CN110184332B - 一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用，属于环境微生物技术领域。具体步骤是：分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用荧光定量PCR分别扩增其16 S DNA和纤维素酶基因，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量。当相对含量大于0.05时，该菌剂适用于该堆体的堆肥化处理，当相对含量小于0.05时，需要向菌剂中添加具有纤维素降解功能的细菌。该方法可评价菌剂的适用性，较盲目施加菌剂具定向、精准、灵活的优势，显著提高了菌剂的功效。在牛粪等高纤维物料的堆肥资源化方面具有广阔的应用前景。

Description

一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，特别涉及一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用。
背景技术
纤维素是地球上及其丰富并且可再生的资源之一。在我国，农业和养殖业的集约化建设和快速发展，使得农作物秸秆、园林废弃物、畜禽粪污等富含纤维素的有机废弃物的污染日益严重。例如，在一些地方，牛粪对环境的污染已超过了工业污染的总量。堆肥化处理，是指在人工控制的条件下，依靠自然界中广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为地促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质转化的微生物学过程。有机废弃物经过好氧堆肥处理后：1）有机质分解转化为腐殖质，更利于植物吸收利用；2）有机废弃物中的致病菌、寄生虫等会被杀死。用有机废弃物做原料生产有机肥具有成本小、质量稳定、市场销售空间大等优势。因此，堆肥化已成为当前畜禽粪污等高纤维物料无害化、资源化处理最常用的方法。
为了提高堆肥效率，目前最主要的策略是在堆肥初期人为接种微生物菌剂，以提高堆肥初期微生物的群落结构、增强微生物的降解活性，进而缩短达到高温期的时间及提高堆肥效率。例如，公开号CN102409005A公布了一株具有双重酶活并用于好氧堆肥发酵的高温菌，公开号CN105349462A公开了一株可有效提高堆体纤维素酶活性，并加快堆体纤维素降解的龙舌兰芽孢杆菌Hexi1。公开号CNIO7177533A公开了一种由嗜热脲芽孢杆菌剂、土芽孢杆菌剂、嗜热脱氮芽孢杆菌剂、红嗜热盐菌剂混合获得的嗜热菌复配菌剂。公开号CNIO6978366A公开了一种由脉芽孢杆菌菌株TB42、地衣芽孢杆菌菌株TA65和热反硝化地芽孢杆菌菌株TB62混合而成的菌剂等。
然而，堆肥原料种类繁多，堆体成分复杂多变。例如，奶牛、黄牛和肉牛的牛粪在物质组成及微生物种群结构等方面均存在较大的差异。即便是同一种牛的牛粪，在不同的养殖地区，其物质组成及微生物种群结构也会存在较大的差异。市场中有限的菌剂难以应对如此多变的堆体原料，而且很少有菌剂在所有的牛粪堆肥化处理中都表现出优良的堆肥效果。当菌剂效果达不到预期时，为了提高堆肥效率，一些企业或单位要么更换菌剂，要么增加菌剂的用量等，这些措施不但造成菌剂浪费、增加堆肥成本，而且往往得不到预期的堆肥效果。在堆体成分难以统一及普适性菌剂匮乏的情况下，本发明建立了一套简单的、因堆体成分而异的菌剂配制、评价和优化的方法，将有效避免菌剂的浪费，降低堆肥成本并增强菌剂的使用效能、提高堆肥的效率及堆肥产物的肥效，在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于牛粪等高纤维物料的堆肥化处理。
发明内容
本发明的目的在于提供一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用。
本发明可通过以下技术方案实现:
一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法，包括以下步骤：
（1）分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用分光光度仪和琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的浓度和质量；
（2）利用荧光定量PCR扩增两种样品的16 S DNA和纤维素酶基因，PCR扩增时，要求两种引物扩增条件下所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致或PCR扩增条件；
（3）堆体原料和备选菌剂的16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量，计算公式为
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
（4）当计算结果大于0.05，则该菌剂可直接用于堆肥，当结果低于0.05，可通过添加已报道的能够用于堆肥且具有分泌纤维素酶活性的菌株，使其结果值大于0.05，以提高当前菌剂在当前堆体中的功效。
本发明的优点在于：利用本发明的制备方法，可在堆体成分难以统一及普适性菌剂有限的情况下，评价所购或自配菌剂对当前堆体的适用性能，有效避免菌剂的浪费，降低堆肥成本并增强菌剂的功效、提高的堆肥的效率及堆肥产物的肥效，在有机废弃物堆肥化处理领域具有潜在的应用价值，尤其适用于牛粪等高纤维物料的堆肥化处理。
具体实施方式
下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：菌剂的评价、复配及其在堆肥中的应用效果。
1. 实施例中所用LB培养基组成为：胰蛋白胨（10 g/L），酵母提取物（5 g/L），NaCl（10 g/L），pH调为7.0，也可向其中加入20 g/L琼脂粉，制成固体LB培养基。
2.实施例中所涉及的引物：
16S DNA扩增引物：27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'）；纤维素酶扩增基因选自熊小龙同学的硕士论文《应用于宏基因组纤维素酶基因钓取的新PCR方法的构建》，位于第60页，即GHF9E1F（5'-GGACGTGACCGGCGGNTGGTAYGA-3'）和GHF9E1R（5'- GGCCATCCACACCAGAGGNGCRTTCCA-3'）。
3. 实施例中所涉及的菌株：
特基拉芽孢杆菌菌株为在CGMCC编号为5935的菌株（见CN102719379A）；坚强芽孢杆菌菌株为在CGMCC编号为4772的菌株（见CN102337236A）。
4. 菌种活化：特基拉芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌分别接种于固体LB培养基，37℃培养24 h，挑取单菌落至液体LB培养基中，37℃培养12 h，12000 rpm，1 min，去除上清液后用1 mL无菌水悬浮，稀释106倍后用血球计数板计数并调整菌体浓度约l×108个/mL。
5. 实施例中所用的菌剂为利用不能降解纤维素的大肠杆菌DH5α和可以降解纤维素的特基拉芽孢杆菌分别按体积比1000:1和10:1配置的纤维素降解菌含量存在明显差异的两种菌剂，含量相对低的命名为菌剂一，含量相对较高的命名为菌剂二。
6. 堆肥原料的牛粪采集于某奶牛牧场，将水稻秸秆和新鲜牛粪按体积比4:6混合制堆，调整含水量约为65%。
7. 分别称取0.5 g堆肥原料和5 g菌剂（约5ml），利用土壤DNA提取试剂盒（MPbiomedicals, 116560-200）提取堆肥原料和两种菌剂的DNA，堆肥原料的DNA用30 μl的溶解缓冲液溶解，菌剂的DNA用50 μl的溶解缓冲液溶解，利用荧光定量PCR扩增16 S DNA和纤维素酶基因扩增，退火温度为60℃，延伸时间为80s，循环次数为45次，荧光定量PCR检测试剂选用SYBR Fast qPCR Mix（RR430A，TaKaRa）。反应体系是按照荧光定量PCR检测试剂使用说明书添加，20μl总反应体系，其中，DNA模板2μl，一对引物各0.5μl，荧光定量PCR检测试剂10μl，无菌水7μl；
8. 以16 S DNA作为内参，根据溶解曲线法计算菌剂一和菌剂二中纤维素酶基因的相对含量，分别为0.003和0.067；
9. 分别利用特基拉芽孢杆菌和坚强芽孢杆菌调节菌剂一，使得菌剂中纤维素酶基因的相对含量分别为0.053和0.071：
10. 将堆肥原料平均分成4份，依次标记为T1、T2、T3、T4。每个处理组依次施加以下几种液体菌剂，添加比例为0.025%（以原始物料质量百分比计）。
表1各接种菌剂组成
Figure DEST_PATH_IMAGE004
11.堆肥进行20 d，分别在第0、5、10、15、20 d取样，测定了温度、pH、含水率、有机质、凯氏氮、无机氮、DOM含量等参数。整个堆肥过程只在0 d接种菌剂一次，在第3、6、9、12 d堆体翻堆。
12. 实验结果
（1）从堆肥过程中的温度变化分析，与菌剂一相比，复配后的菌剂可显著提高堆体的温度，且升温更快，该效应与相对更适合该堆体原料堆肥的菌剂二相似（表2）。
表2 温度检测结果 (℃)
Figure DEST_PATH_IMAGE006
（2）从堆肥过程中的pH和含水率变化分析，与菌剂一相比，复配后的菌剂和菌剂二均使堆体的pH升得更高，水分降得更快（表3和表4）。
表3 pH检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
表4 含水率检测结果（%）
Figure DEST_PATH_IMAGE010
（3）从堆肥过程中的有机质（OM）降解率分析，与菌剂一相比，复配后的菌剂和菌剂二对堆体OM的降解率更高（表5）。
表5 有机质检测结果（%）
Figure DEST_PATH_IMAGE012
（4）从堆肥过程中的凯氏氮和无机氮变化分析，与菌剂一相比，复配后的菌剂和菌剂二的堆肥产品中凯氏氮含量更高（表6），但无机氮变化不明显（表7和表8）
表6 凯氏氮检测结果 (%)
Figure DEST_PATH_IMAGE014
表7 NH4+-N检测结果 (mk/Kg)
Figure DEST_PATH_IMAGE016
表8 NO3 --N检测结果 (mg/Kg)
Figure DEST_PATH_IMAGE018
（5）从堆肥过程中可溶性有机物（DOM）的含量变化分析, 与菌剂一相比，复配后的菌剂和菌剂二对堆体DOM的降解率略高（表9）。
表9 DOM检测结果 (mg/g)
Figure DEST_PATH_IMAGE020
13. 堆肥产物对小白菜种子发芽率影响
利用小白菜种子发芽率测定堆肥产物的肥效，测定方法参照公开号CN107177533A，具体为：取5 g鲜样加水50 mL，浸提30 min，室温200 rpm振荡30 min，用定性滤纸过滤，滤液用于种子发芽率的测定。在已灭菌的培养皿内垫3张滤纸，加入堆肥提取液8 mL，以去离子水作为对照，均匀放入20粒籽粒饱满，大小均匀一致小白菜种子，25℃培养24 h后测定发芽率。结果显示，与按照本发明计算方法认为不适用于当前堆体堆肥的菌剂相比，应用本发明调整后的菌剂及按照本发明计算方法认为适用于当前堆体堆肥的菌剂，其堆肥产品均利于小白菜种子的发芽（表10），说明堆肥产物腐熟度更好，质量更高，更利于作物生长。
表10堆肥产物对小白菜种子发芽率影响
Figure DEST_PATH_IMAGE022
从以上结果可以发现，该发明可以用于评价已有菌剂对堆体的功效，以及为菌剂的复配、改良和优化提供参照。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省致青生态环保有限公司
<120> 一种处理高纤维物料的堆肥菌剂复配方法及其应用
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 3
ggacgtgacc ggcggntggt ayga 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 4
ggccatccac accagaggng crttcca 27

Claims (2)

1.一种评价堆肥菌剂对堆体的适用性的方法，其特征在于，基于16 S DNA和纤维素酶基因，计算菌剂中纤维素酶基因的相对含量；当相对含量所得值大于0.053时，该菌剂适用于该堆体的堆肥化处理；所述堆体为牛粪等高纤维物料；
分别提取堆肥原料和备选菌剂的DNA，利用荧光定量PCR扩增16 S DNA和纤维素酶基因；
16 S DNA扩增引物为常用的通用引物；
纤维素酶基因扩增引物为适用于分泌纤维素酶的细菌的简并引物；
扩增16 S DNA和纤维素酶基因的两对引物具有相同的PCR扩增条件或进行PCR扩增时，所用DNA模板的量相同，扩增循环数一致；
堆肥原料和备选菌剂16 S DNA的CT值分别定义为CT1a和CT1b，纤维素酶基因的CT值分别定义为CT2a和CT2b，菌剂中纤维素酶基因相对含量的计算公式为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的评价堆肥菌剂对堆体的适用性的方法在牛粪等高纤维物料堆肥处理中的应用。
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