CN111100940B - 一种快速检测金针菇培养料中假单胞菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌（Pseudomonas migulae）的方法，以目标细菌的拓扑异构酶基因（简称Topo，位点NC_021250）作为特异性分子标记，设计出扩增抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌的特异性引物，通过PCR扩增方法检测工厂环境中潜在的目标致病细菌，并验证了该鉴定方法的灵敏性，此方法可用于快速监测工厂栽培环境中的微生物安全问题，为金针菇工厂化发展增加保障。

Description

一种快速检测金针菇培养料中假单胞菌的方法
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌(Pseudomonas migulae)的方法。
背景技术
金针菇工厂化栽培产业体系在我国日趋成熟，并已经成为主导的金针菇生产模式。工厂栽培环境对金针菇生产至关重要，其洁净程度直接影响到金针菇的产量和品质。工厂生产中消毒环节十分关键，主要针对生产设备、床架、空气、地面等进行消毒，目的是尽量消除杂菌的污染。细菌体积小，种类多，易传播。金针菇工厂栽培过程中，车间空气中主要细菌种类是假单胞杆菌属和欧文氏细菌。近期发现一种假单胞菌(Pseudomonas migulae)可以抑制菌丝发菌，致使搔菌冲水后，不正常栽培瓶培养料颜色加深显黑，导致产量降低。病原细菌还会增加食品安全风险，因此，针对工厂环境进行该病原细菌的监测十分有必要。
核酸检测是细菌鉴定中较常用及简便的方法，通用引物扩增16S rRNA基因可将细菌鉴定到属水平。鉴定程序通常是得到病原菌纯培养后，设计引物进行聚合酶链式反应，通过测序获得其序列，经数据库比对后进行鉴定。工厂化栽培过程中对病原菌进行监测，需在未得到病原菌纯培养的材料，如空气、水、培养料等中直接检测病原细菌是否存在。特异性基因标记是一种简便、且可以准确鉴定病原细菌的方法，通过特异的片段大小来筛选目标微生物，并可应用于检测混合微生物样品中的目标微生物。
特异性基因标记检测是一种快速鉴定混合材料中是否存在目标微生物的方法，相比于平板分离法，它免去了从待测样品中不断分离目标微生物的繁琐过程，无需得到目标细菌的纯培养即可鉴定，具有快速、高效、准确的优点。且在细菌单菌落检测过程中，不同于通用引物16S rRNA基因序列分析，不需测序鉴定，而只需通过特异引物扩增并电泳检测特异性标记条带即可。
发明内容
本发明提供了一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌(Pseudomonas migulae)的方法，选取拓扑异构酶基因(简称Topo，位点NC_021250)作为特异性分子标记，由此设计出扩增假单胞菌(Pseudomonas migulae)的特异性引物，根据扩增的特异片段检测工厂环境中潜在的目标致病细菌，该方法可用于快速监测工厂栽培环境中的微生物安全问题，为金针菇工厂化发展增加保障。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
以目标细菌Pseudomonas migulae的拓扑异构酶基因(简称Topo，位点NC_021250)作为特异性分子标记，根据Topo基因设计引物Topo-F(SEQ ID NO.1)和Topo-R(SEQ IDNO.2)。
一种快速检测培养料中抑制金针菇菌丝生长的假单胞菌(Pseudomonas migulae)的方法，包括以下步骤：
(1)采集搔菌阶段培养料，提取培养料总DNA；
(2)以培养料总DNA为模板，引物Topo-F(SEQ ID NO.1)和Topo-R(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增；
(3)将扩增产物进行核酸电泳检测，如果培养料样品中检测到1800bp的特异性扩增条带，则说明培养料中存在假单胞菌(Pseudomonas migulae)。
进一步地，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃，10min，4℃保存。
相比于现有技术，本发明具有的有益效果如下：
1、本发明根据P.migulae基因组的注释信息找到Topo基因序列，比较近缘物种的Topo同源基因，设计出扩增P.migulae的特异性引物，应用该引物以搔菌阶段培养料总DNA为模板获得长度为1800bp的P.migulae特异性产物，利用Topo基因可直接将目标细菌与工厂环境常见的细菌属及其他假单胞近缘种进行区分，为假单胞属细菌种间鉴定提供参考。
2、通过PCR扩增的方法快速检测搔菌阶段培养料中是否存在病原细菌P.migulae，可提前有效防治金针菇工厂化栽培搔菌阶段菌丝生长受抑制的病害症状，也解决了传统防治方法时效性差的缺点。
附图说明
图1是实例1中8对引物对目标细菌P.migulae扩增后的电泳图。M：BM2000Marker；泳道1为Topo引物扩增结果，泳道2-8是表1中其他7对引物相应的扩增结果。
图2是实施例1中Topo引物扩增后的电泳图。M：BM2000 Marker；泳道1为P.migulae基因组扩增结果；泳道2-16分别为15种参考细菌基因组扩增结果；泳道17为无菌水阴性对照。
图3是实例1中IS30引物扩增后的电泳图。M：BM2000 Marker；泳道1为P.migulae基因组扩增结果；泳道2-16分别为15种参考细菌基因组扩增结果；泳道17为无菌水阴性对照。
图4是实施例2中Topo引物灵敏度测试结果。M：BM2000 Marker，泳道1-13是PCR反应体系中P.migulae总DNA含量依次为60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24、0.12、0.06、0.03、0ng。
图5是实施例2中16S rRNA引物扩增图。M：BM2000 Marker，泳道1-4、5-8、9-12、13-16分别为接种105、106、107、108CFU/mL菌悬液后随机采集的四组培养料DNA样品，泳道17为阴性对照。
图6是实施例2中Topo引物扩增后的电泳图。M：BM2000 Marker，泳道1-4、5-8、9-12、13-16分别为接种105、106、107、108CFU/mL菌悬液后随机采集的四组培养料DNA样品，泳道17为阴性对照。
图7是实例2中发病样品中P.migulae的检测结果。M：BM2000 Marker；泳道1是发病培养料DNA样品Topo引物扩增结果，泳道2是P.migulae基因组DNA扩增结果，泳道3是无菌水阴性对照。
具体实施方式
实施例1：特异性引物设计
根据文献记载及病原菌P.migulae的细菌pD2RT质粒基因组注释信息，找到一些常用于种间鉴定的和物种系统发育研究的保守基因，将这些基因序列与近缘物种的直向同源基因序列作比较分析。基于同源基因间的序列差异，使用Primer3在线软件设计引物，用所设计的引物(见表1)对P.migulae及15种金针菇工厂中分离的细菌(Re1-Re15：Bacillusthuringiensis,Bacillus cereus,Bacillus subtilis,Escherichia coli,Ewingellaamericana,Cedeceadavisae,Paenibacillus sp.,Klebsiella oxytoca,Bacillus pumilus,Bacillus megaterium,Pantoeadispersa,Pseudomonasazotoformans,P.fluorescens,P.putida,P.tolaasii)的DNA作PCR扩增，根据Topo基因设计的引物Topo-F(SEQ ID NO.1)和Topo-R(SEQ ID NO.2)只在目标细菌P.migulae中扩增出特异性条带，而在其他细菌中无扩增产物(见图2)。其他7对引物中只有IS30基因引物可扩增出单一条带(见图1)，但是该引物在其他参考菌株中也能扩增出单一条带(见图3)，因此除Topo基因引物外，其他引物均不能特异扩增出目标假单胞菌。
PCR反应体系为共20μL，其中2×Taq Plus Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)10μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，加ddH2O补足总体积至20μL。
PCR程序：95℃预变性，5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃，10min，4℃保存。
表1
Figure BDA0002377341250000041
实施例2：特异性引物在检测P.migulae中的应用
灵敏性测试：
每个PCR反应体系中分别添加60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24、0.12、0.06、0.03、0ng的P.migulae细菌的DNA进行引物的灵敏度测试，结果表明(见图4)，Topo引物的灵敏性很高，仅0.12ng的DNA模板就可以扩增出目的条带。
外源添加P.migulae测试：
样品处理：设置P.migulae细菌悬浮液浓度梯度为105、106、107、108CFU/mL，以无菌水为对照，各处理4次重复，接种到养菌阶段第5天的金针菇栽培瓶培养料表面，每个处理5mL。
养菌结束后进行搔菌，在处理组随机取样，在LB液体培养基中培养24h后，进行病原菌的扩繁培养，提取培养料DNA，进行16S基因序列扩增，每个样品可以扩增出目标条带(见图5)，说明提取的培养料DNA可以用于PCR扩增；将培养料DNA样品用引物Topo-F(SEQ IDNO.1)和Topo-R(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增，所有样品都获得了与P.migulaeDNA相同大小的单一扩增产物(见图6)，而以ddH2O为阴性对照时没有产物。
将培养料样品经培养后再提取总DNA，用P.miguale的Topo基因特异性引物进行PCR扩增，可以获得与P.migualeDNA中相同大小的单一扩增产物，说明该方法可以特异性地检测出培养料中是否存在抑制金针菇菌丝生长的病原细菌P.miguale。
应用实例：
申请人从湖北武汉如意情金针菇高科技有限公司栽培车间取样，获取搔菌阶段菌丝生长受抑制的栽培瓶培养料，称取8g新鲜培养料到LB液体培养基中培养24h，进行病原菌的扩繁培养。
利用
Figure BDA0002377341250000051
soil DNA Kit(购于Omega Bio-tek公司)，提取扩繁后培养料总DNA，并将总DNA溶解于ddH2O中；以Topo-F和Topo-R分别做为上下游引物，以培养料总DNA为模板，进行目的条带扩增；PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，培养料样品中检测到1800bp左右的单一PCR产物(见图7)，说明该培养料中存在病原菌P.miguale。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种快速检测金针菇培养料中假单胞菌的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggccatgcg tttcaacaag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttggggctga caaaaccact 20

Claims (3)

1.用于检测金针菇培养料中假单胞菌（Pseudomonas migulae）的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.利用权利要求1所述的引物检测金针菇培养料中假单胞菌（Pseudomonas migulae）的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采集搔菌阶段金针菇菌丝的栽培瓶培养料，提取培养料总DNA；
（2）以培养料总DNA为模板，使用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；
（3）将扩增产物进行核酸电泳检测，如果培养料样品中检测到1800bp的特异性扩增条带，则说明培养料中存在假单胞菌（Pseudomonas migulae）。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR 程序为95℃预变性5 min，95℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。
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