CN112522428A

CN112522428A - 一种快速检测金针菇培养料中阿氏节杆菌的方法

Info

Publication number: CN112522428A
Application number: CN202011462765.9A
Authority: CN
Inventors: 肖扬; 王青; 边银丙
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-12-10
Filing date: 2020-12-10
Publication date: 2021-03-19

Abstract

本发明公开了一种快速检测培养料中引起金针菇幼蕾腐烂病的阿氏节杆菌（Arthrobacter arilaitensis）的方法，以目标细菌的Y家族DNA聚合酶基因（简称Yf，位点014548.1）作为特异性分子标记，设计出扩增引起金针菇幼蕾腐烂的阿氏节杆菌的特异性引物。通过PCR技术直接检测培养料等样品中的病原细菌，达到监测金针菇栽培工厂环境中潜在病原菌的目的，预防工厂金针菇大规模化生产过程中病原细菌引起病害爆发，为金针菇提供安全的生长环境，降低食品安全风险，减少因病害造成的经济损失。

Description

一种快速检测金针菇培养料中阿氏节杆菌的方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种快速检测培养料中引起金针菇幼蕾腐烂的阿氏节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)的方法。

背景技术

金针菇栽培方式由最早的简单设施化栽培演变为目前的大规模工厂化栽培，包括拌料、装瓶、灭菌、接种、养菌、搔菌、子实体培养和采摘等一系列机械化操作及自动控制生长环节，且其所需的温度、光照、pH、湿度及氧气等生长因子均达到最适范围，使金针菇在人工模拟可控的环境中实现周年化生产。在我国，金针菇是工业程度较高的食用菌，工厂化生产占据了金针菇市场的大部分份额。

病原细菌的快速鉴定是食用菌细菌性病害防控中的重要环节，有助于在工厂栽培环境中监测病原细菌，预防病害爆发。随着各领域技术的发展，用于细菌鉴定的生物、物理、化学及其交叉学科方法均取得了进展。其中，DNA分子标记是一种较为常用的方法，以细菌基因组核苷酸序列变异为基础，可揭示不同个体间DNA水平遗传多态性，常用于细菌分类鉴定、系统发育及进化等研究。相比于传统的形态特征及生理生化鉴定方法，具有便捷、灵敏、精准及稳定的优点，可满足食用菌病害病原细菌的快速检测需求。

常用于分类鉴定的细菌核糖体亚基基因包括16S rRNA，23S rRNA以及它们的间隔区序列，可用于细菌鉴定的DNA分子多态性标记方法有限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、扩增rDNA限制性分析(ARDRA) 等，其他DNA分子标记方法还包括脉冲电场凝胶电泳(PFGE)、多重PCR、DNA探针及基因芯片等。以上分子标记方法多应用于细菌属水平或群体分类进化研究，但存在过程繁琐、操作复杂且重复性差的缺点，针对食用菌病原细菌的快速检测，不具有明显优势。在已知病原细菌的前提下，基于PCR扩增技术，设计病原细菌的特异性分子标记，可在待测样品中针对性地快速检测病原细菌，达到监测食用菌病害的目的。据此，从金针菇病原细菌的基因组信息中筛选出目标基因，设计特异性扩增引物进行鉴定，是一种实现病原细菌快速检测的可行方法。

发明内容

本发明提供了一种快速检测培养料中引起金针菇幼蕾腐烂的阿氏节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)的方法，选取Y家族DNA聚合酶基因(简称Yf，位点NC_014548.1)作为特异性分子标记，由此设计出阿氏节杆菌的特异性引物，根据扩增的特异片段检测工厂环境中潜在的目标致病细菌，该方法可用于快速监测工厂栽培环境中的微生物安全问题，为金针菇工厂化发展增加保障。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

以目标细菌阿氏节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)的Y家族DNA聚合酶基因(简称Yf，位点NC_014548.1)作为特异性分子标记，根据Yf基因设计引物 Yf-F(SEQ IDNO.1)和Yf-R(SEQ ID NO.2)。

一种快速检测培养料中引起金针菇幼蕾腐烂的阿氏节杆菌(Arthrobacterarilaitensis)的方法，包括以下步骤：

(1)采集金针菇的培养料，提取培养料总DNA；

(2)以培养料总DNA为模板，引物Yf-F(SEQ ID NO.1)和Yf-R(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增；

(3)将扩增产物进行核酸电泳检测，如果培养料样品中检测到2100bp的特异性扩增条带，则说明培养料中存在阿氏节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)。

进一步地，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃，10min，4℃保存。

相比于现有技术，本发明具有的有益效果如下：

1、本发明根据阿氏节杆菌基因组的注释信息找到Yf基因序列，比较近缘物种的Yf同源基因，设计出扩增阿氏节杆菌的特异性引物，应用该引物以生育室初期阶段培养料总DNA为模板获得长度为2100bp的阿氏节杆菌特异性产物，利用Yf基因可直接将目标细菌与工厂环境常见的细菌属进行区分。

2、通过PCR扩增的方法快速检测生育室初期阶段培养料中是否存在病原细菌阿氏节杆菌，可提前有效防治金针菇工厂化栽培生育室初期阶段幼蕾腐烂的病害症状，也解决了传统防治方法时效性差的缺点。

附图说明

图1是实施例1中8对引物对目标细菌A.arilaitensis扩增后的电泳图。M：BM2000；泳道8为Yf引物扩增结果，泳道1为16S rRNA基因引物扩增结果，泳道2-7 是表1中其他6对引物相应的扩增结果，泳道9为无菌水阴性对照。扩增结果中，除16S rRNA基因引物外，只有Yf引物扩增出清晰且单一的条带。

图2是实施例1中Yf引物扩增后的电泳图。M：BM2000；泳道1为A.arilaitensis 基因组扩增结果；泳道2-14分别为13种参考细菌基因组扩增结果；泳道15为无菌水阴性对照。

图3是实施例2中Yf引物灵敏度测试结果。M：BM2000，泳道1-17是PCR反应体系中A.arilaitensis总DNA含量依次为80,40,20,10,5,2.5,1.25,0.63,0.32,0.16, 0.08,0.04,0.02,0.01,0.005,0.0025和0ng。

图4是实施例2中16S rRNA引物扩增图。M：BM2000，泳道1-4、5-8、9-12、 13-16分别为接种10⁵、10⁶、10⁷、10⁸CFU/mL菌悬液后随机采集的四组培养料 DNA样品，泳道17为无菌水阴性对照。

图5是实施例2中Yf引物扩增后的电泳图。M：BM2000，泳道1-4、5-8、9-12、 13-16分别为接种10⁵、10⁶、10⁷、10⁸CFU/mL菌悬液后随机采集的四组培养料 DNA样品，泳道17为无菌水阴性对照。

图6是实施例2中发病样品中A.arilaitensis的检测结果。M：BM2000；泳道1 是发病培养料DNA样品Yf引物扩增结果，泳道2是A.arilaitensis基因组DNA 扩增结果，泳道3为无菌水阴性对照。

具体实施方式

实施例1：特异性引物设计

(1)根据文献记载及病原菌A.arilaitensis的基因组注释信息，找到一些常用于种间鉴定的和物种系统发育研究的保守基因，将这些基因序列与近缘物种的直向同源基因序列作比较分析。基于同源基因间的序列差异，使用Primer3在线软件设计引物，用所设计的引物(见表1)对A.arilaitensis及13种金针菇工厂中分离的细菌(RY1-RY13：Bacillusthuringiensis,Bacillus cereus,Bacillus subtilis, Escherichia coli,Ewingellaamericana,Cedecea davisae,Paenibacillus sp., Klebsiella oxytoca,Bacilluspumilus,Bacillus megaterium,Pantoea dispersa, Flavobacterium psychrophilum，Acinetobacter sp.)的DNA作PCR扩增，待测引物中只有根据Yf基因设计的引物Yf-F(SEQID NO.1)和Yf-R(SEQ ID NO.2) 扩增出单一清晰的目标条带(见图1)，且Yf基因扩增引物只在目标细菌A. arilaitensis中扩增出特异性条带，而在其他细菌中无扩增产物(见图2)。

PCR反应体系为共20μL，其中2×Taq Plus Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)10μL，上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，加 ddH₂O补足总体积至20μL。

PCR程序：95℃预变性，5min；95℃变性30s；56℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃，10min，4℃保存。

表1

实施例2：特异性引物在检测阿氏节杆菌(A.arilaitensis)中的应用灵敏性测试：

每个PCR反应体系中分别添加80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.32、 0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.0025和0ng的A.arilaitensis细菌的DNA 进行引物的灵敏度测试，结果表明(见图3)，Yf引物的灵敏性很高，仅0.01ng 的DNA模板就可以扩增出目的条带。

外源添加A.arilaitensis测试：

样品处理：设置A.arilaitensis细菌悬浮液浓度梯度为10⁵、10⁶、10⁷、10⁸ CFU/mL，以无菌水为对照，各处理4次重复，接种到萌发原基的金针菇栽培瓶培养料表面，每个处理5mL。

接种细菌菌悬液的金针菇出现病害症状后，在处理组培养料中随机取样，将样品置于LB液体培养基中培养24h后，进行病原菌的扩繁培养，提取培养料 DNA，进行16S rRNA基因序列扩增，每个样品可以扩增出目标条带(见图4)，说明提取的培养料DNA可以用于PCR扩增；将培养料DNA样品用引物Yf-F (SEQ ID NO.1)和Yf-R(SEQ ID NO.2)进行PCR扩增，所有样品都获得了与 A.arilaitensis DNA相同大小的单一扩增产物(见图5)，而以ddH₂O为阴性对照时没有产物。

将培养料样品经培养后再提取总DNA，用A.arilaitensis的Yf基因特异性引物进行PCR扩增，可以获得与A.arilaitensis DNA中相同大小的单一扩增产物，说明该方法可以特异性地检测出培养料中是否存在抑制金针菇菌丝生长的病原细菌A.arilaitensis。

应用实例：

从湖北武汉如意情金针菇高科技有限公司栽培车间取样，获取生育室初期阶段腐烂的幼嫩子实体的栽培瓶培养料，称取8g新鲜培养料到LB液体培养基中培养24h，进行病原菌的扩繁培养。

利用

soil DNA Kit(购于Omega Bio-tek公司)，提取扩繁后培养料总DNA，并将总DNA溶解于ddH₂O中；以Yf-F和Yf-R分别做为上下游引物，以培养料总DNA为模板，进行目的条带扩增；PCR反应后进行琼脂糖凝胶电泳，培养料样品中检测到2100bp左右的单一PCR产物(见图6)，说明发病金针菇的培养料中存在A.arilaitensis。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种快速检测金针菇培养料中阿氏节杆菌的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agggttgaag atccatgacc ac 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acagctttta tgtctcctgc ga 22

Claims

1.用于检测培养料中阿氏节杆菌（Arthrobacter arilaitensis）的引物，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.利用权利要求1所述的引物检测金针菇培养料中阿氏节杆菌（Arthrobacter arilaitensis）的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）采集金针菇的培养料，提取培养料总DNA；

（2）以培养料总DNA为模板，使用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

（3）将扩增产物进行核酸电泳检测，根据扩增条带检测阿氏节杆菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR 程序为95℃预变性5 min，95℃变性30s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。