CN111518730A - 一种分离培养番茄根系微生物组的方法及所得番茄根系微生物组 - Google Patents

一种分离培养番茄根系微生物组的方法及所得番茄根系微生物组 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种分离培养番茄根系微生物组的方法，其为I、取番茄根系研磨获得根系浆状物，梯度稀释培养得到培养细菌；II、培养细菌16S rRNA基因的V5‑V7区域序列测序；III、细菌OTU的鉴定并得到不同门和/或高丰度属的包含的培养细菌数的比例；IV、依据上述比例构建番茄根系微生物组。本发明还提供所得的番茄根系微生物组，以及分离培养番茄根系微生物组的方法和番茄根系微生物组的应用。本发明的方法能够快速高效的分离培养番茄根系微生物组，为利用原位根系微生物制成菌肥提供了良好的资源。

Description

一种分离培养番茄根系微生物组的方法及所得番茄根系微生 物组
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种分离培养番茄根系微生物组的方法及所得番茄根系微生物组。
背景技术
番茄又名为西红柿，是世界上需求量最多的蔬菜之一。随着番茄产业规模的变化，番茄种植业也存在着许多亟待解决的问题，主要为番茄产品质量安全问题。为了维持大量蔬菜供给，寿光大棚蔬菜种植用地使用频繁，施用大量的化肥和农药，蔬菜农药残留严重，病害频发，同时农户在种植过程中安全意识不强，导致番茄生产安全隐患。在连续种植的土地负荷下，3-5年需要进行大棚熏蒸消毒或更换土壤，且非嫁接苗难以成活，只能种植嫁接番茄苗，这种做法不但成本极高，而且不可持续。因此，蔬菜产业的可持续发展应以良好的生态环境为基础，采用绿色环保、科学精准的蔬菜种植体系必然为蔬菜产业的发展提供契机。
微生物是土壤生态环境中最大的居民，土壤中的微生物能分解土壤中的动植物残体，形成腐殖质，为植物提供最丰富、最全面的植物营养来源。同时，微生物与根系、根际土壤一起组成了农作物的“肠胃”，很多有益微生物与根系形成互补共生关系，在农作物各种营养的转化和吸收过程中发挥主要作用，多数矿物质元素依靠微生物的活动变为农作物可吸收的活性状态。同时，有益微生物是农作物的卫士，协助抵抗病虫侵害。比如，胶质芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等可以将不可溶磷、钾转化为可溶的磷、钾活性状态，便于植物吸收；根瘤菌能将空气中的氮加工成可供植物吸收的氨态氮，源源不断地输送给植物，形成植物的天然氮工厂。正是微生物的这些功能，造就了微生物菌肥在农业领域引起的高度关注。然而，目前的菌肥都以单一菌种为主，在不同作物、不同时期、不同用量情况下的效果不稳定，主要原因是外源菌种在不同土壤性质的适应性及对作物产生作用的特异性。
微生物组学研究动植物体上共生或病理的微生物生态群体。微生物组包括细菌、古菌、原生动物、真菌和病毒。因此，利用根系微生物组分离技术，培养番茄根系的原位微生物组，可从根本上解决规模番茄种植成本极高且不可持续的问题，同时克服了现有番茄用菌肥单一菌种不稳定性的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何针对番茄规模化栽培过程中根际微生物菌群失调，种植成本极高且不可持续的问题，以及现有番茄用菌肥单一菌种不稳定的问题，提供一种分离培养番茄根系微生物组的方法及所得番茄根系微生物组。
本发明的一种分离培养番茄根系微生物组的方法，包括如下步骤：
I、取番茄根系加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物；梯度稀释根系浆状物，每个稀释倍数的根系浆状物以N张96孔细胞培养板培养，每日观察，直至板上浑浊的孔不再增加为止；留30-50％的孔内浑浊的稀释倍数，该稀释倍数的每块板上每个浑浊孔内的菌液即为培养细菌；每孔培养细菌取部分菌液进行下一步细菌鉴定，剩余的菌液分别低温保存；所述N为大于等于2的自然数；
II、将每孔培养细菌分别提取模板DNA后，采用两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增后结合Illumina Hiseq测序得出每孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列；
所述两轮标记引物的聚合酶链式反应技术，第一轮使用无Barcode的799F和1193R作为引物，第二轮使用799F-2和1193R-2作为引物；
所述799F为核苷酸序列是序列1的单链DNA，所述1193R为核苷酸序列是序列2的单链DNA，所述799F-2和1193R-2选自下述A或B的引物：
A、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA；
B、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA；
所述96个孔barcode是用于标记在一张96孔板上的96个孔的标记，所述96个孔barcode的核苷酸序列均不相同，所述M个板barcode是用于标记所述N张96孔板的标记，所述M个板barcode的核苷酸序列均不相同；所述M为大于等于所述N的自然数；
III、将每孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列与RDP数据库中已有细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列进行比对，聚类相似度在97％以上的属于同一种细菌OTU，得到记录有每孔培养细菌所属细菌OTU的OTU表；分析OTU表，得出所有培养细菌的细菌OTU所属的门和/或高丰度属，并得到不同门和/或高丰度属的包含的培养细菌数的比例；
IV、每个细菌OTU从低温保存的培养细菌中选代表株进行细菌保存，从中选属于不同门和/或高丰度属的代表株复苏培养后，按照步骤III所得的比例混合，组成番茄根系微生物组；所述微生物为细菌。
上述方法中，所述取番茄根系为在番茄规模化栽培地区选若干种当地土壤种植非嫁接的番茄苗(例如实生苗、组培苗)，种植过程中不使用化肥和农药，选所种番茄均植株健康长势良好的土壤，挖取该土壤中种植的番茄根系。
细菌OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，种，属，分组等)设置的同一标志，与RDP数据库(http://rdp.cme.msu.edu/)中的16S rRNA基因序列进行比对后聚类相似度在97％以上的认为是属于同一种细菌OTU。
上述方法中，步骤I所述取番茄根系加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物为从番茄根茎连接处开始剪下距离其10cm以内的侧根，洗净，去除杂质，吸干残留液体后，将侧根剪碎，加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物。其中，所述洗净，为先以无菌水冲净，再以1×PBS缓冲液清洗3次，每次以180rpm的转速清洗15min(如此清洗后留下的为根系内生细菌及根表紧密着生的细菌)。
上述方法中，步骤I所述梯度稀释，为以1/10×TSB液体培养基将根系浆状物分别稀释2000倍、6000倍以及18000倍；所述1/10×TSB液体培养基由溶质和溶剂组成的pH为7.3±0.2液体，所述溶剂为水，所述溶质浓度为胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L。
上述方法中，步骤I所述每个稀释倍数的根系浆状物以N张96孔细胞培养板培养，为将每个稀释倍数的根系浆状物加入到96孔细胞培养板中，每一个稀释倍数下做多个96孔细胞培养板的重复，封口放在室温下培养；所述N可为25-60，本发明实施例中具体为30。
上述方法中，步骤II所述采用两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增后结合Illumina Hiseq测序，具体步骤如下：
每孔培养细菌的模板DNA分别PCR，设置已知菌液为阳性对照、Nuclease-FreeWater为阴性对照；在第一轮PCR使用无Barcode的引物799F和1193R；扩增结束后，吸取阴、阳性对照的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照目的条带位置正确，阴性对照无条带，表明第一轮PCR扩增合格；
将第一轮每孔培养细菌的PCR扩增产物分别稀释40倍作为第二轮PCR扩增的模板，将第一轮的阳性对照的PCR产物和阴性对照的PCR产物分别稀释40倍作为第二轮的阳性对照和阴性对照的模板；使用799F-2和1193R-2作为引物，在目的片段的3’和5’端添加孔Barcode、板Barcode和Illumina测序所需序列；扩增结束后，吸取阴、阳性对照的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照目的条带位置正确，阴性对照物条带，表明第二轮PCR扩增合格；
完成两轮PCR扩增后，将所有培养细菌的第二步PCR产物混合后作为样本，在Hiseq2500平台上进行测序获得16S rRNA基因的V5-V7区域序列。
上述方法中，步骤III所述分析OTU表，数据以QIIME 1.9.1和USEARCH 10.0分析。
上述方法中，步骤IV所述进行细菌保存，具体方法为：每个细菌OTU均选代表株，取其低温保存的菌液分别划菌到1/2 TSB固体培养基上，封口在室温下培养；针对适宜在液体培养基生长的细菌和不适宜在液体培养基生长的细菌分别采用如下1)或2)的方法保存：
1)适宜在液体培养基生长的菌挑菌到1/2 TSB液体培养基中，28℃、220rpm培养后，低速离心浓缩，浓缩菌液与等体积80％甘油混合放置-80℃下保存；
2)不适宜在液体培养基生长的细菌挑菌到microbank菌保管内，放置-80℃下保存。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述分离培养番茄根系微生物组的方法获得的番茄根系微生物组，所述微生物为细菌。
上述分离培养番茄根系微生物组的方法以及上述番茄根系微生物组在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围，所述产品含有上述分离培养番茄根系微生物组的方法中进行细菌保存的任一种或多种细菌，或含有上述分离培养番茄根系微生物组的方法中的所述番茄根系微生物组；所述产品可为菌剂、或含有所述菌剂的微生态制剂、或含有所述菌剂或所述微生态制剂的生物肥料。
上述番茄根系微生物组在制备产品中的应用也属于本发明的保护范围，所述产品含有所述番茄根系微生物组；所述产品为菌剂、或含有所述菌剂的微生态制剂、或含有所述菌剂或所述微生态制剂的生物肥料。
所述产品还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述产品中，番茄根系微生物组或/和番茄根系微生物组的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述产品的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。根据需要，所述产品中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
本发明分离培养番茄根系微生物组的方法能够快速高效的分离培养番茄根系微生物组，为利用原位根系微生物制成菌肥从而提高番茄营养吸收、抵抗疾病等能力提供了良好的资源。
附图说明
图1为实施例1中两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增的流程示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从商业途径得到。
下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1
2019年在山东寿光进行本次实施例。
I、取番茄根系加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物；梯度稀释根系浆状物，每个稀释倍数的根系浆状物以N张96孔细胞培养板培养，每日观察，直至板上浑浊的孔不再增加为止；留30-50％的孔内浑浊的稀释倍数，该稀释倍数的每块板上每个浑浊孔内的菌液即为培养细菌；每孔培养细菌取部分菌液进行下一步细菌鉴定，剩余的菌液分别低温保存；所述N为大于等于2的自然数；具体步骤如下：
在番茄规模化栽培的寿光选4块不同实验田，实验田具体位置为北纬N：36°49′22.72″，东经E：118°52′56.34″；北纬N：36.797959°，东经E：118.862°；北纬N：36.825940°，东经E：118.882692°；北纬N：36.829552°，东经E：118.873562°。种植非嫁接的番茄苗，番茄品种为齐达利，种植过程中不使用化肥和农药。其中，第4块实验田(北纬N：36.829552°，东经E：118.873562°)上所种番茄植株健康长势良好，挖第4块实验田上种植的番茄根系。
以下步骤在无菌条件下进行。
从番茄根茎连接处开始剪下距离其10cm以内的侧根，先以无菌水冲净，再以1×PBS缓冲液清洗3次，每次以180rpm的转速清洗15min(如此清洗后留下的为根系内生细菌及根表紧密着生的细菌)，洗净后去除杂质，吸干残留液体后，将侧根剪碎，称取0.02g，加200微升的10mM MgCl2，研磨为匀浆，转入25mL的10mM MgCl2中静置15min，混匀，得到根系浆状物。
以1/10×TSB液体培养基将根系浆状物分别稀释2000倍、6000倍、18000倍，分别得到根系浆状物2000倍稀释液、6000倍、18000倍。所述1/10×TSB液体培养基由溶质和溶剂组成的pH为7.3±0.2液体，所述溶剂为水，所述溶质为胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L。
将根系浆状物2000倍稀释液、根系浆状物6000倍稀释液和根系浆状物18000倍稀释液分别加入到96孔细胞培养板中，每一个稀释倍数下做30板重复，每块96孔细胞培养板封口放在室温(25℃)下培养，每日观察，直至板上浑浊的孔不再增加为止，此时已室温培养大约3周(培养时间不宜超过4周，以避免板中边缘孔变干)。
培养孔的孔内浑浊，表明有细菌生长。孔浑浊比例与单菌出现呈泊松分布，当有30-50％的孔浑浊时，每个孔是单菌的可能性最大。根系浆状物6000倍稀释液，其30板共2880个培养孔，其中有1008个培养孔的孔内浑浊，表明有细菌生长，占总培养孔的35％，留下该稀释倍数1008个浑浊培养孔的培养细菌。
每孔培养细菌取部分菌液进行下一步细菌鉴定；每孔内剩余的菌液按照体积比1:1加入80％(v/v)的甘油，放置于-80℃保存备用，一共保存1008个孔的菌液。
II、将每孔培养细菌分别提取模板DNA后，采用两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增后结合Illumina Hiseq测序得出每孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列；
所述两轮标记引物的聚合酶链式反应技术，第一轮使用无Barcode的799F和1193R作为引物，第二轮使用799F-2和1193R-2作为引物；
所述799F为核苷酸序列是序列1的单链DNA，所述1193R为核苷酸序列是序列2的单链DNA，所述799F-2和1193R-2选自下述A或B的引物：
A、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA；
B、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA；
所述96个孔barcode是用于标记在一张96孔板上的96个孔的标记，所述96个孔barcode的核苷酸序列均不相同，所述M个板barcode是用于标记所述N张96孔板的标记，所述M个板barcode的核苷酸序列均不相同；所述M为大于等于所述N的自然数；本实施例中引物选用A，M为48。具体步骤如下：
a)将1008个孔的培养细菌分别提取模板DNA，以碱性裂解法提取，具体为：将10μL缓冲液I加入6μL菌液中，在95℃下提取30分钟，然后加入10μL缓冲液II，得到各孔的模板DNA；所述缓冲液I的溶质为25mM NaOH和0.2mM EDTA，溶剂为水，pH12；所述缓冲液II为40mMTris HCl，pH7.5。一共提取了1008份模板DNA。
b)每份DNA分别采用两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增，具体流程见图1，所述两轮标记引物的聚合酶链式反应技术，流程图见图1，第一轮使用无Barcode的799F和1193R作为引物，第二轮使用带有Barcode(板Barcode的和孔Barcode)和Illumina测序所需序列的799F和1193R作为引物。
具体步骤如下：
1008份模板DNA分别PCR，设置已知菌液大肠杆菌DH5α(天根生化科技有限公司(TIANGEN BIOTECH))为阳性对照、无核酸酶水(Nuclease-Free Water)为阴性对照；为了富集目的片段，在第一轮PCR使用无Barcode的引物799F和1193R(Life Technologies公司)：
799F：5’-AACMGGATTAGATACCCKG-3’(序列表中序列1)；其中，K为T或G。
1193R：5’-ACGTCATCCCCACCTTCC-3’(序列表中序列2)。
PCR反应体系共30uL：无核酸酶水(Nuclease-Free Water)20.85μL、抗Taq单克隆抗体和rTaq酶的混合制品(Taq Hot Start Version)0.15μL(5U/μL)、10×PCR Buffer(含Mg2+)3μL Plus、脱氧核苷酸混合物(dNTP Mixture)(各2.5mM)2.4μL、10pmol/μL的正反向引物各0.3μL、模板DNA 3μL。反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增30个循环。扩增结束后，吸取阴、阳性对照的PCR产物各5μL，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明阳性对照目的条带均位置正确，阴性对照均无条带，表明第一轮PCR扩增合格。
将第一轮每孔培养细菌的PCR扩增产物分别用Nuclease-Free Water稀释40倍(2μL第一轮PCR扩增的产物添加78μL Nuclease-Free Water)，作为第二轮PCR扩增的模板。将第一轮的阳性对照的PCR产物和阴性对照的PCR产物分别稀释40倍作为第二轮的阳性对照和阴性对照的模板；使用799F-2和1193R-2作为引物，在目的片段的3’和5’端添加孔Barcode、板Barcode和Illumina测序所需序列。
正向引物799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA，其结构从5’端到3’端依次为P5-Read1-孔Barcode-799F：P5的序列为5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3’，Read1的序列为
Figure BDA0002489617200000071
孔Barcode根据每孔培养细菌的孔在板上的具体位置确定，799F的序列为
Figure BDA0002489617200000072
(K为T或G)，具体的正向引物799F-2根据该孔在96孔板上的位置选自表1中96种799F-2。
反向引物1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA，为带有Illumina测序所需序列且含有板barcode的1193R，其结构从5’端到3’端依次为P7-Index-Read2-板Barcode-1193R：P7的序列为
Figure BDA0002489617200000073
Index的序列为5’-CGTGAT-3’，Read2的序列为
Figure BDA0002489617200000081
板Barcode根据每孔培养细菌的在哪一块板上具体确定，1193R的序列为
Figure BDA0002489617200000082
具体的反向引物1193R-2序列根据该孔在哪张板上选自表1中48种1193R-2。
表1第二轮PCR引物序列(从5’端到3’端)
Figure BDA0002489617200000083
Figure BDA0002489617200000091
Figure BDA0002489617200000101
Figure BDA0002489617200000111
Figure BDA0002489617200000121
Figure BDA0002489617200000131
Figure BDA0002489617200000141
PCR反应体系共30μL：Nuclease-Free Water 20.25μL、Taq Hot Start Version0.15μL(5U/μL)、10×PCR Buffer(含Mg2+)3μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.4μL、10pmol/μL的正向引物0.6μL、10pmol/μL反向引物0.6μL、稀释后的第一轮PCR产物3μL。反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，扩增25个循环。扩增结束后，吸取阴、阳性对照的PCR产物各5μL，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照目的条带位置正确，阴性对照物条带，表明第二轮PCR扩增合格。
c)第二轮PCR扩增产物进行Illumina Hiseq测序，得出每孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列。具体如下：完成两轮PCR扩增后，将每板96孔细胞培养板1-12列的PCR产物混合至第1行的12个孔中，然后从12个孔中各吸取120μL的PCR产物混合至一个2mL无菌离心管作为一管样品，将3管样品混为一个待切胶，加入15μL上样缓冲液(LoadingBuffer)进行切胶回收；通过PicoGreen荧光染料法定量切胶回收的DNA浓度，以将等量DNA混合后作为样本，在Hiseq 2500平台上进行测序，获得16S rRNA基因的V5-V7区域序列，具体测序过程委托华大公司，共得到1008个孔16S rRNA基因的V5-V7区域序列。
III、将步骤III所得的1008个孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列与RDP数据库中已知细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列进行比对，聚类相似度在97％以上的属于同一种细菌OTU，记录每孔培养细菌所属的细菌OTU，共比对得出474个培养孔的细菌OTU，生成OTU表，数据经QIIME 1.9.1和USEARCH 10.0分析，属于312个不同的细菌OTU，主要属于5个菌门，其具体比例为：变形菌门(Proteobacteria)：放线菌门(Actinobacteria)：拟杆菌门(Bacteroidetes)：厚壁菌门(Firmicutes)：绿弯菌门(Chloroflexi)＝25：14：3：1：1。
V、番茄根系微生物组构建
1、312个细菌OTU从低温保存的培养细菌中选代表株进行细菌保存，具体方法为：将非冗余的细菌OTU代表株对应的保种划菌到1/2TSB固体培养基上，封口在室温(25℃)下培养至板上长出单菌落(大约需3-5天)，再转板2次，共纯化3次；针对适宜在液体培养基生长的菌和不适宜在液体培养基生长的菌分别采用如下1)或2)的方法保存：
1)适宜在液体培养基生长的菌挑菌到1/2TSB液体培养基(30mL)中，28℃、220rpm培养至液体浑浊(但不能摇太久，菌容易变老死亡，大约5-7天即可)，对50mL离心管中培养的细菌进行低速离心，离心后的菌液弃掉上清至余下溶液5mL，混匀菌液得到浓缩菌液，并将650μL浓缩菌液与等体积80％甘油混合，放置-80℃下进行细菌保存；
2)不适宜在液体培养基生长的细菌挑取固体培养基上的单菌落到microbank菌保管内，放置-80℃下进行细菌保存。
2、与Sanger测序的一致性：
提取312个菌保的细菌DNA作为模板，将10μL缓冲液I(25mM NaOH和0.2mM EDTA，pH12)加入6μL细菌培养物中，在95℃下提取30分钟，然后加入10μL缓冲液II(40mM Tris HCl，pH 7.5)作为模板DNA。使用引物27F和1492R进行PCR扩增16S rRNA基因全长，PCR扩增使用16S rRNA基因全长引物27F和1492R：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应体系共30μL：Nuclease-Free Water 20.25μL、Taq Hot Start Version0.15μL(5U/μL)、10×PCR Buffer(含Mg2+)3μL、dNTP Mixture(各2.5mM)2.4μL、10pmol/μL的正反向引物各0.6μL、模板DNA 3μL。
反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，扩增35个循环。
以1492R为测序引物进行反向Sanger测序，所测序列的V5-V7区域序列与该细菌在步骤III中测定的16S rRNA基因的V5-V7区域序列相同则为高质量的细菌菌保(合格的标准为序列100％相同)，一共鉴定出合格的菌保284管。
3、组成番茄根系微生物组
从中选属于变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi)的代表株，将其菌保复苏培养后，做成高质量的菌保用于后续实验。再按照变形菌门(Proteobacteria)：放线菌门(Actinobacteria)：拟杆菌门(Bacteroidetes)：厚壁菌门(Firmicutes)：绿弯菌门(Chloroflexi)＝25：14：3：1：1的比例混合，组成番茄根系微生物组，所述微生物为细菌。
结果与分析
本实施例共分离培养了30个96孔细胞培养板，共有2880个培养孔，其中1,008个培养孔中有细菌生长，占总培养孔的35％。得到了474个OTU，主要属于5个菌门：变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi)。最终，复苏了312个候选培养孔，制得高质量(高质量的评判标准浓度合适、sanger测序序列跟分离检测的16S系列100％相同)纯菌菌保284管，并按照变形菌门(Proteobacteria)：放线菌门(Actinobacteria)：拟杆菌门(Bacteroidetes)：厚壁菌门(Firmicutes)：绿弯菌门(Chloroflexi)＝25：14：3：1：1的比例混合组成了番茄根系微生物组。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> 一种分离培养番茄根系微生物组的方法及所得番茄根系微生物组
<130> GNCSY200473
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacmggatta gataccckg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgtcatccc caccttcc 18

Claims (10)

1.一种分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：包括如下步骤：
I、取番茄根系加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物；梯度稀释根系浆状物，每个稀释倍数的根系浆状物以N张96孔细胞培养板培养，每日观察，直至板上浑浊的孔不再增加为止；留30-50％的孔内浑浊的稀释倍数，该稀释倍数的每块板上每个浑浊孔内的菌液即为培养细菌；每孔培养细菌取部分菌液进行下一步细菌鉴定，剩余的菌液分别低温保存；所述N为大于等于2的自然数；
II、将每孔培养细菌分别提取模板DNA后，采用两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增后结合Illumina Hiseq测序得出每孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列；
所述两轮标记引物的聚合酶链式反应技术，第一轮使用无Barcode的799F和1193R作为引物，第二轮使用799F-2和1193R-2作为引物；
所述799F为核苷酸序列是序列1的单链DNA，所述1193R为核苷酸序列是序列2的单链DNA，所述799F-2和1193R-2选自下述A或B的引物：
A、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA；
B、所述799F-2为在所述799F上连接Illumina测序所需序列以及M个板barcode中的一种得到的M种单链DNA，所述1193R-2为在所述1193R上连接Illumina测序所需序列以及96个孔barcode中的一种得到的96种单链DNA；
所述96个孔barcode是用于标记在一张96孔板上的96个孔的标记，所述96个孔barcode的核苷酸序列均不相同，所述M个板barcode是用于标记所述N张96孔板的标记，所述M个板barcode的核苷酸序列均不相同；所述M为大于等于所述N的自然数；
III、将每孔培养细菌的16S rRNA基因的V5-V7区域序列与RDP数据库中已有细菌的16SrRNA基因的V5-V7区域序列进行比对，聚类相似度在97％以上的属于同一种细菌OTU，得到记录有每孔培养细菌所属细菌OTU的OTU表；分析OTU表，得出所有培养细菌的细菌OTU所属的门和/或高丰度属，并得到不同门和/或高丰度属的包含的培养细菌数的比例；
IV、每个细菌OTU从低温保存的培养细菌中选代表株进行细菌保存，从中选属于不同门和/或高丰度属的代表株复苏培养后，按照步骤III所得的比例混合，组成番茄根系微生物组；所述微生物为细菌。
2.根据权利要求1所述的分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：步骤I所述取番茄根系加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物为从番茄根茎连接处开始剪下距离其10cm以内的侧根，洗净，去除杂质，吸干残留液体后，将侧根剪碎，加入10mM MgCl2溶液研磨获得根系浆状物。
3.根据权利要求1或2所述的分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：步骤I所述梯度稀释，为以1/10×TSB液体培养基将根系浆状物分别稀释2000倍、6000倍以及18000倍；所述1/10×TSB液体培养基由溶质和溶剂组成的pH为7.3±0.2液体，所述溶剂为水，所述溶质浓度为胰蛋白胨17.0g/L、大豆木瓜酶消化物3.0g/L、氯化钠5.0g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、葡萄糖2.5g/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：步骤I所述每个稀释倍数的根系浆状物以N张96孔细胞培养板培养，为将每个稀释倍数的根系浆状物加入到96孔细胞培养板中，每一个稀释倍数下做多个96孔细胞培养板的重复，封口放在室温下培养；所述N为25-60。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：步骤II所述采用两轮标记引物的聚合酶链式反应技术扩增后结合Illumina Hiseq测序，具体步骤如下：
每孔培养细菌的模板DNA分别PCR，设置已知菌液为阳性对照、Nuclease-Free Water为阴性对照；在第一轮PCR使用无Barcode的引物799F和1193R；扩增结束后，吸取阴、阳性对照的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照目的条带位置正确，阴性对照无条带，表明第一轮PCR扩增合格；
将第一轮每孔培养细菌的PCR扩增产物分别稀释40倍作为第二轮PCR扩增的模板，将第一轮的阳性对照的PCR产物和阴性对照的PCR产物分别稀释40倍作为第二轮的阳性对照和阴性对照的模板；使用799F-2和1193R-2作为引物，在目的片段的3’和5’端添加孔Barcode、板Barcode和Illumina测序所需序列；扩增结束后，吸取阴、阳性对照的PCR产物，经琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照目的条带位置正确，阴性对照物条带，表明第二轮PCR扩增合格；
完成两轮PCR扩增后，将所有培养细菌的第二步PCR产物混合后作为样本，在Hiseq2500平台上进行测序获得16S rRNA基因的V5-V7区域序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：步骤III所述分析OTU表，数据以QIIME 1.9.1和USEARCH 10.0分析。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离培养番茄根系微生物组的方法，其特征在于：步骤IV所述进行细菌保存，具体方法为：每个细菌OTU均选代表株，取其低温保存的菌液分别划菌到1/2TSB固体培养基上，封口在室温下培养；针对适宜在液体培养基生长的细菌和不适宜在液体培养基生长的细菌分别采用如下1)或2)的方法保存：
1)适宜在液体培养基生长的菌挑菌到1/2TSB液体培养基中，28℃、220rpm培养后，低速离心浓缩，浓缩菌液与等体积80％甘油混合放置-80℃下保存；
2)不适宜在液体培养基生长的细菌挑菌到microbank菌保管内，放置-80℃下保存。
8.权利要求1-7任一项所述分离培养番茄根系微生物组的方法获得的番茄根系微生物组，所述微生物为细菌。
9.权利要求1-7任一项所述分离培养番茄根系微生物组的方法在制备产品中的应用，其特征在于：所述产品含有所述分离培养番茄根系微生物组的方法中进行细菌保存的任一种或多种细菌，或含有所述分离培养番茄根系微生物组的方法中的所述番茄根系微生物组；所述产品为菌剂、或含有所述菌剂的微生态制剂、或含有所述菌剂或所述微生态制剂的生物肥料。
10.权利要求8所述的番茄根系微生物组在制备产品中的应用，其特征在于：所述产品含有所述番茄根系微生物组；所述产品为菌剂、或含有所述菌剂的微生态制剂、或含有所述菌剂或所述微生态制剂的生物肥料。
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