CN112662804A

CN112662804A - 一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112662804A
Application number: CN202110101239.8A
Authority: CN
Inventors: 寇艳君; 邱结华; 沈浙南; 时焕斌
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2041-01-25
Also published as: CN112662804B

Abstract

本发明公开了一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法。稻瘟病菌无毒基因AvrPi9发生SNP变化导致AvrPi9基因编码提前终止、转变为有毒基因。所述引物组包括两对引物，第一对引物用于扩增出AvrPi9基因片段；第二对引物用于鉴别是否含有突变后导致AvrPi9转变为有毒基因的SNP。本发明提供了两对稻瘟病菌无毒基因AvrPi9的分子标记，利用所述分子标记可以快速建立稻瘟病菌自然群体中AvrPi9致病性变异的分子检测体系，了解和把握所述基因在田间自然群体中的分布及其动态变化规律，以此来指导各个地区水稻稻瘟病抗病育种以及品种合理布局和轮换，以便提高育种效率，更有效地控制稻瘟病的发生，以此来设计稻瘟病综合防治的新策略。

Description

一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法。

背景技术

水稻是世界上一半以上人口的主要粮食作物，也是我国重要粮食作物。维持水稻稳产对于满足全球日益增长的人口对稻米产量的需求具有重要意义。稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae/Piricularia oryzae)引起的真菌性病害，世界各个水稻种植地区均有发生，一般会引起水稻减产10％至30％，发病严重的区域甚至颗粒无收。

目前防控稻瘟病的手段主要是施用农药和种植抗性品种。施用农药存在污染环境增加生产成本，影响稻米品质等一系列不利因素，因此抗病品种的选育和推广是目前防控稻瘟病最为经济和有效的手段。然而，自然环境中，在水稻抗性品种的选择压下，稻瘟菌菌群替换迅速能突破抗性品种方向的新的生理小种并形成优势种群，最终导致抗性品种抗性“丧失”。在生产实践中抗性品种连续种植3-5年后，抗性就会明显衰退，抗病无法持久化。如何监控稻瘟病菌生理小种发生动态，培育持久抗病的品种以及寻找更为有效的抗病育种策略，成为目前生产上的迫切要求。

抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法，近年来，通过图位克隆等手段在水稻中已鉴定了100多个抗稻瘟病基因，其中36个已被克隆。这些水稻抗稻瘟病基因(Resistance gene，R gene)基因分布在除第3号染色体外的所有染色体上，在第6、11和12号染色体上存在较多的抗稻瘟病基因簇。目前，大部分克隆的抗稻瘟病基因均有特异的分子检测标记。这些分子检测标记的开发为水稻抗病分子育种奠定了良好基础。育种家结合分子检测标记可以快速鉴定水稻品种抗稻瘟病基因型，有效辅助抗病新品种的选育。但是田间稻瘟病菌菌群毒力的易变性，导致生产上推广使用的抗病品种常因发病严重而淘汰。快速有效的鉴定稻瘟病菌的生理小种和群体结构对于抗病品种的合理布局具有重要的指导意义。

依托生物科学技术的迅速发展，鉴定和克隆无毒基因的工作取得了较大的进展。当前，已经有40多个稻瘟病菌无毒基因被鉴定，然而被成功克隆的的无毒基因只有19个。这些基因的克隆为通过开发无毒基因的特异性分子标记来监测田间稻瘟病菌群体的生理小种及其群体结构的动态变化创造了条件。

公开号为CN104004771A的发明专利申请公开了稻瘟病菌无毒基因AvrPi9、编码的多肽、多核苷酸及其应用。该发明提供了一个稻瘟病菌新无毒基因Avr-Pi9的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列，该基因是一个在侵染植物时特异诱导表达的基因。

发明内容

本发明经研究发现了一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPi9中存在的SNP变化，导致AvrPi9基因编码提前终止，这种提前终止使得带有突变后AvrPi9基因的稻瘟病菌可以侵染含Pi9抗性基因的水稻，说明该SNP导致AvrPi9变成了有毒基因。针对该SNP变化设计检测引物，用于检测筛查水稻稻瘟病菌中无毒基因AvrPi9是否发生致病性变异。

一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组，稻瘟病菌无毒基因AvrPi9发生SNP变化导致AvrPi9基因编码提前终止、转变为有毒基因，所述引物组包括两对引物，第一对引物为：上游引物AvrPi9W1和下游引物AvrPi9W2，

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

第二对引物为：上游引物AvrPi9N1和下游引物AvrPi9N2，

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’。

本发明又提供了所述引物组在检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异中的应用。

本发明又提供了一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的试剂盒，包括所述的引物组。

所述的试剂盒，还包括PCR扩增所用的DNA聚合酶以及缓冲液。

本发明还提供了一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的方法，包括以下步骤：

(1)收集水稻中稻瘟病菌发病部位，并分离稻瘟病菌作为检测样本；

(2)提取步骤(1)检测样本中基因组DNA；

(3)以步骤(2)提取的基因组DNA作为模板，使用第一对引物PCR扩增出AvrPi9基因片段，再以扩增出的AvrPi9基因片段为模板，使用第二对引物进行PCR扩增，

第一对引物为：上游引物AvrPi9W1和下游引物AvrPi9W2，

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

第二对引物为：上游引物AvrPi9N1和下游引物AvrPi9N2，

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’；

(4)检测步骤(3)扩增产物，如果第二对引物扩增出214bp片段，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9出现致病性变异，否者待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9没有致病性变异。

上述步骤(3)在PCR扩增时，可以将两对引物分成先后两组反应体系去扩增，在第一对引物扩增完成后，取扩增产物作为第二对引物扩增的模板进行第二对引物的扩增，但一般这样操作比较繁琐，在实际使用时，一般是将两对引物同时加入同一反应体系中，然后进行一次的PCR扩增程序，在同一反应体系中第一对引物扩增后的产物自然作为第二对引物扩增时的模板进行扩增。所以，优选的，步骤(3)中同时将第一对引物和第二对引物加入反应体系中进行PCR扩增。

进一步优选的，检测体系为20μL，包括10μL 2×PCR mix、0.5μL 100ng/μL的DNA模板、10μM引物AvrPi9W1/W2各1μL、10μM引物AvrPi9N1/N2各0.2μL，余量为ddH₂O。

PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸30sec，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。

PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果有674bp和214bp两条条带，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9出现致病性变异；检测结果只有一条674bp的条带，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9没有致病性变异。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了两对稻瘟病菌无毒基因AvrPi9的分子标记，利用所述分子标记可以快速建立稻瘟病菌自然群体中AvrPi9致病性变异的分子检测体系，了解和把握所述基因在田间自然群体中的分布及其动态变化规律，以此来指导各个地区水稻稻瘟病抗病育种以及品种合理布局和轮换，以便提高育种效率，更有效地控制稻瘟病的发生，以此来设计稻瘟病综合防治的新策略。

附图说明

图1为突变菌株AvrPi9的DNA序列以及对应的蛋白序列对比结果图。

图2为含AvrPi9无毒基因菌株与含突变的AvrPi9菌株接种图，其中AvrPi9表示无突变的AvrPi9菌株，AvrPi9-M表示有突变的AvrPi9菌株。

图3为本发明引物对扩增稻瘟病菌无毒基因AvrPi9的电泳图；泳道1(KJ201)为含AvrPi9的KJ201菌株，泳道2-4(M1-M3)为含突变的AvrPi9的菌株。

具体实施方式

申请人通过图位克隆的方法克隆获得稻瘟病菌无毒基因AvrPi9，通过对无毒基因AvrPi9两旁的基因组序列设计了扩增引物对AvrPi9W1/W2。对全国稻区收集的稻瘟病菌并从中筛选300个优势菌株进行扩增发现AvrPi9扩出率为100％。进一步通过测序发现其中有8个菌株的AvrPi9发生SNP变化，导致AvrPi9基因编码提前终止(图1)。我们通过接种水稻发现突变菌株可以侵染含Pi9抗性基因的水稻(图2)，说明该SNP导致AvrPi9变成了有毒基因。

申请人根据该SNP，设计了SNP分型引物对AvrPi9N1/N2。通过引物对AvrPi9W1/W2和引物对AvrPi9N1/N2进行简单的PCR扩增，可以区别稻瘟病菌AvrPi9的基因型，从而判断该菌株是否对抗病基因Pi9具有毒力作用。

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’。

利用上述引物可监测田间稻瘟病菌群体的生理小种及其遗传结构的动态变化，以及该无毒基因在田间自然群体中的分布情况。有助于基于无毒基因标记的稻瘟病菌的群体遗传结构的研究；也有助于水稻品种的抗病性鉴定和稻瘟病菌小种的鉴定；还有助于抗病品种的合理布局及轮换，以更有效地控制稻瘟病的发生。

本发明所述结果判定的规则是：扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，用阿拉伯数字代表不同的基因型(带型)(图3)，即“0”5、“1”分别表示两条带、一条带；测试菌株的最终基因型由所述的2对分子标记PCR基因型分析获得，基因型0代表无毒基因AvrPi9，基因型1代表AvrPi9突变型。

所述PCR的扩增体系为20μL，包括10μL 2×PCR mix、0.5μL 100ng/μL的DNA模板、10μM引物AvrPi9W1/W2各1μL、10μM引物AvrPi9N1/N2各0.2μL，余量为ddH₂O。PCR扩增程序为预变性94℃3min，变性94℃30 sec，退火62℃30 sec，延伸72℃30 sec，扩增35个循环，最后72℃延伸5min。

实施例1

田间稻瘟病菌的分离以及DNA的提取：

1、全国各地田间收集的发病的穗茎节部位保湿过夜，然后在显微镜下用细针挑取单个稻瘟菌分生孢子至西红柿燕麦培养基(番茄汁150mL、燕麦片40g、CaCO₃ 0.6g，定容至1000mL)中。培养7天后，收集分生孢子进行观察，确认是否分离成功稻瘟病菌，成功分离的稻瘟病菌转移至新的西红柿燕麦培养基中，加入灭过菌的滤纸片培养7天后收集滤纸片保存在-20℃备用。

2、稻瘟病菌菌丝体培养，将稻瘟病菌供试菌种于西红柿燕麦培养基上活化数日后，挑取适量菌丝，分别用液体培养基(每升液体培养基的配比：KH₂PO₄ 0.5g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄ 0.5g、CaCl₂ 0.1g、葡萄糖20g、酵母膏5g)培养，在120r/min摇床28℃培养6d，培养的菌丝体用灭菌滤纸过滤、吸水纸挤压干燥。

3、DNA的抽提，CTAB法提取水稻品种DNA：取干燥的菌丝体放入2.0mL的离心管中，加入800μL的CTAB提取液(CTAB 2％、NaC1 1mol/L、pH 8.0 Tris-HCl 100mmol/L、EDTA20mmol/L)，加入钢珠，放入植物组织破碎仪中60Hz研磨60秒，65℃水浴30分钟，每隔10分钟上下颠倒混合，65℃水浴后取出室温冷却，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，12000rpm离心10分钟，吸取700μL的上清液于新的1.5mL的离心管中，加入两倍体积的无水乙醇，负20℃放置30分钟以上沉淀DNA，12000rpm离心10分钟，去上清，加入500μL 75％乙醇后静置2分钟，12000rpm离心2分钟后，去上清倒置于吸水纸上，室温过夜干燥，加150μL去离子水，于4℃保存备用。

实施例2

AvrPi9序列的扩增与测序：

根据已经克隆的AvrPi9的序列设计引物对：

AvrPi9W1：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’；

AvrPi9W2：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’，

利用引物AvrPi9W1/W2扩增AvrPi9基因的基因组序列，扩增体系为20μL，包括10μL2×PCR mix、0.5μL 100ng/μL的DNA模板、10μM引物AvrPi9W1/W2各1μL，余量为ddH₂O。反应条件为：预变性94℃3min，变性94℃30sec，退火55℃30sec，延伸72℃30sec，扩增35个循环，最后72℃延伸5min。并对扩增产物进行双向测序分析(委托杭州有康生物科技有限公司)。

从300个分离的菌株测序结果中，有8株菌株的AvrPi9的编码区CAA突变成了TAA，导致转录提前终止，剩余292株AvrPi9与发表序列一致(图1)。

实施例3

接种水稻：取带有稻瘟病菌丝的滤纸片于OA培养基上，27℃条件下在OA培养基上培养3d，在超净工作台中取直径约为5mm的稻瘟病菌块，转接至PA培养基上，再培养7d，无菌条件下用无菌水洗去表面菌丝，用双层滤纸过滤后收集到1.5mL离心管中，并将孢子液终浓度调整成5×10⁵个/mL，用于离体接种。选取合适大小的供试水稻嫩叶剪成长短均匀的叶段，再均匀用针刺得伤口，将叶段置于铺有无菌水湿润的滤纸上后，再用湿滤纸压住叶段两端，以防止叶片卷曲而导致菌液无法在其表面悬浮，最后贴上对应标签备用。

用10μL的移液枪吸取上述制备的孢子悬浮液，均匀的接种于叶段伤口之上。为保证接种的环境因素能够满足稻瘟病菌成功侵染的条件，将接种材料放到28℃恒温培养箱，黑暗光照交替培养7d，对发病情况进行统计并拍照。

从接种结果上，因水稻品种中含抗性基因Pi9，无突变的菌株对单基因系TP309-Pi9表现为无毒，不能入侵抗性水稻，而菌株突变类型AvrPi9-M由于突变导致转录提前终止而成为毒性等位基因(图2)。

实施例4

AvrPi9分型引物的设计以及PCR检测：

根据测序获得的SNP信息，根据PCR-CTPP设计引物原理设计引物对AvrPi9N1/N2：

AvrPi9N1：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’：

AvrPi9N2：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’。

利用引物AvrPi9W1/W2和AvrPi9N1/N2两对引物一起扩增。检测体系为20μL，包括10μL 2×PCR mix、0.5μL 100ng/μL的DNA模板、10μM引物AvrPi9W1/W2各1μL、10μM引物AvrPi9N1/N2各0.2μL，余量为ddH₂O。PCR扩增程序为预变性94℃3min，变性94℃30sec，退火62℃30sec，延伸72℃30sec，扩增35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物用1％琼脂糖电泳检测。

电泳结果显示含无突变体的AvrPi9菌株可以扩增出2条带(分别为674bp和214bp)；而选取的突变的AvrPi9菌株M1，M2，M3只能扩增出一条带(674bp)，基本无法扩增出第二条条带(图3)，说明这两对引物可以检测稻瘟菌是否含AvrPi9且可以区分突变成毒性基因的AvrPi9。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 674

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)

<400> 1

caggattcca gctattcgac aaccccttct ctcttttctt tatctcttgg ctttttttcc 60

ttactgtcac tctctttctc tctctctctg tcttccttct agtcattcct ttggcaaagt 120

tctttttttc cttccagccc aacatgcagt tctctcagat cctcaccgtc ttgttccttg 180

gcgtctccgt cagcgccctt cccgccggcg gtctgcccgg cagccctggc agcgctgtcc 240

agaggtgcca ctgcccccct cgtggctccc acgcccacgg ctccctcgcc gctcgggagg 300

aagcgcccga ggccgaaggt gacgccaaga tttccgcccg ctacacctgc cccaactgcc 360

acaagacggg caaaggctgc gatgatgggt aaataagcaa ccccccatcc ccttgaaatc 420

ctttttgcgg tcatgttgct gacgtctttg atagctggtg ccaagtcgaa aagacgcact 480

ggtagaggaa aagtcaatcg agtaattata caggttagtg cttgtactag tgctctttct 540

aataacaatc catagtatat tatactaagt agtaagcaca ttcgccttta attaattctg 600

gtatcagtaa tgcgcagaag ggtgttgatg ctggggcttc aaaagtcggg ccactcgcat 660

tatcgcataa ttgc 674

<210> 2

<211> 214

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)

<400> 2

ccaagtcgaa aagacgcact ggtagaggaa aagtcaatcg agtaattata caggttagtg 60

cttgtactag tgctctttct aataacaatc catagtatat tatactaagt agtaagcaca 120

ttcgccttta attaattctg gtatcagtaa tgcgcagaag ggtgttgatg ctggggcttc 180

aaaagtcggg ccactcgcat tatcgcataa ttgc 214

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caggattcca gctattcgac aac 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cactcgcatt atcgcataat tgc 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgacgtct ttgatagctg gtacc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctaccagtg cgtcttttcg accta 25

Claims

1.一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组，稻瘟病菌无毒基因AvrPi9发生SNP变化导致AvrPi9基因编码提前终止、转变为有毒基因，所述引物组包括两对引物，第一对引物为：上游引物AvrPi9W1和下游引物AvrPi9W2，

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

第二对引物为：上游引物AvrPi9N1和下游引物AvrPi9N2，

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’。

2.如权利要求1所述引物组在检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异中的应用。

3.一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增所用的DNA聚合酶以及缓冲液。

5.一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)提取步骤(1)检测样本中基因组DNA；

第一对引物为：上游引物AvrPi9W1和下游引物AvrPi9W2，

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

第二对引物为：上游引物AvrPi9N1和下游引物AvrPi9N2，

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’；

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中同时将第一对引物和第二对引物加入反应体系中进行PCR扩增。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，检测体系为20μL，包括10μL 2×PCR mix、0.5μL 100ng/μL的DNA模板、10μM引物AvrPi9W1/W2各1μL、10μM引物AvrPi9N1/N2各0.2μL，余量为ddH₂O。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸30sec，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果有674bp和214bp两条条带，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9出现致病性变异；检测结果只有一条674bp的条带，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9没有致病性变异。