CN116574610B - 用于高通量分离作物根际细菌的培养基及其制备方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环境微生物学的技术领域，具体涉及一种用于高通量分离作物根际细菌的培养基及其制备方法、应用。用于高通量分离作物根际细菌的培养基包括1/10 TSB培养基和培养基添加液；培养基添加液由作物植株与TSB培养基混合，经粉碎、发酵、过滤除菌制得。该培养基基于根际微生物组中多物种互作理论，利用多种微生物间互作网络，将作物源营养成分使用根际原位的微生物组发酵，发酵产物作为根际微生物分离的碳源和氮源，最大限度地模拟根际微生物的原位环境，从而获得更多的微生物种类。与现有培养基相比，本发明提供的培养基能够获得更多种类的细菌门类，结合高通量分离方法，能够获得通过高通量测序获得种类超60%的细菌种类。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物学的技术领域，具体涉及一种用于高通量分离作物根际细菌的培养基及其制备方法、应用。
背景技术
作物根际为大量微生物提供了重要的栖息场所，尤其是根系产生的分泌物可以作为多种微生物的碳源和氮源，因此在作物根际富集了大量的微生物，如丝状真菌、酵母、放线菌和细菌等，这些微生物被统称为根际微生物组，它们在促进作物养分吸收、提高作物抗胁迫能力、促进增产等方面发挥着重要作用。
近年来，随着高通量测序技术的发展，科研工作者对根际微生物多样性的了解越来越透彻，尤其是依托宏基因组学技术，对根际微生物组的功能有了更加深入的了解。作为重要的作物益生菌菌种资源库，越来越多的科研工作者也依托高通量测序数据对作物根际细菌进行分离，期望从中筛选出能够用于大田种植的有益菌株，达到减轻病虫害和作物增产的目的。目前应用比较广泛的高通量方法为刘永鑫等人开发的基于有限稀释的根际细菌分离方法（Zhang, J., Liu, YX., Guo, X. et al. High-throughput cultivation andidentification of bacteria from the plant root microbiota.Nat Protoc16, 988–1012 (2021)），并且中国专利CN111518729A公开了一种作物根系微生物组高通量分离培养方法，可以用较少人力、在较短时间内分离培养大量的细菌，并通过“一键式”序列分析流程快速鉴定细菌的种类，且可组配作物根系微生物组，为获得更多的作物根系微生物资源提供了技术支持。但是该方法分离培养得到的水稻根系细菌约占水稻根系细菌种类总数的60%，分离培养得到的拟南芥根系细菌约占拟南芥根系细菌种类的58%。为了提高分离到的根际细菌种类数量，亟需开发新的培养基来满足高通量分离根际微生物的需求。
发明内容
为了提高使用高通量分离培养方法获得的作物根际微生物种类数量，本发明提供用于高通量分离作物根际细菌的培养基及其制备方法和应用。
第一方面，本发明提供一种用于高通量分离作物根际细菌的培养基，包括1/10TSB培养基和培养基添加液；培养基添加液由作物植株与TSB培养基混合，经粉碎、发酵、过滤除菌制得，作物为黄瓜。
进一步的，1/10 TSB培养基与培养基添加液的比例为1:1。
第二方面，本发明提供一种上述培养基的制备方法，包括：配制琼脂水溶液，高温灭菌；将1/10 TSB培养基、培养基添加液与琼脂水溶液混匀，琼脂终浓度为1.2%，冷凝后制得培养基平板。
进一步的，培养基添加液的制备方法具体包括：
将需要分离的作物整株植株与1/10 TSB培养基按照质量之比为1:1~10混合并粉碎后，置于4~25℃下发酵12h，对发酵物过滤除菌后即得。
进一步的，在培养基中按照常规方法加入不同种类的抗生素以抑制非靶标微生物类群的生长，常用的抗生素包括制霉菌素、放线菌酮、青霉素、四环素、硫酸链霉素、氨苄青霉素等。
第三方面，本发明提供一种上述培养基在高通量分离培养作物根际微生物方面的应用。
进一步的，在无菌条件下，研磨作物根系样本得到匀浆液，将匀浆液使用上述培养基充分稀释后转移至96孔板中培养，直至96孔板中浑浊孔的数目不再增加，提取浑浊孔内微生物的基因组DNA，进行高通量测序分析，得到作物根系微生物组。
进一步的，稀释倍数为96孔板中浑浊孔数目最终为30~35个。
进一步的，匀浆液的具体操作为：采集作物根系样本，用无菌水冲洗根系，将根系转移至新的离心管中，加入30mL的10mM氯化镁溶液；将离心管放置摇床，重复洗3次，拿出后无菌滤纸吸干根上液体；无菌剪刀将根剪碎混合均匀，称取0.02g根系组织放入1.5mL离心管；1.5mL离心管中加入1mL无菌氯化镁溶液，500μL氯化镁溶液用来磨根，500μL氯化镁溶液用来冲洗研磨棒，磨至匀浆状；将匀浆液移至加入盛有25mL 10mM氯化镁的50mL离心管中，混匀备用。
进一步的，培养添加液由100mL 1/10 TSB培养基混合65g带根的黄瓜幼苗充分粉碎后，于10℃保温发酵12h，过滤除菌制得。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的用于高通量分离作物根际细菌的培养基，基于根际微生物组中多物种互作理论，利用多种微生物间互作网络，将作物源营养成分使用根际原位的微生物组发酵，发酵产物作为根际微生物分离的碳源和氮源，最大限度地模拟根际微生物的原位环境，从而获得更多的微生物种类。
与现有培养基相比，本发明提供的培养基能够获得更多种类的细菌门类，结合高通量分离方法，能够获得通过高通量测序获得种类超60%的细菌种类，而常规分离培养方法只能获得10%~15%的细菌种类。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明测试例1中用不同培养基平板分离黄瓜根际细菌后的菌落生长情况照片。
图2是本发明测试例1中用不同培养基平板分离黄瓜根际细菌的菌落数和种类数结果图;其中图A为不同培养基平板分离黄瓜根际细菌的菌落数结果；图B为同培养基平板分离黄瓜根际细菌的种类数结果；箱形图中，有相同标记字母的即为差异不显著，有不同标记字母的即为差异显著。
图3是本发明测试例1中收集平板菌落进行高通量测序得到的群落组成图。
图4是本发明测试例2中高通量分离培养获得的黄瓜根际细菌属水平数量结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
1. 制备培养基添加液
收集需要带根的黄瓜幼苗，抖落根部土壤后，使用无菌水冲洗根部，洗掉附着的泥土；将50g洗净的带根黄瓜幼苗与100mL 1/10 TSB培养基混合、充分粉碎，于10℃保温发酵12h，发酵液使用折叠后7层的纱布过滤，随后使用单层滤纸过滤三次，最后将滤液使用0.22μm无菌滤器抽滤除菌后得到培养基添加液A。
2. 制备培养基
配制琼脂水溶液，高温灭菌；将1/10 TSB培养基、培养基添加液A与琼脂水溶液混匀，1/10 TSB培养基和培养基添加液A比例为1:1，琼脂终浓度为1.2%，冷凝后制得培养基平板A。
实施例2-6
与实施例1的不同之处在于：实施例2-6使用的带根黄瓜幼苗重量、发酵条件和发酵时间如表1所示，其它处理同实施例1，制备培养基添加液B-F，然后制得培养基平板B-F。
表1 实施例1-6培养基添加液的原料用量及发酵条件
测试例1黄瓜根际细菌分离培养试验
（1）试验共需要8种培养基平板：一种为1/10 LBA培养基平板，一种为1/10 TSA培养基平板，琼脂浓度为1.2%；其余六种培养基分别为实施例1-6制备的培养基平板A-F。
（2）取样：于日光温室中采集定殖60日的黄瓜植株，采集后剪掉植株地上部分，抖落附着于根部土壤，剪取部分主根、侧根以及不定根10g至灭菌50 mL离心管，每采集完一棵植株后，剪刀均使用75%乙醇消毒并使用灭菌水冲洗3次后再使用。采集完毕后，装有样本的离心管置于冰盒内转运至实验室。每个样品管内加入灭菌1×PBS缓冲液35mL，置于摇床中180r/min清洗20min后，使用无菌滤纸吸干根表面水分，如此反复清洗3次。
（3）分离培养：准确称取清洗后的根系样本0.02g，加入灭菌1×PBS缓冲液1mL充分研磨，然后使用1×PBS缓冲液10倍梯度稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，每个浓度用移液枪移取25μL滴加到8种培养基平板上，立即用无菌三角形玻璃涂布棒涂布均匀，待菌液充分吸收后封口膜封口，倒置于28℃培养36h后，统计每个平板菌落数。每个稀释浓度每种培养基涂布6个平板。其中，在稀释1000倍的条件下，8种培养基平板上菌落生长情况表如图1所示，培养基平板A-F长出的菌落明显多于1/10 LBA培养基和1/10 TSA培养基。稀释1000倍的平板计数结果如表2和图2A所示，可见不同培养基上长出的菌落数量显著不同（F7.16=15.247，p<0.001），培养基平板D上长出的菌落数最多。
表2 不同培养基平板上长出的菌落数
（4）种类鉴定：选择颜色、大小、厚度、透明度和质地不同的菌落，在TSA培养基上用接种环采用三区划线法进行纯化和培养，得到菌株后反复划线三次得到纯菌株。根据菌落形态对菌株进行分组。选取代表性菌株分别接种至装有2mL TSB液体培养基的试管中，28℃、180r/min培养12h。之后转移1mL菌液到2mL离心管，13000r/min离心2min后收集菌体，使用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，随后使用27F和1492R对细菌16S rRNA基因进行扩增。PCR反应体系（25μL）：DNA 1μL（20ng），引物各0.5μL，2×TaqPCR Buffer 12.5μL，ddH2O10.5μL。PCR扩增程序：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 90s，35个循环；72℃ 10min。PCR产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，片段大小为1500bp左右的样品送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，平台为Roche 454。所得序列与GenBank中亲缘关系较近的菌株进行序列比较进行细菌种类鉴定，统计每个平板所分离的细菌的种类，结果如表3和图2B所示，可见培养基平板D上长出的细菌种类最多。
表3 不同培养基平板上长出的细菌种类数
（5）高通量扩增子测序检测
将所有稀释倍数的长有菌落的培养基平板D和1/10 TSA培养基平板分别使用3mL无菌水充分冲洗，收集表面的菌体后混合，提取总DNA，使用特异引物799F和1193R扩增根际细菌16S rRNA的V5-V7区，PCR产物5’端添加barcode序列（上海美吉生物医药科技有限公司提供）。PCR反应体系（50μL）：DNA模板5μL（10ng），引物各1.5μL，2mmol/L dNTPs 5μL，MgSO42μL，10× KOD Buffer 5μL，KOD Plus 1μL，ddH2O补足至50μL。PCR扩增程序：94℃ 2min；94℃ 30s，63℃ 30s，68℃ 30s，30个循环；68℃ 5min。
每个样品3次重复，将3次PCR产物混合用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，送上海美吉生物医药科技有限公司进行建库测序，测序平台为Illumina Miseq PE250。测序数据使用上海美吉生物医药科技有限公司的“生信云”平台（www.majorbio.com）进行分析。在云平台中，使用QIIME v.1.9.1（QuantitativeInsights Into Microbial Ecology）软件包对测序数据进行质控检测和数据分析。数据处理前，剔除测序数据中长度低于200bp、含有模糊碱基以及引物的错配数在2个碱基以上的序列。筛选后的序列用USEARCH软件包中的UPARS按照97%相似性阈值对序列进行OTU聚类，选取丰度最高的序列作为该OTU的代表性序列并使用RDP classifier v.2.2进行分类学分析，使用SILVA数据库（http://www.arb-silva.de）将置信阈值设为70%进行分类学注释，统计不同分类水平下各个样本的OTU组成和reads数。由于测序平台和注释数据库的限制，本试验中部分序列不能注释到种，因此根据各序列信息使用FastTree 2.1.3在属水平构建物种组成的最大似然树，并统计在属水平上的reads数作为物种丰度。最终结果如图3所示，在培养基平板D上总共检测到29个属的细菌，在1/10 TSA培养基平板上总共检测到18个属的细菌。
测试例2高通量分离培养和鉴定黄瓜根系细菌
采集黄瓜根系样本，用无菌水冲洗根系，将根系转移至新的离心管中，加入30mL的10mM氯化镁溶液；将离心管放置摇床，重复洗3次，拿出后无菌滤纸吸干根上液体；无菌剪刀将根剪碎混合均匀，称取0.02g根系组织放入1.5mL离心管；1.5mL离心管中加入1mL无菌氯化镁溶液，500μL氯化镁溶液用来磨根，500μL氯化镁溶液用来冲洗研磨棒，磨至匀浆状；将匀浆液移至加入盛有25mL 10mM氯化镁的50mL离心管中，混匀备用。
本试验共设置三个组，即对照组1、对照组2和试验组，每组设置3个重复，取平均值。各组处理方式如下：
①对照组1：提取匀浆液中的总DNA，随后参照测试例1中“（5）高通量扩增子测序检测”方法对黄瓜根际样本中的细菌种类数进行检测，作为对照组1（即图4中Ampliconsequencing）；
②对照组2：将匀浆液使用1/10 TSB培养基充分稀释后转移至96孔板中培养，直至96孔板中浑浊孔的数目不再增加，稀释倍数为96孔板中浑浊孔数目最终为30~35个；提取浑浊孔内微生物的基因组DNA，采用双侧标签PCR扩增法高通量鉴定分离培养细菌的16S rRNA基因，得到黄瓜根系微生物组（即图4中1/10 TSB）；
③试验组：将匀浆液使用实施例4制备的培养基平板D充分稀释后转移至96孔板中培养，直至96孔板中浑浊孔的数目不再增加，稀释倍数为96孔板中浑浊孔数目最终为30~35个；提取浑浊孔内微生物的基因组DNA，采用双侧标签PCR扩增法高通量鉴定分离培养细菌的16S rRNA基因，得到黄瓜根系微生物组（即图4中的D）。
对照组2和试验组的高通量分离黄瓜根际细菌和测试方法具体参考刘永鑫等人的方法（Zhang, J., Liu, Y.-X., Guo, X., Qin, Y., Garrido-Oter, R., Schulze-Lefert, P. and Bai, Y. (2021). High-throughput cultivation and identificationof bacteria from the plant root microbiota.Nat Protoc16(2): 988-1012.）。
上述三组的结果如图4所示，在属水平上，使用高通量扩增子测序方法总共检测到100.3个属的细菌，使用1/10 TSB培养基总共分离到39.0个属的细菌，使用实施例4制备的培养基平板D总共分离到62.3个属的细菌，且三种方式检测到的细菌种类数差异显著，（F2,6=79.34，p<0.001）。高通量扩增子测序方法几乎可以检测到样本中所有的细菌种类，但不能够获得纯菌株；使用梯度稀释法结合1/10 TSB培养基分离到的种类显著低于本发明技术方案，本发明技术方案能够分离到的细菌种类数高出59.7%。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种用于高通量分离作物根际细菌的培养基，其特征在于，包括1/10 TSB培养基和培养基添加液；培养基添加液由100mL 1/10 TSB培养基混合65g带根的黄瓜幼苗充分粉碎后，于10℃保温发酵12h，过滤除菌制得；作物为黄瓜。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，1/10 TSB培养基与培养基添加液的质量之比为1:1。
3.一种如权利要求1所述培养基的制备方法，其特征在于，包括：配制琼脂水溶液，高温灭菌；将1/10 TSB培养基、培养基添加液与琼脂水溶液混匀，琼脂终浓度为1.2%，冷凝后制得培养基平板。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在培养基中加入抗生素以抑制非靶标微生物类群的生长。
5.一种如权利要求1所述培养基在高通量分离培养作物根际微生物方面的应用，其特征在于，作物为黄瓜。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，在无菌条件下，研磨作物根系样本得到匀浆液，将匀浆液使用如权利要求1所述的培养基充分稀释后转移至96孔板中培养，直至96孔板中浑浊孔的数目不再增加，提取浑浊孔内微生物的基因组DNA，进行高通量测序分析，得到作物根系微生物组。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，稀释倍数为96孔板中浑浊孔数目最终为30~35个。
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