CN107760695A - 莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段（SEQ ID NO:3）随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到Cre03.g157400.t1.2基因（CDS序列如SEQ ID NO:1所示）中造成的。通过降低莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因的表达、使该基因失活或缺失该基因能够降低莱茵衣藻的镉耐受性；通过基因工程手段获得的镉敏感型莱茵衣藻藻株可应用于镉污染水域的监控与检测中。本发明为污水的监控与检测提供了新的方向。

Description

莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性 中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域和环境污水治理领域，具体涉及莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。

背景技术

随着现代工业化的不断提高，环境污染已经成为全球化的问题，由于一些工厂的不合理开发和工业的不合理发展导致了一系列的环境污染问题，其中污染最严重的是水体和大气。重金属镉的污染就是其中的一种主要工业污染，无论工业废气和废水，还是汽车尾气等里面都含有大量的镉，随着工业废水废气和汽车尾气的不断排放，又因为水体和大气都具有流动性，使重金属污染在水体、土壤、大气中不断的积累，最后生态环境遭到破坏，人类的生存和发展受到威胁。目前重金属镉的污染已经越来越严重，如何科学地进行重金属镉的污染治理和回收已经成为了科学研究中的重点和热点问题。

目前，对重金属污染的治理主要有物理化学法和生物法。相比较而言，传统的物理化学法往往成本较高、操作复杂的特点，更适合集中处理高浓度的重金属污染区域。而相对来说大流域、低浓度的重金属污染治理来说生物法则具有更多的优势。能够吸附和代谢重金属的微生物种类主要包括一些工程细菌、真菌和藻类等。相对于工程细菌和真菌容易造成二次污染来说，藻类是进行重金属污水治理和回收的一种理想材料。

莱茵衣藻是一种单细胞的真核生物，能够进行光合作用，又被称为“绿色酵母”。莱茵衣藻基因组测序工作已经完成，有利于进一步研究重金属镉的代谢调控网络。同时莱茵衣藻遗传转化体系较为成熟，易获得突变体，并且衣藻细胞易培养，生长繁殖快，是一种重要的研究模式生物。本发明中通过获得的氯化镉敏感突变藻株，进一步鉴定得到了与重金属镉调控相关的基因Cre03.g157400.t1.2及其编码蛋白，可应用于镉污染水域的监控与治理中，同时进一步研究Cre03.g157400.t1.2基因在衣藻重金属镉代谢调控中的作用，能够为生物法重金属镉的治理奠定理论基础。

发明内容

本发明的首要目的在于提供莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。基于Cre03.g157400.t1.2基因调控莱茵衣藻镉耐受性的功能，本发明的目的还在于提供莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，提供莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法以及镉敏感型藻株的应用等。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明通过将含巴龙霉素抗性基因的aphⅧ片段随机插入衣藻中得到了对镉显著敏感的莱茵衣藻突变藻株，进一步鉴定发现突变藻株的镉敏感性是由于aphⅧ片段插入到Cre03.g157400.t1.2基因第13个内含子中造成的，该基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。

基于上述发现，本发明的目的之一是提供莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用。

所述Cre03.g157400.t1.2基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：

(1)包含如SEQ ID NO:1所示5232bp的核苷酸序列；

(2)包含编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列；

(3)包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

所述Cre03.g157400.t1.2基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：

(1)包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；

(2)包含由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。

本发明的目的之二是提供上述莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用。通过降低莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因的表达、使Cre03.g157400.t1.2基因失活或缺失Cre03.g157400.t1.2基因进而降低莱茵衣藻对镉的耐受性。

本发明的目的之三是提供利用上述莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因降低莱茵衣藻镉耐受性的方法。所述方法为通过降低莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因的表达、使Cre03.g157400.t1.2基因失活或缺失Cre03.g157400.t1.2基因来降低莱茵衣藻对镉的耐受性。

本发明的目的之四是提供一种莱茵衣藻镉敏感型藻株。所述镉敏感型藻株为不含Cre03.g157400.t1.2基因活性的Cre03.g157400.t1.2基因突变株或Cre03.g157400.t1.2基因缺失株，或Cre03.g157400.t1.2基因表达下降的Cre03.g157400.t1.2基因表达缺陷株。

本发明的目的之五是提供一种莱茵衣藻敏感型藻株的获得方法。所述获得方法包括：通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因突变株，通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因缺失株，通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因表达缺陷株。

本发明的目的之六是提供上述莱茵衣藻镉敏感型藻株在重金属镉污染的监测与检测中的应用。根据莱茵衣藻的Cre03.g157400.t1.2基因表达缺陷株、Cre03.g157400.t1.2基因突变株或Cre03.g157400.t1.2基因缺失株对重金属镉的敏感性，只能在较低浓度的含重金属镉的环境中生长的特性，其可应用于镉污染的监测和检测中，尤其可应用于污水中镉的监测和检测中，如所述莱茵衣藻镉敏感型藻株可以监测环境水体中的镉含量是否超标，方便检测环境中镉污染程度并起到预防或者改善环境镉污染。所述莱茵衣藻镉敏感型藻株应用于监控或者检测环境水体中重金属镉污染的状况，为水体中重金属镉的检测、以及生物法处理污水提供一种新的思路与新的材料。同时，研究Cre03.g157400.t1.2基因在衣藻重金属镉代谢调控网络中的作用机制，可进一步为生物法治理污水提供理论基础。

本发明的有益效果是：

(1)本发明发现的Cre03.g157400.t1.2基因及其编码蛋白，是一种新的与重金属镉调控相关的基因及蛋白，未见相关报道。

(2)本发明采用的获得重金属镉敏感突变藻株的方法简单、技术体系成熟，可进一步改进和应用到其他的藻类或模式植物中。

(3)本发明中Cre03.g157400.t1.2基因因插入突变形成的重金属镉敏感型突变体与野生型衣藻相比，具有显著的重金属镉敏感的特性，能够进一步用于研究Cre03.g157400.t1.2基因在镉吸附和代谢调控中的作用机制。

(4)藻类是研究生物法治理重金属水体污染的重要模式生物，本发明中获得的Cre03.g157400.t1.2基因突变体(HM3)表现出了显著的重金属镉敏感特性，可应用到镉污染水域的监控与检测中，为含镉污水的检测提供新生物材料和新的方向。

附图说明

图1为pJMG-aphⅧ质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳图。

图2为野生型莱茵衣藻21gr和氯化镉敏感型突变藻株(HM3)在含0.4mM氯化镉的固体平板上的生长对比图。

图3为氯化镉敏感型突变藻株(HM3)经RESDA-PCR后琼脂糖凝胶电泳图。

图4为氯化镉敏感型突变藻株(HM3)中Cre03.g157400.t1.2基因插入突变位点示意图。

具体实施方式

为了让该领域或者相关人员能够更好的了解这个发明，下面结合以下几个实施例进行说明，这些方法只是为了更好的阐述该发明，并不限制本发明。以下实施例中，没有特殊说明的均为常规方法。

下述实施例中所用培养基配方如下：

TAP培养基配方：Tris 1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、SolutionⅡ(磷酸盐)0.188mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。固体培养基则加入7.5g Agar(琼脂)。

TAgP培养基配方：Tris 1.21g、SolutionI(盐溶液)12.5mL、甘油磷酸钠(1M)0.376mL、SolutionIII(微量元素)0.5mL、GAA(冰醋酸)0.5mL，按顺序加各组分，定容至500mL即可。若要配制固体培养基则加入7.5g Agar(琼脂)。

实施例1：莱茵衣藻重金属镉敏感型突变藻珠的筛选

(1)目的片段的准备

首先提取PJMG-aphⅧ质粒(Zhangfeng Hu,Yinwen Liang,Wei He,Junmin Pan^*,Cilia Disassembly with Two Distinct Phases of Regulation,Cell Reports,2015,10(11):1803-1810)(含有aphⅧ片段)，然后用EcoRⅠ和cutsmart Buffer酶切，将酶切产物琼脂糖凝胶电泳，将目的片段切胶回收，如图1所示，M为DL2000DNA Marker，1为酶切产物，箭头所指的条带为需要回收的目的片段aphⅧ(序列SEQ ID NO:3所示)。胶回收主要采用生工公司胶回收试剂盒(货号为B518191-0100)，按照胶条的重量，加入胶条重量3-6倍的BufferB2，用20μL的Elution Buffer洗脱DNA片段，使终浓度在10ng/μL左右。

(2)衣藻感受态细胞的准备

将莱茵衣藻21gr转接到新鲜的TAP固体培养基上活化，大约3天左右，转接到TAP液体中吹气培养，连续光照(24h光照)使细胞浓度长到1×10⁷细胞/mL。转接至含100mL TAP液体培养基的三角瓶中使初始浓度为1×10⁶细胞/mL，在连续光照条件下摇床上培养20h左右，使衣藻细胞浓度达到5×10⁶细胞/mL时立即进行感受态细胞的制备。

(3)电击转化法获得衣藻转化子

将预先准备好的插入片段(aphⅧ)加入装有250μL浓度1×10⁸细胞/mL的感受态细胞的电击杯中，冰上放置10min，电击仪电击(型号BTX ECM630，电击参数：电压800V、电阻1575Ω、电容50μF)，冰上再放10min让DNA充分进入感受态细胞中，最后转入装有10mL TAP+60mM山梨醇(含60mM山梨醇的TAP液体培养基)的50mL离心管中过夜修复(锡箔纸包住，摇床上100r/min慢摇过夜)，次日涂布含巴龙霉素10μg/mL的平板，通常一个转化子可以涂2-3个平板，封口膜密封，光周期(14h光照/10h黑暗)下倒置培养。

(4)重金属镉敏感型突变藻株的筛选

待转化子长好后，将单克隆的藻株挑到TAP固体培养基上，并进行编号。生长3-4天至突变体藻株活力最佳，再转接到0.4mM氯化镉的固体平板上，每天观察并记录野生型和突变体的生长状况。若在野生型衣藻能够正常生长的情况下，突变体藻株生长受到抑制或者逐渐死亡，则初步认定为镉敏感型突变藻株。重复筛选3-4次，结果一致则可判定该突变藻株为重金属镉敏感型突变藻株。如图2所示，野生型衣藻21gr能够在0.4mM氯化镉的固体平板上正常进行生长，而所筛选的突变体HM3则生长显著受到抑制，说明HM3突变藻株具有显著的镉敏感特性，属于重金属镉敏感型突变体。

实施例2：莱茵衣藻重金属镉敏感突变藻株突变基因的鉴定

(1)突变体基因组DNA的提取

a：将上述筛选到的镉敏感型突变体HM3，用枪头接到液体培养基中，待细胞长到对数期，收集细胞到1.5mL的EP管中，室温14000rpm离心1min，弃上清，将沉淀用液氮冷冻，-80℃保存备用。

b：将上述收集的细胞用液氮取出，加入700μL预热的CTAB裂解液，放在65℃的水浴锅里水浴一个小时左右，其间多次颠倒混匀，使细胞充分裂解。

c：待细胞充分裂解后，向该EP管中加入700μL苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1的混合溶液，摇晃EP管，充分混合均匀，14000rpm离心10min。

d：离心完后，将上清吸到新的EP管中，再加入等体积氯仿：异戊醇＝24：1的混合溶液，上下颠倒EP管，14000rpm离心10min。

e：取离心后的上清到另一个新的EP管中，然后加入四分之三体积的异丙醇，轻轻地颠倒几次，于-20℃中放置15-20min，直到有絮状物出现。

f：将上述的EP管取出，14000rpm离心10min，弃上清，用70％的乙醇洗涤沉淀，大约3-5次，每次14000rpm离心5min。

g：最后用50μL的ddH₂O溶解DNA。

(2)RESDA-PCR

根据插入片段aphⅧ的核酸序列设计特异引物F-Z2和F-Z8，根据衣藻基因组特点设计引物Q0和由Q0与AluI、PstI、SacII、TaqI限制性内切酶特异识别序列组成的简并引物DegAluI、DegPstI、DegSacII、DegTaqI。以提取的敏感型突变体藻株(HM3)的基因组DNA做模板，进行RESDA-PCR，得到四种PCR产物，如图3所示，M为DL2000DNA Marker，A、P、S、T分别代表包含AluI、PstI、SacII、TaqI限制性内切酶的扩增产物。将500bp以上条带的胶块切割下来送测序。RESDA-PCR中所用引物见下表所示：

(3)分析镉敏感型突变藻株HM3的插入突变基因及插入突变位点

将测序结果与aphⅧ片段序列进行比对，得到插入片段aphⅧ的部分序列及其侧翼序列，在Phytozome网站上的衣藻数据库中进行序列比对，可获得插入突变基因的核酸序列及编码蛋白的氨基酸序列，进一步分析可获得具体插入突变位点。如图4所示，本发明所获得的氯化镉敏感型突变体是由于aphⅧ片段反向插入到Cre03.g157400.t1.2基因的第13个内含子中而形成的突变体。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 江汉大学

<120> 莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5232

<212> DNA

<213> Chlamydomonas reinhardti

<400> 1

atggccgcaa atgtcgcacg ggcacgtggc gcgccacggc ggaatccctt ccgccgcatc 60

cagcaccaga agaagcagaa gcacctccag aagtcttaca gccagtacaa cctgtcccac 120

cttgatagtt ctgcgggtga aagctcaagc agcaagaagc gcaagcactt gggtggtgtg 180

tatgggctgc tggcacgcca catcgacgtg ccccagcacc tgatggacaa ggcacaggag 240

atggcggagg gccgcccgcc gaccttcttc agcaggcgct cgctgctggg cctgcccatg 300

ctgcacccct actcgcgcgt gtcggtggcg tggcgtgccg ccatgttggt gttcgatctc 360

acgttcaccg ccttctgggt ccccctcaac atcggcttct gttacagcaa ttacggcaac 420

ctggcggcgc cgtgcacgca gtcggacctg gcgggaggca ttgtgtacgt gtccaactgg 480

ctcatgggct tcctcatggg cgctgtgctc agcaacggct ccaagcgggc cgtgtgtgtg 540

gacgggcggc tggtcacgta cgcctatgtg gcgtacggca agttcgcgat ggacctgctg 600

gccagcattc ccttcttcgt gctggtgggg accatcgcca gcggcggtgg gagcggcgag 660

acgcggctgc tgagcctgct gagcctgctg cggctggtgc gcatgctgcg gctggtcaac 720

acagtcaagg ttgtgtacca ggactcgctg tcggggcact accgcatgtc gttcatcacc 780

cgcaccgtat cggtgtcagc catgtacctg ctgctgctgg ggttccagtt tgcggtggtg 840

gtcaacatgt gcgccagcct catgatcatg ctggcggcct tctacggcta cgagaacacc 900

tggcaggaca gcctgggctg gtggtggggc agctgggaag acctgcaacc agtggggctg 960

tggtacaatg cagtgtactg ggtcatcacc gcgctgacca ccacgggcgc cggccaggct 1020

ccgcgtcagg ctggcgagca ggtggtttcc aacttctgct ccgtgtacgg catggtgttc 1080

aacggtctgg tggttggcgt ggtgggccgc gcgctcatgc aggccacggg cgacgccagc 1140

aacctgtacc tgagccgcaa gaaggtgggg ctggtgtcca gctgggccga cacgcgccac 1200

ctgccgccca gcgtcaagaa ggagctgcag gtgtactttg ctgacagcga gttggcgcgc 1260

ggcgagttcg gcttcgaggc gggtgtgatc gagggcctgc ccaccaccct gcggcggcag 1320

gtggtggcgt acgtggtgcg gccgctggtg gacaaggtgc acatcctgtc cgccgccgag 1380

cacgagttgc gcgacctcat cgccaccatg ttcagaccgc tggacgtgcc gccgggccac 1440

gacctgtgcc gccagggcca cctggccgat cggctgtggc tggtggagtg gggcacggtg 1500

gtggcgctgc ggcacaagga gcaggaggcg caccccacca ccggcatgac gtgcctgctg 1560

ggcgagggcg tgctgctgcg cggggtgatg gacgtggcgg cggtgcggcc gtggacgctg 1620

cgcaccagca gcgcctgtcg cctgtgggag ctggcgtggg aggacctgga gccgctgctg 1680

cgcgtgtacc cgcgcctgca gagcatcgcg ttgcagtaca tcaaggaccg cctcatccgg 1740

gcgctggacg gcatcccgca gcgcgacacg gcctggtgtg agctggtggc tgtgctgagc 1800

cgcatcctca agcagcccgc gcagctggac caggcccgag acaacctgga ggcgctggag 1860

cagtctcgtg aggaggacgg ctcgctgccg gcgctgctga gcagctggct ggaggcgggc 1920

atcagcacca ccctggagct gggggccaca ggggcgcaga agaggggcct ggtcaccatg 1980

tccatcatgt tggcccgcca gtccaaggac gcgctggggg caccttcgac cgccctgtca 2040

gggccctacc cgccctacgc caaccacccg ctcggtgccc cctccctggc gctgctaccc 2100

cgctacggcg gcggcggcgg cggcccgggc ggcggcgggt tccgccgtgg cggcaccggc 2160

gccagcggcc tggcggccca gtcggtcggc ttgggcatgc tgctgccggg cggcaccacc 2220

gccgcaacgc tgcagcggga gcccagtgca ggcgcgcccg ggcttactgg gtttggcggc 2280

ggcatgggta gtgggagcgg tctgggggcg tcgagcgtgg agcttcccac accggtcgag 2340

gccgagggcg aggaggatgt gcacgcaccg gtgcaggcgc agcggctgtg gcagggtaag 2400

tccgaggccg ctagctctcc agcatccaca gcagccgcac gcggtcatgg cggcgcccgc 2460

cgctcgcggt ccttcacgtc ctgcagcgca cacgccagcg gcacgccgac gccgccgtcg 2520

cgaggatcgc agccgccgcc gggtggcttg ccgtcgtcgc ccatgcagat agcgctgtcg 2580

tcggcgctgc tgcagccgtc gcggccgccg ccgacgccct cgcgtctggc catcagctcg 2640

cgccagcacc actcgcacaa cctcctaggc agcgaggcca ccggcggcga cacggaaacg 2700

ggcgcggcgg cgcgggctgg aggtgcagcc gccgtggctg ctggtggcgc caggccaggc 2760

cgacctggac cagcagacag ctacgcgcgt agccctctgg gcggcaggcc cccgccgcga 2820

cggtcgttct ctgaggacgg cgcggcggac gcggcgcgcg cgcgcgtggc ggcagcagcc 2880

gcgtcaggag ccactgcctc ggctgctgca gctgacgaga cagtggaaca ggcgcgagct 2940

gagtttcggc cgcctctgca ggcaccgcag ccgccgcagt cgccgcagct gccgtcgcaa 3000

aggtcacctt tcctctccca ccccgatgag gcagcgcgcc tggacagcgc cggcagcggc 3060

agccgccgcg gcgggccgcc gtcttgggtg ttgaatccaa tggctgaagg ggagccgcta 3120

cccctggggg aagtggaggg agatgcagaa gcgctggtgc tggcaacggc gacgccagag 3180

gggctggggc tggcgacggt gacgccagag gcgctggggc tggccgcgga cgtggccgct 3240

tctgcagcgg cggcggaggc gcagcgttca caggcggggc agggcatggc catgtcaccg 3300

gcggcgtcga cgtcggggat ggaagggacg gtcagcacag cgccggacag tccacagcgc 3360

agcgagccgg aggagcgcct gtctgtcatc gcgcacacca gccgagcgtt tggtgtggta 3420

gacgccggcg gcgtgccgct agtgggagcc gcgccggcgg cggcgccgca gcacgcaagg 3480

cctccgcggg tgccctccgt cggcaccatc ggggcgccgc tggcggcggg tcagcagtcc 3540

cagtcacgta tcggggggcc tcgccgcaca gtgacggagg cctcactgac ctcaccacga 3600

cggcagcagc cgacggcccc ctcctggcat ccggcggcgg cggcggcacc agcacccgct 3660

ctcagccgcg ccgactcttt tacagccggc gcgccgccgg cgcttgccca cgccgcaggc 3720

ggcgcccggt caggccacgt gcgattcttt cgctcgttca gcctcgcagc cggcaacccg 3780

ggcatcgcgg ctgtcagcgt cggagcagct gccgccgatg ccgacagcag ccatcttatg 3840

gaccggctgc gggcggcgag ggagcgggcc aacagcctca gccgccgccg ggtgcactct 3900

gcggagttag ctcctgggga cctgttgagc caggcggacc aggcagcggc ccccagccgg 3960

gagctcaacc gcagcaccgg agacggcgcg gacggcgccg atggcgccgg catcgtcgtc 4020

agaggcggcg ggggcgatga cgatgactgc gaacgtggcg acgcaccgcc gtactaccgc 4080

acgggcacgg ggatcagcag cgtcagcggc atggcggaga gcgccgccgc cgccgcggcg 4140

gcggcggacc ggcctgatgg cctggtcccc agtgcgtctg gccgcagtgt gcgactggcg 4200

acggcgccgc tgccgggccg cgtgtcggcg ctgctggcgc gcagcggcac gccgccgcgg 4260

gcgccgtcga gctcaggcgt cagcggtgtt agttatggtg gtggtagcgg cgggttgctt 4320

ggcaaaagcg gcggtggcct cgtgtcgccg cggtcgcgat caccaggccc gggagacgcc 4380

ggcccgggca gcggcgttgg ggcgcctgtc actgctgtgg cggctggcgc tagcgtggcg 4440

gcagcggcag caaacgctgc aggtggcggc ggcggctgca cgggaccagc ccaatgcccc 4500

acatgcggga agtgcacctg tgcggtgtgc aagagccgcg cggtcgccgc agcgcaggcg 4560

ctggaggcag gcgcagcggt ggtggccgcg ccgccagtcc gtgcatcggg gccgccgcgt 4620

ggcgcttcag gcgtggcgct ggccgatggg tcctctcgag gaccgtcgtc cgccccgcgc 4680

ggcgtgtggg gccccgcggg cgcgcgcctt gccaattcca acatcgggcg cccatccctg 4740

gacctggcgc cctccgctcg cgcctgggca gccgccaacg caaacagcac tgccagcagt 4800

accgctaccg gcaccgcgcc tgccggcgca acgggcgtag cgggcacgtc ggctccgggc 4860

gcggtcaagg gccccagcaa cagcagcgtt gccgggcacg tcgccgccac tgccgccgcc 4920

gctgcgcagt tcgccgcgtt cgcctcggag gcacccgggc cgtccatggg tgtgctgcca 4980

ccagccatgg cctacgccag ccgccgcggc ggccgcggcg gcggctcgga cgccgcgcaa 5040

tggtcgcaag gtcctagcgg cttcctcatg tctactggcg gcactgtggg cggcggaggc 5100

ggcgggaccg gcagcggcgg cgcggagagc cggcgggcca gccgcggcac ggacacgtgg 5160

cgggggcacg cgcctggcca ggcggctatg gacctcgtgg cgccgtctgt gaccctcgcg 5220

ccgtactttt ag 5232

<210> 2

<211> 1743

<212> PRT

<213> Chlamydomonas reinhardti

<400> 2

Met Ala Ala Asn Val Ala Arg Ala Arg Gly Ala Pro Arg Arg Asn Pro

1 5 10 15

Phe Arg Arg Ile Gln His Gln Lys Lys Gln Lys His Leu Gln Lys Ser

20 25 30

Tyr Ser Gln Tyr Asn Leu Ser His Leu Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ser

35 40 45

Ser Ser Ser Lys Lys Arg Lys His Leu Gly Gly Val Tyr Gly Leu Leu

50 55 60

Ala Arg His Ile Asp Val Pro Gln His Leu Met Asp Lys Ala Gln Glu

65 70 75 80

Met Ala Glu Gly Arg Pro Pro Thr Phe Phe Ser Arg Arg Ser Leu Leu

85 90 95

Gly Leu Pro Met Leu His Pro Tyr Ser Arg Val Ser Val Ala Trp Arg

100 105 110

Ala Ala Met Leu Val Phe Asp Leu Thr Phe Thr Ala Phe Trp Val Pro

115 120 125

Leu Asn Ile Gly Phe Cys Tyr Ser Asn Tyr Gly Asn Leu Ala Ala Pro

130 135 140

Cys Thr Gln Ser Asp Leu Ala Gly Gly Ile Val Tyr Val Ser Asn Trp

145 150 155 160

Leu Met Gly Phe Leu Met Gly Ala Val Leu Ser Asn Gly Ser Lys Arg

165 170 175

Ala Val Cys Val Asp Gly Arg Leu Val Thr Tyr Ala Tyr Val Ala Tyr

180 185 190

Gly Lys Phe Ala Met Asp Leu Leu Ala Ser Ile Pro Phe Phe Val Leu

195 200 205

Val Gly Thr Ile Ala Ser Gly Gly Gly Ser Gly Glu Thr Arg Leu Leu

210 215 220

Ser Leu Leu Ser Leu Leu Arg Leu Val Arg Met Leu Arg Leu Val Asn

225 230 235 240

Thr Val Lys Val Val Tyr Gln Asp Ser Leu Ser Gly His Tyr Arg Met

245 250 255

Ser Phe Ile Thr Arg Thr Val Ser Val Ser Ala Met Tyr Leu Leu Leu

260 265 270

Leu Gly Phe Gln Phe Ala Val Val Val Asn Met Cys Ala Ser Leu Met

275 280 285

Ile Met Leu Ala Ala Phe Tyr Gly Tyr Glu Asn Thr Trp Gln Asp Ser

290 295 300

Leu Gly Trp Trp Trp Gly Ser Trp Glu Asp Leu Gln Pro Val Gly Leu

305 310 315 320

Trp Tyr Asn Ala Val Tyr Trp Val Ile Thr Ala Leu Thr Thr Thr Gly

325 330 335

Ala Gly Gln Ala Pro Arg Gln Ala Gly Glu Gln Val Val Ser Asn Phe

340 345 350

Cys Ser Val Tyr Gly Met Val Phe Asn Gly Leu Val Val Gly Val Val

355 360 365

Gly Arg Ala Leu Met Gln Ala Thr Gly Asp Ala Ser Asn Leu Tyr Leu

370 375 380

Ser Arg Lys Lys Val Gly Leu Val Ser Ser Trp Ala Asp Thr Arg His

385 390 395 400

Leu Pro Pro Ser Val Lys Lys Glu Leu Gln Val Tyr Phe Ala Asp Ser

405 410 415

Glu Leu Ala Arg Gly Glu Phe Gly Phe Glu Ala Gly Val Ile Glu Gly

420 425 430

Leu Pro Thr Thr Leu Arg Arg Gln Val Val Ala Tyr Val Val Arg Pro

435 440 445

Leu Val Asp Lys Val His Ile Leu Ser Ala Ala Glu His Glu Leu Arg

450 455 460

Asp Leu Ile Ala Thr Met Phe Arg Pro Leu Asp Val Pro Pro Gly His

465 470 475 480

Asp Leu Cys Arg Gln Gly His Leu Ala Asp Arg Leu Trp Leu Val Glu

485 490 495

Trp Gly Thr Val Val Ala Leu Arg His Lys Glu Gln Glu Ala His Pro

500 505 510

Thr Thr Gly Met Thr Cys Leu Leu Gly Glu Gly Val Leu Leu Arg Gly

515 520 525

Val Met Asp Val Ala Ala Val Arg Pro Trp Thr Leu Arg Thr Ser Ser

530 535 540

Ala Cys Arg Leu Trp Glu Leu Ala Trp Glu Asp Leu Glu Pro Leu Leu

545 550 555 560

Arg Val Tyr Pro Arg Leu Gln Ser Ile Ala Leu Gln Tyr Ile Lys Asp

565 570 575

Arg Leu Ile Arg Ala Leu Asp Gly Ile Pro Gln Arg Asp Thr Ala Trp

580 585 590

Cys Glu Leu Val Ala Val Leu Ser Arg Ile Leu Lys Gln Pro Ala Gln

595 600 605

Leu Asp Gln Ala Arg Asp Asn Leu Glu Ala Leu Glu Gln Ser Arg Glu

610 615 620

Glu Asp Gly Ser Leu Pro Ala Leu Leu Ser Ser Trp Leu Glu Ala Gly

625 630 635 640

Ile Ser Thr Thr Leu Glu Leu Gly Ala Thr Gly Ala Gln Lys Arg Gly

645 650 655

Leu Val Thr Met Ser Ile Met Leu Ala Arg Gln Ser Lys Asp Ala Leu

660 665 670

Gly Ala Pro Ser Thr Ala Leu Ser Gly Pro Tyr Pro Pro Tyr Ala Asn

675 680 685

His Pro Leu Gly Ala Pro Ser Leu Ala Leu Leu Pro Arg Tyr Gly Gly

690 695 700

Gly Gly Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Phe Arg Arg Gly Gly Thr Gly

705 710 715 720

Ala Ser Gly Leu Ala Ala Gln Ser Val Gly Leu Gly Met Leu Leu Pro

725 730 735

Gly Gly Thr Thr Ala Ala Thr Leu Gln Arg Glu Pro Ser Ala Gly Ala

740 745 750

Pro Gly Leu Thr Gly Phe Gly Gly Gly Met Gly Ser Gly Ser Gly Leu

755 760 765

Gly Ala Ser Ser Val Glu Leu Pro Thr Pro Val Glu Ala Glu Gly Glu

770 775 780

Glu Asp Val His Ala Pro Val Gln Ala Gln Arg Leu Trp Gln Gly Lys

785 790 795 800

Ser Glu Ala Ala Ser Ser Pro Ala Ser Thr Ala Ala Ala Arg Gly His

805 810 815

Gly Gly Ala Arg Arg Ser Arg Ser Phe Thr Ser Cys Ser Ala His Ala

820 825 830

Ser Gly Thr Pro Thr Pro Pro Ser Arg Gly Ser Gln Pro Pro Pro Gly

835 840 845

Gly Leu Pro Ser Ser Pro Met Gln Ile Ala Leu Ser Ser Ala Leu Leu

850 855 860

Gln Pro Ser Arg Pro Pro Pro Thr Pro Ser Arg Leu Ala Ile Ser Ser

865 870 875 880

Arg Gln His His Ser His Asn Leu Leu Gly Ser Glu Ala Thr Gly Gly

885 890 895

Asp Thr Glu Thr Gly Ala Ala Ala Arg Ala Gly Gly Ala Ala Ala Val

900 905 910

Ala Ala Gly Gly Ala Arg Pro Gly Arg Pro Gly Pro Ala Asp Ser Tyr

915 920 925

Ala Arg Ser Pro Leu Gly Gly Arg Pro Pro Pro Arg Arg Ser Phe Ser

930 935 940

Glu Asp Gly Ala Ala Asp Ala Ala Arg Ala Arg Val Ala Ala Ala Ala

945 950 955 960

Ala Ser Gly Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Asp Glu Thr Val Glu

965 970 975

Gln Ala Arg Ala Glu Phe Arg Pro Pro Leu Gln Ala Pro Gln Pro Pro

980 985 990

Gln Ser Pro Gln Leu Pro Ser Gln Arg Ser Pro Phe Leu Ser His Pro

995 1000 1005

Asp Glu Ala Ala Arg Leu Asp Ser Ala Gly Ser Gly Ser Arg Arg Gly

1010 1015 1020

Gly Pro Pro Ser Trp Val Leu Asn Pro Met Ala Glu Gly Glu Pro Leu

1025 1030 1035 1040

Pro Leu Gly Glu Val Glu Gly Asp Ala Glu Ala Leu Val Leu Ala Thr

1045 1050 1055

Ala Thr Pro Glu Gly Leu Gly Leu Ala Thr Val Thr Pro Glu Ala Leu

1060 1065 1070

Gly Leu Ala Ala Asp Val Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Glu Ala Gln

1075 1080 1085

Arg Ser Gln Ala Gly Gln Gly Met Ala Met Ser Pro Ala Ala Ser Thr

1090 1095 1100

Ser Gly Met Glu Gly Thr Val Ser Thr Ala Pro Asp Ser Pro Gln Arg

1105 1110 1115 1120

Ser Glu Pro Glu Glu Arg Leu Ser Val Ile Ala His Thr Ser Arg Ala

1125 1130 1135

Phe Gly Val Val Asp Ala Gly Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Ala Pro

1140 1145 1150

Ala Ala Ala Pro Gln His Ala Arg Pro Pro Arg Val Pro Ser Val Gly

1155 1160 1165

Thr Ile Gly Ala Pro Leu Ala Ala Gly Gln Gln Ser Gln Ser Arg Ile

1170 1175 1180

Gly Gly Pro Arg Arg Thr Val Thr Glu Ala Ser Leu Thr Ser Pro Arg

1185 1190 1195 1200

Arg Gln Gln Pro Thr Ala Pro Ser Trp His Pro Ala Ala Ala Ala Ala

1205 1210 1215

Pro Ala Pro Ala Leu Ser Arg Ala Asp Ser Phe Thr Ala Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ala Leu Ala His Ala Ala Gly Gly Ala Arg Ser Gly His Val Arg

1235 1240 1245

Phe Phe Arg Ser Phe Ser Leu Ala Ala Gly Asn Pro Gly Ile Ala Ala

1250 1255 1260

Val Ser Val Gly Ala Ala Ala Ala Asp Ala Asp Ser Ser His Leu Met

1265 1270 1275 1280

Asp Arg Leu Arg Ala Ala Arg Glu Arg Ala Asn Ser Leu Ser Arg Arg

1285 1290 1295

Arg Val His Ser Ala Glu Leu Ala Pro Gly Asp Leu Leu Ser Gln Ala

1300 1305 1310

Asp Gln Ala Ala Ala Pro Ser Arg Glu Leu Asn Arg Ser Thr Gly Asp

1315 1320 1325

Gly Ala Asp Gly Ala Asp Gly Ala Gly Ile Val Val Arg Gly Gly Gly

1330 1335 1340

Gly Asp Asp Asp Asp Cys Glu Arg Gly Asp Ala Pro Pro Tyr Tyr Arg

1345 1350 1355 1360

Thr Gly Thr Gly Ile Ser Ser Val Ser Gly Met Ala Glu Ser Ala Ala

1365 1370 1375

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Arg Pro Asp Gly Leu Val Pro Ser Ala

1380 1385 1390

Ser Gly Arg Ser Val Arg Leu Ala Thr Ala Pro Leu Pro Gly Arg Val

1395 1400 1405

Ser Ala Leu Leu Ala Arg Ser Gly Thr Pro Pro Arg Ala Pro Ser Ser

1410 1415 1420

Ser Gly Val Ser Gly Val Ser Tyr Gly Gly Gly Ser Gly Gly Leu Leu

1425 1430 1435 1440

Gly Lys Ser Gly Gly Gly Leu Val Ser Pro Arg Ser Arg Ser Pro Gly

1445 1450 1455

Pro Gly Asp Ala Gly Pro Gly Ser Gly Val Gly Ala Pro Val Thr Ala

1460 1465 1470

Val Ala Ala Gly Ala Ser Val Ala Ala Ala Ala Ala Asn Ala Ala Gly

1475 1480 1485

Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Pro Ala Gln Cys Pro Thr Cys Gly Lys

1490 1495 1500

Cys Thr Cys Ala Val Cys Lys Ser Arg Ala Val Ala Ala Ala Gln Ala

1505 1510 1515 1520

Leu Glu Ala Gly Ala Ala Val Val Ala Ala Pro Pro Val Arg Ala Ser

1525 1530 1535

Gly Pro Pro Arg Gly Ala Ser Gly Val Ala Leu Ala Asp Gly Ser Ser

1540 1545 1550

Arg Gly Pro Ser Ser Ala Pro Arg Gly Val Trp Gly Pro Ala Gly Ala

1555 1560 1565

Arg Leu Ala Asn Ser Asn Ile Gly Arg Pro Ser Leu Asp Leu Ala Pro

1570 1575 1580

Ser Ala Arg Ala Trp Ala Ala Ala Asn Ala Asn Ser Thr Ala Ser Ser

1585 1590 1595 1600

Thr Ala Thr Gly Thr Ala Pro Ala Gly Ala Thr Gly Val Ala Gly Thr

1605 1610 1615

Ser Ala Pro Gly Ala Val Lys Gly Pro Ser Asn Ser Ser Val Ala Gly

1620 1625 1630

His Val Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Phe Ala Ala Phe Ala

1635 1640 1645

Ser Glu Ala Pro Gly Pro Ser Met Gly Val Leu Pro Pro Ala Met Ala

1650 1655 1660

Tyr Ala Ser Arg Arg Gly Gly Arg Gly Gly Gly Ser Asp Ala Ala Gln

1665 1670 1675 1680

Trp Ser Gln Gly Pro Ser Gly Phe Leu Met Ser Thr Gly Gly Thr Val

1685 1690 1695

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Thr Gly Ser Gly Gly Ala Glu Ser Arg Arg

1700 1705 1710

Ala Ser Arg Gly Thr Asp Thr Trp Arg Gly His Ala Pro Gly Gln Ala

1715 1720 1725

Ala Met Asp Leu Val Ala Pro Ser Val Thr Leu Ala Pro Tyr Phe

1730 1735 1740

<210> 3

<211> 2118

<212> DNA

<213> Chlamydomonas reinhardti

<400> 3

aattcgatct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 60

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 120

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 180

tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct ccaccgcggt 240

ggcggccgct ctagaactag tggatccact atagggcgaa ttggagctcc accgcggtgg 300

cggccgctct agagacggcg gggagctcgc tgaggcttga catgattggt gcgtatgttt 360

gtatgaagct acaggactga tttggcgggc tatgagggcg cgggaagctc tggaagggcc 420

gcgatggggc gcgcggcgtc cagaaggcgc catacggccc gctggcggca cccatccggt 480

ataaaagccc gcgaccccga acggtgacct ccactttcag cgacaaacga gcacttatac 540

atacgcgact attctgccgc tatacataac cactcagcta gcttaagatc ccatcaagct 600

tgcatgccgg gcgcgccaga aggagcgcag ccaaaccagg atgatgtttg atggggtatt 660

tgagcacttg caacccttat ccggaagccc cctggcccac aaaggctagg cgccaatgca 720

agcagttcgc atgcagcccc tggagcggtg ccctcctgat aaaccggcca gggggcctat 780

gttctttact tttttacaag agaagtcact caacatctta aaatggccag gtgagtcgac 840

gagcaagccc ggcggatcag gcagcgtgct tgcagatttg acttgcaacg cccgcattgt 900

gtcgacgaag gcttttggct cctctgtcgc tgtctcaagc agcatctaac cctgcgtcgc 960

cgtttccatt tgcaggatgg ccactccgcc ctccccggtg ctgaagaatt tcgaagcatg 1020

gacgatgcgt tgcgtgcact gcggggtcgg tatcccggtt gtgagtgggt tgttgtggag 1080

gatggggcct cgggggctgg tgtttatcgg cttcggggtg gtgggcggga gttgtttgtc 1140

aaggtggcag ctctgggggc cggggtgggc ttgttgggtg aggctgagcg gctggtgtgg 1200

ttggcggagg tggggattcc cgtacctcgt gttgtggagg gtggtgggga cgagagggtc 1260

gcctggttgg tcaccgaagc ggttccgggg cgtccggcca gtgcgcggtg gccgcgggag 1320

cagcggctgg acgtggcggt ggcgctcgcg gggctcgctc gttcgctgca cgcgctggac 1380

tgggagcggt gtccgttcga tcgcagtctc gcggtgacgg tgccgcaggc ggcccgtgct 1440

gtcgctgaag ggagcgtcga cttggaggat ctggacgagg agcggaaggg gtggtcgggg 1500

gagcggcttc tcgccgagct ggagcggact cggcctgcgg acgaggatct ggcggtttgc 1560

cacggtcacc tgtgcccgga caacgtgctg ctcgaccctc gtacctgcga ggtgaccggg 1620

ctgatcgacg tggggcgggt cggccgtgcg gaccggcact ccgatctcgc gctggtgctg 1680

cgcgagctgg cccacgagga ggacccgtgg ttcgggccgg agtgttccgc ggcgttcctg 1740

cgggagtacg ggcgcgggtg ggatggggcg gtatcggagg aaaagctggc gttttaccgg 1800

ctgttggacg agttcttctg agggacctga tggtgttggt ggctgggtag ggttgcgtcg 1860

cgtgggtgac agcacagtgt ggacgttggg atccccgctc cgtgtaaatg gaggcgctcg 1920

ttgatctgag ccttgccccc tgacgaacgg cggtggatgg aagatactgc tctcaagtgc 1980

tgaagcggta gcttagctcc ccgtttcgtg ctgatcagtc tttttcaaca cgtaaaaagc 2040

ggaggagttt tgcaattttg ttggttgtaa cgatcctccg ttgattttgg cctctttctc 2100

catgggcggg ctggaatt 2118

Claims (9)

1.莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在调控莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：所述Cre03.g157400.t1.2基因的核苷酸序列为下述序列中的一种：

（1）包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

（2）包含编码SEQ ID NO:2所示蛋白质的核苷酸序列；

（3）包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述Cre03.g157400.t1.2基因的编码蛋白为下述蛋白中的一种：

（1）包含如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列；

（2）包含由SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经若干个氨基酸的取代、缺失或者增加等变化且衍生出的具有与SEQ ID NO:2所示蛋白相同活性的衍生蛋白。

3.莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在降低莱茵衣藻镉耐受性中的应用，其特征在于：通过降低莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因的表达、使Cre03.g157400.t1.2基因失活或缺失Cre03.g157400.t1.2基因进而降低莱茵衣藻对镉的耐受性。

4.一种降低莱茵衣藻镉耐受性的方法，其特征在于：通过降低莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因的表达、使Cre03.g157400.t1.2基因失活或缺失Cre03.g157400.t1.2基因来降低莱茵衣藻对镉的耐受性。

5.一种莱茵衣藻镉敏感型藻株，其特征在于：所述镉敏感型藻株为不含Cre03.g157400.t1.2基因活性的Cre03.g157400.t1.2基因突变株或Cre03.g157400.t1.2基因缺失株，或Cre03.g157400.t1.2基因表达下降的Cre03.g157400.t1.2基因表达缺陷株。

6.一种莱茵衣藻镉敏感型藻株的获得方法，其特征在于：为下述方法中的一种：

通过插入突变或者定点突变的方法获得莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因突变株；

通过构建Crispr载体进而获得莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因缺失株；

通过构建RNAi干涉载体进而获得莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因表达缺陷株。

7.权利要求5所述的莱茵衣藻镉敏感型藻株在镉污染的监测或检测中的应用。

8.莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在镉污染的监测或检测中的应用。

9.莱茵衣藻Cre03.g157400.t1.2基因在镉污染的治理中的应用。