CN103361282A - 一种耐低温纤维素降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种耐低温纤维素降解菌，其为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株B6-15，保藏号为CGMCC NO.5851。该菌可在低温条件下(15～20℃)高效降解纤维素，为低温环境下堆肥过程中通过降解纤维素促进堆肥温度上升提供了新的微生物资源和技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域及生物降解领域，具体地说，涉及一种耐低温纤维素降解菌及其应用。
背景技术
纤维素(cellulose)是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上。麻、麦秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。常温下，纤维素不溶于水及一般有机溶剂，如酒精、乙醚等；将其加热到约150℃时仍不发生显著变化，因此通常情况下，纤维素是比较稳定的。
大量纤维素都存在于农作物的秸秆中，但由于其难以分解，从而影响到它的利用推广。我国农作物秸秆具有分布广、数量大等特点，如不合理充分利用这些资源，将会造成资源浪费、环境污染。近年来，秸秆的利用方法有很多，但普遍存在着利用不充分、成本高等问题。因此利用现代生物技术处理农作物秸秆将是秸秆利用的最佳途径。
在低温条件下，嗜温微生物大多无法正常代谢，因此，寻找可在低温环境中正常生存并可高效降解纤维素的菌种成为低温环境农作物秸秆利用的重点。低温纤维素降解菌的筛选及其酶学性质的研究具有很高的研究价值，意义重大。
发明内容
本发明的目的是针对低温环境下纤维素降解成本高、效率低的难题，提供一种能在低温下生长并有效降解纤维素的菌种。
为了实现本发明目的，本发明的一种耐低温纤维素降解菌，其为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株B6-15，该菌分离自黑龙江省牡丹江市双峰林场的腐殖土中。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年3月7日，保藏号CGMCC NO.5851。
经人工富集培养、分离纯化得到的菌株B6-15在琼脂平板上的菌落呈圆形，浅黄色，直径为2-3mm，表面较湿润，中央较突起，边缘整齐，不透明；单细胞呈短杆状，革兰氏阴性，无芽孢，有荚膜。
具体筛选方法为：取10g低温环境中采集的样品加入90mL无菌水中，充分振荡后静置，取10ml上清液接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在160r/min的摇床中，通过5℃、7℃、10℃的温度梯度进行驯化培养，以3d为一个周期。
筛选过程为：驯化培养一个周期后，取驯化后的菌液1mL，进行梯度稀释10-5、10-6、10-7，取0.1mL平板涂布，在4℃下培养，选取菌落分布均匀的平板，挑取单菌落，分离纯化后于4℃进行保存。将纯化菌株点接于纤维素分解菌筛选培养基平板上，经过4℃培养后观察在菌落周围是否形成透明分解圈，测定记录分解圈及菌落的直径，作为选取耐低温纤维素降解菌的依据。
纤维素水解酶的活性测定：用接种环挑取单菌落接入牛肉膏蛋白胨培养基中，在15℃、160r/min条件下培养24h，取10ml接入90mL纤维素发酵培养基中培养，每隔24h取10mL经过5000r/min离心5min后制成酶液，于4℃保存，然后用DNS法测定菌株的纤维素水解酶活力。
本发明还提供由上述耐低温纤维素降解菌产生的纤维素酶。
本发明进一步提供上述耐低温纤维素降解菌在促进堆肥升温过程中的应用，其是将假单胞菌属B6-15接种到堆肥中，在环境温度15～20℃下进行快速升温。
本发明筛选出的耐低温纤维素降解菌可在低温环境下(15～20℃)高效降解农作物中纤维素，且成本低，易操作控制，为低温环境下堆肥过程中纤维素的降解提供了新的微生物资源和技术支撑。
附图说明
图1为筛选出的5株降解纤维素的菌株的纤维素水解酶活性比较。
图2为假单胞菌属B6-15的菌落形态(A)及显微镜下的形态(B)。
图3本发明假单胞菌属B6-15菌株的生长曲线。
图4本发明假单胞菌属B6-15菌株的堆肥升温实验结果，其中
为环境温度，
为对照组，即堆肥材料中未接入外来菌株B6-15，
为实验组，即堆肥材料中接入菌株B6-15。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1耐低温纤维素降解菌的分离
采集黑龙江省牡丹江市双峰林场的腐殖土样。将采集的样品10g加到90mL无菌水中，充分振荡后静置取上清液加入牛肉膏蛋白胨液体培养基中，通过5℃、7℃、10℃的温度梯度进行驯化培养，3d为一个周期。
驯化培养后取1mL培养菌液，用无菌水稀释至10-5、10-6、10-7，分别取0.1mL涂布平板，4℃恒温培养后挑取单菌落进行分离纯化。将纯化后所得到的单菌落转接到平板上进行保存。
将初筛得到的纯化菌株点接于纤维素降解菌筛选培养基上，经过4℃培养后观察并测量记录菌落及其周围透明分解圈的直径。
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，去离子水1000mL，灭菌备用。固体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，去离子水1000mL，灭菌备用。纤维素降解菌株筛选培养基：K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.25g/L，CMC-Na 1.88g/L，刚果红0.2g/L，明胶2g/L，琼脂20g/L，去离子水1000mL，灭菌备用。
本实施例共分离出具有较强纤维素能力的菌株5株。
实施例2耐低温纤维素降解菌的酶活测定
将实施例1中筛选出的5株降解菌分别挑取1环接入牛肉膏蛋白胨液体培养基中15℃培养24h制成种子液，然后将其接入摇瓶纤维素发酵培养基中15℃下进行培养，3d后取出测定纤维素酶活力。
其中，摇瓶纤维素发酵培养基：NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，CMC-Na 5g/L，K2HPO4 1g/L，去离子水1000mL，灭菌备用。
测定纤维素酶活力时，以滤纸为底物，利用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力，并于540nm处测定吸光值。将每分钟水解纤维素产生1μg葡萄糖所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
结果如图1所示，菌株B6-15(保藏号CGMCC NO.5851)酶活最高，为26.237U/mL。
实施例3耐低温纤维素降解菌的形态学鉴定及其生长曲线
以实施例2中挑选出的典型菌株B6-15作为研究对象。首先将菌株接种在平板上，于15℃培养24h后，观察其在平板上的菌落形态；然后进行简单染色、革兰氏染色及芽孢染色，使用光学显微镜观察其单细胞的形态。
结果如图2所示，菌落为圆形，浅黄色，直径为2-3mm，表面较湿润，中央较突起，边缘整齐，不透明；单细胞呈短杆状，革兰氏阴性，无芽孢，有荚膜。
将菌株接入液体培养基中，于15℃摇床中，转速为160r/min，培养24h制成菌液，然后取1ml上述菌液接入新鲜的液体培养基中，于15℃、160r/min摇床中连续培养，每2h测定液体的OD600值，后以时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制生长曲线。结果如图3所示，菌株在15℃环境中可较快生长，于16h基本达到稳定期。
实施例4假单胞菌属B6-15在促进堆肥升温过程中的应用
以实施例2中筛选的典型菌株B6-15作为研究对象。挑取一环菌株接入液体培养基中，于15℃摇床中，培养24h后制成菌液备用。
使用鸡粪及锯末作为堆肥升温实验的材料。调节堆肥初始材料使用量使堆肥初始C/N比约为26，水分约为60％，充分将堆肥材料混合均匀，然后将制成的菌液以堆肥材料干重的4‰接入堆肥材料中，将其与堆肥材料混匀后装入以泡沫盒作为的堆肥发酵反应装置中，将堆肥发酵反应装置放于环境温度在15℃左右的室内进行堆肥升温实验。自堆肥材料装入发酵反应装置中开始计时，每隔12h读取并记录堆料中部温度一次，后以时间为横坐标，温度为纵坐标，绘制堆肥升温阶段的温度曲线。
结果如图4所示，其中
所示为环境温度，
所示为对照组，即堆肥材料中未接入外来菌株B6-15，所示为实验组，即堆肥材料中接入菌株B6-15。由图4中可以看出，在环境温度处于13℃-15℃的范围内时，同一时间段内，接入菌株B6-15后的堆体与未接入菌株B6-15的堆体平均高出8℃-10℃。接入菌株B6-15的堆体可在24h后升温至68℃，可很好地实现低温环境中堆肥的快速升温，从而促进堆肥的快速升温。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种耐低温纤维素降解菌，其为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)菌株B6-15，保藏号为CGMCC NO.5851。
2.由权利要求1所述的耐低温纤维素降解菌产生的纤维素酶。
3.权利要求1所述的耐低温纤维素降解菌在促进堆肥升温过程中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其是将假单胞菌属B6-15接种到堆肥中，在环境温度15～20℃下进行快速升温。
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