CN116286432A - 一种能够降解畜禽废水中cod的人参土芽孢杆菌h3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3及其应用，涉及畜禽废水处理技术领域。该菌种于2022年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.24680。本发明筛选获得了一株新的菌株，该菌株经过16S rDNA分子鉴定为人参土芽孢杆菌(Bacillus ginsengihumi)，该菌株具有生长迅速、能降解畜禽废水中高浓度COD的性能，该菌株能够实现畜禽废水的资源化利用，解决了高浓度COD的畜禽废水处理难度大，易造成环境污染的问题。
Description
技术领域
本发明属于畜禽废水处理技术领域，特别是涉及一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3及其应用。
背景技术
随着生活条件的提高，人们对于畜禽肉蛋的需求量也越来越大，饲养的畜禽数量的增加，导致其产生的粪污量也越来越多，加之畜禽粪污处理不当，从而造成环境污染。集中排放的畜禽粪污量远远超过所处地区土壤和植物的净化能力，造成了严重的环境污染，破坏了生态平衡。
畜禽废水属于高氨氮高COD浓度有机废水，成分复杂。畜禽废水是畜禽养殖废弃物中当属最难处理的，所以畜禽废水的处理是实现养殖废弃物资源化处理的关键，目前针对畜禽废水中高浓度COD的处理方法有化学法和微生物降解法，而微生物降解法需要借助降解菌种的代谢活动实现畜禽废水中COD的降解去除。为了解决目前畜禽废水中高浓度COD处理难度大的问题，现分离筛选出一种专用于降解畜禽养殖废水中高浓度COD的菌株，以实现畜禽废水中COD的高效降解。
发明内容
为了解决目前畜禽废水中高浓度COD处理难度大，易造成环境污染，不利于实现畜禽废水的资源化利用问题，本发明提供了一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3及其应用，该菌株能够以畜禽废水中的高浓度有机物为养料进行代谢分解，一定程度上解决了畜禽废水处理难度大的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3，其是从畜禽废水中分离得到的，该菌株已经于2022年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心，邮编100101)，保藏编号CGMCC NO.24680，经鉴定为Bacillus(芽孢杆菌属)，推测为Bacillus ginsengihumi(人参土芽孢杆菌)。
优选地，本发明一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3经革兰氏染色为紫色，为革兰氏阳性菌。
优选地，本发明一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3是从畜禽废水中筛选出来的。
优选地，本发明一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3的分离纯化方法为：①吸取1mL畜禽废水，依照梯度稀释法稀释至10-5、10-6、10-7倍，取各稀释液100μL分别涂布于麦氏固体培养基中，于37℃无菌环境下培养℃无菌环境下培养2天；②将涂布得到的不同形态的菌落挑出，接种到麦氏液体培养基中，在摇床温度30℃、转速140r/min的条件下培养的条件下培养1天；③吸取l mL经步骤②培养一天后的液体溶液，按照梯度稀释法分别稀释至10-5、10-6、10-7倍，取各稀释液100μL分别涂布于新的固体培养基平板上培养，重复操作多次，直到分离纯化出单一菌株后于甘油中进行保存。
优选地，本发明还提供了一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3在高COD浓度畜禽废水中的应用。
最优地，所述应用是将所述人参土芽孢杆菌H3分别接种到7000mg/L、9000mg/L、11000mg/L和13000mg/L的高COD浓度的畜禽废水中，45h后分别检测分析接种有人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率以及未接种人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率，接种有人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率达到90％以上，高于未接种人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选获得了一株新的菌株，该菌株经过16S rDNA分子鉴定为人参土芽孢杆菌(Bacillus ginsengihumi)，该菌株具有生长迅速、能降解畜禽废水中高浓度COD的性能，该菌株能够实现畜禽废水的资源化利用，解决了高浓度COD的畜禽废水处理难度大，易造成环境污染的问题。
2、本发明中的人参土芽孢杆菌H3的培养条件简单，且成本低、效率高、无二次污染，扩大培养后可用于高氨氮高COD浓度有机废水的高效处理，具有很好的工程应用前景。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明中人参土芽孢杆菌H3的菌落特征图。
图2为本发明中人参土芽孢杆菌H3经革兰氏染色后的菌落图。
图3为人参土芽孢杆菌H3培养过程中的菌落的生长曲线图。
图4为人参土芽孢杆菌H3应用时畜禽废水中COD的降解图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1人参土芽孢杆菌H3的筛选、分离和纯化
一、人参土芽孢杆菌H3的筛选
从畜禽废水储水池中吸取一定量的畜禽废水，经革兰氏染色法进行染色处理，该菌菌落特征见图1所示，菌落表面光滑有光泽，整体呈不规则形状，亮白色，边缘半透明，革兰氏染色为紫色，为革兰氏阳性菌，该菌染色特征见图2所示，然后将该初步识别出的菌落置于初步液体培养基中进行前期培养，该初步液体培养基具体为：葡萄糖10g、无水乙酸钠8.2g、酵母膏2.5g、氯化钾1.8g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，自然pH，使得该菌株在此液体培养基中得到大量繁殖，便于后续的分离纯化。
二、人参土芽孢杆菌H3的分离和纯化
(1)吸取l mL经过菌株培养的畜禽废水，依照梯度稀释法分别稀释至10-5、10-6、10-7倍，取各稀释液100μL分别涂布于麦氏固体培养基中，并于37℃无菌环境下培养2天；
(2)将涂布得到的不同形态的菌落挑出，接种到麦氏液体培养基中，在摇床温度30℃、转速140r/min的条件下培养1天；
(3)吸取l mL经步骤(2)培养一天后的液体溶液，按照梯度稀释法分别稀释至10-5、10-6、10-7倍，取各稀释液100μL分别涂布于新的固体培养基平板上培养，重复操作多次，直到分离纯化出单一菌株；
(4)将经步骤(1)-(3)分离纯化后得到的单一菌株保存于甘油中备用。
三、麦氏固体培养基的配置
准确称取葡萄糖10g、无水乙酸钠8.2g、酵母膏2.5g、氯化钾1.8g和琼脂18g于蒸馏水1000mL中，保持配置好的麦氏固体培养基处于自然pH。
用于筛选、分离和纯化的菌株人参土芽孢杆菌H3于2022年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心，邮编100101)，保藏编号CGMCCNO.24680。
四、人参土芽孢杆菌H3分离纯化培养过程中菌落生长分析
吸取一定量的保存于甘油中的纯化后的菌株置于新的麦氏液体培养基中，该麦氏液体培养基的成分组成与人参土芽孢杆菌H3的筛选过程中的初步液体培养基成分相同，在此新的麦氏液体培养基中培养73小时并定期检测液体培养基中菌落的浓度，图3反应的是73小时内菌落培养的整个过程中菌落的生长繁殖状况，从图3可以看出，H3菌在0～4小时处于延滞期，菌种刚刚接种到培养液里，需要一定的时间来适应新的环境，此时菌种的增长量不大；7～52小时处于对数增殖期，此时培养液中营养物质充足，菌种的增殖以基本恒定的速度进行增殖，菌种的数量会大量增长，并会消耗大量限制性底物；52～73小时处于减速增长期，菌种在减速增长期大量消耗营养物质，代谢物质不断累积，以至于不能继续繁殖，菌种数量保持较稳定，新增数量和死亡数量处于动态平衡，此时细菌可能出现形态和生理变化，一些细菌的合成代谢产物大都在此期间产生。
实施例2人参土芽孢杆菌H3的鉴定分析
(1)该菌株的菌属分析
通过查找现有技术中的关于芽孢杆菌属(Bacillus)的文献以及具体的人参土芽孢杆菌(Bacillus ginsengihumi)相关文献，对比分析后鉴定出该菌株为Bacillus，具体而言鉴定为人参土芽孢杆菌，本发明将其命名为人参土芽孢杆菌H3，16S rDNA序列在核糖体数据库对比分析见表1所示。
表1.16S rDNA序列在核糖体数据库对比分析
(2)16S rDNA测序结果
以细菌基因组为模板，经过PCR扩增后，所分离得到的菌株人参土芽孢杆菌H3的PCR产物经质量分数为1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察检测出现大约1500bp荧光条带。通过PCR引物直接测序，16SrDNA片段大小为1461bp，具体序列如下所示：
1 AGGCTCAGGA CGAACGCTGG CGGCGTGCCT AATACATGCA AGTCGAGCGA
51 ACTGATGAAG AGCTTGCTTT TGATCAGTTAGCGGCGGACG GGTGAGTAAC
101 ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTAGGAT AACTCCGGGA AACCGGGGCT
151 AATACTGGAT AACTTTTCTC TCCGCATGGA GAGAGATTGA AAGATGGCTT
201 CGGCTATCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG CATTAGCTAG TTGGTGAGGT
251 AACGGCTCAC CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC
301 CACATTGGGA CTGAGACACG GCCCAAACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG
351 GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG GAGCAACGCC GCGTGAGTGA
401 AGAAGGTCTT CGGATCGTAA AACTCTGTTG TTAGGGAAGA ACAAGTATCG
451 TTCGAATAGG GCGGTACCTT GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA
501 CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA
551 TTATTGGGCG TAAAGCGCGC GCAGGCGGTC TTTTAAGTCT GATGTGAAAG
601 CCCACGGCTC AACCGTGGAG GGTCATTGGA AACTGGAAGA CTTGAGTGCA
651 GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG GTGAAATGCG TAGAGATGTG
701 GAGGAACACC AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC TGACGCTGAG
751 GCGCGAAAGC GTGGGGAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC
801 CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGAGGG TTTCCGCCCT TTAGTGCTGC
851 AGCTAACGCA TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGACCGC AAGGTTGAAA
901 CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAAT
951 TCGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCAGGTC TTGACATCCT CTGACCTCCC
1001 TAGAGATAGG GCCTTCCCCT TCGGGGGACA GAGTGACAGG TGGTGCATGG
1051 TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGC
1101 GCAACCCTTG ACCTTAGTTG CCAGCATTCA GTTGGGCACT CTAAGGTGAC
1151 TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA TCATCATGCC
1201 CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGATGGTA CAAAGGGCTG
1251 CGAGACCGCG AGGTTAAGCC AATCCCATAA AACCATTCTC AGTTCGGATT
1301 GCAGGCTGCA ACTCGCCTGC ATGAAGCTGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT
1351 CAGCATGCCG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA
1401 CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGTCG GTGAGGTAAC CTTTTGGAGC
1451 CAGCCGCCGAA
基于此序列进行分析发现，菌株H3与人参土芽孢杆菌同属一个分支，16S rDNA序列分析结果显示与已知菌株人参土芽孢杆菌的亲缘关系最为接近，同源性达到100％。该菌株已于2022年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所菌种保藏管理中心，邮编100101)，保藏编号CGMCC NO.24680。
实施例3人参土芽孢杆菌H3的应用
根据上述菌种的生长特性，可将生长繁殖了7小时的菌液(即对数期的菌液)分别离心接种到7000mg/L、9000mg/L、11000mg/L和13000mg/L的高COD浓度的畜禽废水中，生长状况良好，45h后分别检测分析接种有人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率以及未接种人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率，接种有人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率达到90％以上，明显高于未接种人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率，此时处于对数期的菌株利用畜禽废水中的大量COD作为生长繁殖的养料，进而实现畜禽废水中高浓度COD的降解去除，具体降解对比见图4所示，是一种良好的畜禽废水的工程菌。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。
序列表
<110> 安阳工学院
<120> 一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人参土芽胞杆菌(Bacillus ginsengihumi)
<400> 1
aggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcga actgatgaag 60
agcttgcttt tgatcagtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta 120
agactaggat aactccggga aaccggggct aatactggat aacttttctc tccgcatgga 180
gagagattga aagatggctt cggctatcac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag 240
ttggtgaggt aacggctcac caaggcaacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc 300
cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg 360
caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggtctt cggatcgtaa 420
aactctgttg ttagggaaga acaagtatcg ttcgaatagg gcggtacctt gacggtacct 480
aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttgtccggaa ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggtc ttttaagtct gatgtgaaag 600
cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga aactggaaga cttgagtgca gaagaggaga 660
gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag 720
gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta 780
gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct 840
ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa 900
ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa 960
cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc tctgacctcc ctagagatag ggccttcccc 1020
ttcgggggac agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg accttagttg ccagcattca gttgggcact 1140
ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc 1200
ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caaagggctg cgagaccgcg 1260
aggttaagcc aatcccataa aaccattctc agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc 1320
atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc 1380
cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac 1440
cttttggagc cagccgccga a 1461
Claims (6)
1.一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3，于2022年4月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.24680。
2.如权利要求1所述的一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3，其特征在于，所述人参土芽孢杆菌H3经革兰氏染色为紫色，为革兰氏阳性菌。
3.如权利要求1所述的一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3筛选自畜禽废水。
4.如权利要求1-3任意一项所述的一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
SS01吸取l mL经过菌株培养的畜禽废水，依照梯度稀释法分别稀释至10-5、10-6、10-7倍，取各稀释液100μL分别涂布于麦氏固体培养基中，并于37℃无菌环境下培养2天；
SS02将涂布得到的不同形态的菌落挑出，接种到麦氏液体培养基中，在摇床温度30℃、转速140r/min的条件下培养1天；
SS03吸取lmL经步骤SS02培养一天后的液体溶液，按照梯度稀释法分别稀释至10-5、10-6、10-7倍，取各稀释液100μL分别涂布于新的固体培养基平板上培养，重复操作多次，直到分离纯化出单一菌株；
SS04将经步骤SS01-SS03分离纯化后得到的单一菌株保存于甘油中。
5.如权利要求1所述的一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3在高COD浓度畜禽废水中的应用。
6.根据权利要求5所述的一种能够降解畜禽废水中COD的人参土芽孢杆菌H3在高COD浓度畜禽废水中的应用，其特征在于，将所述人参土芽孢杆菌H3分别接种到7000mg/L、9000mg/L、11000mg/L和13000mg/L的高COD浓度的畜禽废水中，45h后分别检测分析接种有人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率以及未接种人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率，接种有人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率达到90％以上，高于未接种人参土芽孢杆菌H3的畜禽废水中COD的降解率。
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-
2022
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