa cgatcctccg ttgattttgg cctctttctc 2100
catgggcggg ctggaatt 2118
Claims (10)
1.莱茵衣藻CENPE1基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述CENPE1基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：
（1）包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
（2）包含编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列；
（3）包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述CENPE1基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：
（1）包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；
（2）包含由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。
3.莱茵衣藻CENPE1基因在提高莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻CENPE1基因的表达、使CENPE1基因失活或缺失CENPE1基因提高莱茵衣藻镉耐受性。
4.一种提高莱茵衣藻镉耐受性的方法，其特征在于：通过降低莱茵衣藻CENPE1基因的表达、使CENPE1基因失活或缺失CENPE1基因提高莱茵衣藻镉耐受性。
5.一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株，其特征在于：所述镉耐受性增强藻株为不含CENPE1基因活性的CENPE1基因突变株或CENPE1基因缺失株，或CENPE1基因表达下降的CENPE1基因表达缺陷株。
6.一种莱茵衣藻镉耐受性增强藻株的获得方法，其特征在于：为下述方法中的一种：
通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻CENPE1基因突变株；
通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻CENPE1基因缺失株；
通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻CENPE1基因表达缺陷株。
7.权利要求5所述的莱茵衣藻镉耐受性增强藻株在镉污染的监测或检测中的应用。
8.权利要求5所述的莱茵衣藻镉耐受性增强藻株在镉污染的治理中的应用。
9.莱茵衣藻CENPE1基因在镉污染的监测或检测中的应用。
10.莱茵衣藻CENPE1基因在镉污染的治理中的应用。
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| ALEXANDRA ROSAKIS ET AL.: "Transition metal transport in the green microalga Chlamydomonas reinhardtii—genomic sequence analysis", 《RESEARCH IN MICROBIOLOGY》 * |
| C.M. HUTCHINS ET AL.: "Transcriptomic signatures in Chlamydomonas reinhardtii as Cd biomarkers in metal mixtures", 《AQUATIC TOXICOLOGY》 * |
| 孔祥雪 等: "微藻去除重金属镉的抗性机理研究进展", 《微生物学通报》 * |
| 张娟: "《生物科学知识》", 31 October 2008 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112626092A (zh) * | 2019-09-24 | 2021-04-09 | 清华大学 | Nat基因作为筛选标记在衣藻遗传转化中的应用 |
| CN113549554A (zh) * | 2021-02-26 | 2021-10-26 | 武汉科技大学 | 一株莱茵衣藻耐镉突变体、固定化材料及其制备方法与应用 |
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