CN109437988A - 一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，本方法包括：步骤一、筛选低温纤维素降解菌；步骤二、将筛选得到的低温纤维素降解菌与堆肥用纤维素降解菌混合制备成混合菌液；步骤三、在堆肥槽内加入牛粪便、锯末以及步骤二中制得的混合菌液，并调整含水量。堆肥反应的初期，具有低温反应活性的纤维素降解菌首先与畜禽粪便发生作用，并在分解纤维素的过程中产热，逐步将反应温度提高，随着温度的提高其他的纤维素降解菌开始参与反应降解并将堆肥温度维持在50‑55℃，使堆肥过程顺利进行，解决了在寒冷的气候条件下畜禽粪便堆肥无法顺利进行的问题。

Description

一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法

技术领域

本发明属于堆肥技术领域，具体涉及一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法。

背景技术

畜禽粪便污染已成为环境、水源和土壤主要污染源。目前全国畜禽粪便年排放量超过40亿t，是工业有机污染物的4.1倍，且大多未经处理直接排放对农业环境带来极大威胁。以牛为例，成年母牛一昼夜排粪量多达30kg，一昼夜排尿量约为22kg，成年牛1年的排粪量可达11t，排尿量达8t，如此推算，全国每年粪便产生量可谓是“天数”。加之，牛排泄随意，边走边排，粪便得不到及时利用或处理不当就会严重污染牛场及周围环境和水源。

堆肥技术是处理各种废弃物和资源化利用的一种有效途径。随着养殖业废弃物造成的空气和水污染问题越来越严重，同时由于一些集约化种植地区土壤中有机物含量出现降低趋势，近年来堆肥化技术更多的应用到畜禽废弃物处理中。通过堆肥化过程不仅可降解废弃物、杀灭病原微生物、降低污染，达到无害化处理目的，还可产生有机肥料，施用于土壤改良土壤环境，提高农作物产量，从而实现资源化利用。因此，堆肥化技术既包含了可持续农业概念，又是绿色有机农业的一种表现。堆肥过程是否成功进行受诸多因素的影响。温度是影响堆肥进程最主要的因素，对有机物降解作用起“引导”作用。我国高温堆肥卫生标准中规定，粪尿无害化处理过程中堆肥温度需达50-55℃以上，并保持5-7d。

在寒冷的气候条件下，畜禽粪便堆肥无法顺利进行；因为常规用于粪便堆肥的初始菌群主要成分是纤维素降解菌，纤维素降解菌在0-15℃的低温条件下无法正常生长以及降解纤维素。在粪便堆肥的初始菌群中加入低温纤维素降解菌可以解决这一问题，加入反低温纤维素降解菌后，在堆肥反应的初期，具有低温反应活性的纤维素降解菌首先会与畜禽粪便发生作用，并在分解纤维素的过程中产热，逐步将整个堆肥的反应温度提高，随着温度的提高其他的纤维素降解菌开始参与反应降解并将堆肥温度维持在50-55℃，使堆肥过程顺利进行。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，这种方法可解决在寒冷的气候条件下畜禽粪便堆肥无法顺利进行的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，包括如下步骤：

步骤一、筛选低温纤维素降解菌；

步骤二、将筛选得到的低温纤维素降解菌与堆肥用纤维素降解菌混合制备成混合菌液；

步骤三、在堆肥槽内加入牛粪便、锯末以及步骤二中制得的混合菌液，并调整含水量。

在上述技术方案中，所述低温纤维素降解菌的筛选方法按照下列步骤进行：一、纤维素降解菌的分离与纯化，二、低温纤维素降解菌的初筛与复筛，三、低温纤维素降解菌酶活力测定。

在上述技术方案中，所述纤维素降解菌的分离与纯化的过程如下：称取10g牛粪便样品放入装有玻璃珠的250mL锥形瓶中，加入100mL灭菌蒸馏水，在摇床中振荡30min。取10mL悬液加入到灭菌后的富集培养基中，20℃恒温振荡培养3～4d，至培养基变浑浊。将浑浊的培养基进行10倍梯度稀释，取合适倍数的稀释液于羧甲基纤维素平板上均匀涂布，20℃培养3～4d，至形成单个菌落。将单个菌落反复划线培养，以此得到纯菌株。

在上述技术方案中，所述低温纤维素降解菌的初筛与复筛的过程如下：将纯纤维素降解菌株用接种环划线接种子羧甲基纤维素培养基上，20℃培养至形成单个菌落。用0.2％刚果红染色15min，用蒸馏水洗去染液后，再以1mol/L NaCl浸洗15min，根据产生水解圈与否判断是否为纤维素降解菌，其次据水解圈直径的大小，筛选出水解圈与菌落直径比值较大的菌株。得到的菌种分别在0℃、4℃、10℃、15℃下培养3～4d。

在上述技术方案中，所述低温纤维素降解菌酶活力测定的过程如下：

(1)纤维素酶活(CMC)的测定：取0.05moL/L柠檬酸缓冲液(含有2％CMC-Na)1.5mL于离心管中，加入0.5mL制备好的粗酶液，50℃放置30min，后加入试剂DNS，100℃水浴5min，立即冰浴，加8mL水稀释，并于540nm处测溶液的光密度(OD)值。

(2)滤纸酶活(FPA)的测定：取4个离心管都加入0.05moL/L的柠檬酸缓冲液1.5mL，再加入0.5mL制备好的粗酶液，其中一管作为对照管并加入1.5mL试剂DNS将酶活性失活。四个离心管50℃水浴预热5min，各加入0.05g定量滤纸条，50℃放置反应30min。反应后向另外3个离心管中各加入1.5mLDNS试剂以终止酶反应。将四支离心管充分混匀后100℃水浴加热5min，取出冰浴冷却后用蒸馏水定容至10mL，以对照管为空白对照，测定540nm处测溶液的光密度(OD)值。

在上述技术方案中，在步骤二中，所述低温纤维素降解菌为产碱杆菌属的粪产碱杆菌以及芽孢杆菌属的龙舌兰芽孢杆菌。

在上述技术方案中，在步骤三中，所述牛粪便与锯末的重量比3∶1。

在上述技术方案中，在步骤三中，所述堆肥反应物中含水量为55-60％。

本发明的优点和有益效果为：在低温条件下，具有低温反应活性的纤维素降解菌在堆肥反应初期具有促进堆肥进行的作用。堆肥反应的初期，具有低温反应活性的纤维素降解菌首先与畜禽粪便发生作用，并在分解纤维素的过程中产热，逐步将反应温度提高，随着温度的提高其他的纤维素降解菌开始参与反应降解并将堆肥温度维持在50-55℃，使堆肥过程顺利进行，解决了在寒冷的气候条件下畜禽粪便堆肥无法顺利进行的问题。

附图说明

图1是堆肥过程中环境和各实验组的温度变化趋势图。

其中：1为环境温度，2为处理组，3为对照1，4为对照2。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例1：低温纤维素降解微生物的筛选

(1)纤维素降解菌的分离与纯化

称取10g牛粪便样品放入装有玻璃珠的250mL锥形瓶中，加入100mL灭菌蒸馏水，在摇床中振荡30min。取10mL悬液加入到灭菌后的富集培养基中，20℃恒温振荡培养3～4d，至培养基变浑浊。将浑浊的培养基进行10倍梯度稀释，取合适倍数的稀释液于羧甲基纤维素平板上均匀涂布，20℃培养3～4d，至形成单个菌落。将单个菌落反复划线培养，以此得到纯菌株。

(2)低温纤维素降解菌的初筛与复筛

将纯纤维素降解菌株用接种环划线接种于羧甲基纤维素培养基上，20℃培养至形成单个菌落。用0.2％刚果红染色15min，用蒸馏水洗去染液后，再以1mol/LNaCl浸洗15min，根据产生水解圈与否判断是否为纤维素降解菌，其次据水解圈直径的大小，筛选出水解圈与菌落直径比值较大的菌株。得到的菌种分别在0℃、4℃、10℃、15℃下培养3～4d。

(3)低温纤维素降解菌酶活力

绘制葡萄糖标准曲线：

按照表1加入各种试剂，配置成不同浓度的葡萄糖溶液，再加入DNS显色剂混合均匀后沸水浴10min，冷却至室温，用空白对照(蒸馏水)调零，测定不同浓度葡萄糖溶液在540nm处的光密度(OD)值，并绘制葡萄糖浓度-OD值标准曲线表。

表1 葡萄糖标准曲线反应体系

粗酶液的制备：

将菌液5000r/min离心15min，取上清液即为粗酶液。

纤维素酶活(CMC)的测定：

取0.05moL/L柠檬酸缓冲液(含有2％CMC-Na)1.5mL于离心管中，加入0.5mL制备好的粗酶液，50℃放置30min，后加入试剂DNS，100℃水浴5min，立即冰浴，加8mL水稀释，并于540nm处测溶液的光密度(OD)值。

滤纸酶活(FPA)的测定：

取4个离心管都加入0.05moL/L的柠檬酸缓冲液1.5mL，再加入0.5mL制备好的粗酶液，其中一管作为对照管并加入1.5mL试剂DNS将酶活性失活。四个离心管50℃水浴预热5min，各加入0.05g定量滤纸条，50℃放置反应30min。反应后向另外3个离心管中各加入1.5mLDNS试剂以终止酶反应。将四支离心管充分混匀后100℃水浴加热5min，取出冰浴冷却后用蒸馏水定容至10mL，以对照管为空白对照，测定540nm处测溶液的光密度(OD)值。

(4)拮抗试验

将两种高效不同低温纤维素降解菌株平行划线与羧甲基纤维素培养基上培养，观察是否有线偏离或抑制圈等拮抗现象的产生。

(5)低温纤维素降解菌种的鉴定

菌种的形态鉴定：

参照《伯杰氏鉴定手册》鉴定细菌和放线菌，参照《真菌鉴定手册》鉴定真菌。

生理生化鉴定：

按照革兰氏染色试剂盒提供的方法进行革兰氏染色，染色后菌体呈蓝色的为革兰氏阳性菌，呈红色的为革兰氏阴性菌。

色氨酸脱氨酶测定试验：

将菌株接种于液体培养液中20℃培养24～48h。取适量培养液滴加33％的三氯化铁溶液1滴，出现红褐色为阳性。

吲哚试验：

将菌种接种于蛋白胨液体培养基中，20℃恒温培养24～48h，加入3～4滴对二甲基氨基苯甲醛试剂，红色为阳性，黄色为阴性。

硫化氢产生试验：

将菌种穿刺接种子培养基中，20℃恒温培养24～48h。若穿刺线上或试管底部变黑者为阳性反应。

葡萄糖氧化-发酵试验(OF试验)：

将菌种穿刺接种于2支试管，其中1支为封闭试管，用油封盖(2/3液体凡士林中加1/3液体石蜡)；另1支为开管不封油，以接种的作对照。只有开管变黄为氧化型，开管及闭管均变黄为发酵型。

过氧化氢酶试验：

在洁净载玻片上滴加3％～5％过氧化氢，并用接种环挑起菌种在过氧化氢上均匀涂布，如有气泡出现为过氧化氢酶阳性。

明胶液化试验：

将菌种穿刺接种于培养基中，以不接种作为对照，5℃恒温培养4～48h，明胶表面出现液体，则为明胶液化阳性。

乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)：

将菌株接种于葡萄糖蛋白胨液体培养液试管中，20℃培养24～48h后，将试管Vortex 5min后取等体积的培养液和40％KOH混合，加入少许6％的α-萘酚-无水乙醇溶液，混匀于20℃恒温放置15～30min，出现红色为阳性反应。

氧化酶试验：

将菌落挑起放在干净滤纸上，滴加1滴盐酸二甲基对苯二胺溶液，粉红色为阳性；再加1滴α-萘酚溶液，30s内出现蓝色为阳性。

运动性试验：

将菌株穿刺接种于半固体培养基中，若向四周扩散增菌，为有运动性。

硝酸盐还原试验：

将菌种接种于硝酸盐液体培养基中，以不接种为对照。在培养液，加入1滴A液和1滴B液，出现橙色、棕色、粉红色为阳性。

淀粉水解试验：

将菌株接种于含淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，20℃恒温培养24～48h。向平板滴加碘液，出现不变色透明圈为阳性。

甲基红试验(M-R试验)：

将菌株接种于葡萄糖蛋白胨培养液试管中，20℃恒温培养24～48h。将试管Vortex振荡1min后加入2滴甲基红试剂，出现红色为阳性，黄色为阴性。

脂酶试验：

将菌株划线接种于平板上。划线周围有模糊的晕圈者为阳性，没有晕圈者为阴性。

柠檬酸盐利用试验：

将菌种接种于柠檬酸盐培养基斜面上，20℃恒温培养24～48h。培养基呈蓝色者为阳性。

产氨试验：

将菌株接种于液体培养基中，20℃恒温培养24～48h。培养液中加入Nessler试剂数滴，出现黄褐色沉淀为阳性。

实施例2：混合菌液制备

(1)菌种活化

取冷藏保存斜面菌种，无菌操作接种于斜面营养培养基中，0℃、4℃、10℃、15℃下培养3～4d，制备活化的斜面菌种。

(2)液体培养

取活化的斜面菌种各取一环，无菌操作接种于液体培养基中，0℃、4℃、10℃、15℃恒温振荡培养3～4d。

(3)复合菌液的制备

取不同温度培养菌液，按相等比例混合，震荡摇匀，即为复合菌液。

实施例3：低温纤维素降解菌液在畜禽粪便堆肥中的应用

(1)畜禽粪便堆肥制作

将新鲜牛粪便与锯末按照重量比3∶1进行混合。上述所述的新鲜牛粪便经固液分离后使用。

在堆肥槽内加入低温纤维素降解菌液、牛粪便和锯末，并用水将水分含量调至60％左右。试验在-10～-15℃环境下进行。试验期14d。每天通风4h。每天9：00am和4：00pm分别测定堆肥温度和环境温度。堆肥温度为堆体表面、中部和底部温度平均值，环境温度为堆肥装置周围1m处温度平均值。

(2)试验分组

分为对照1组，不接种菌液；对照2组，接种常温纤维素降解菌液；处理组，接种低温纤维素降解菌液。

(3)实验结果如下

①堆肥温度

环境和各组的温度变化趋势如图1所示。在堆肥的起始阶段，各组堆体温度与环境温度相差不多，因此在0d与1d，温度无明显变化。在1d后接种的复合菌液开始发挥作用，至第3d处理组、对照1和对照2分别上升了9℃、8℃和3℃。第4～9d，虽然上升幅度不大，但处理组和对照1仍然在缓慢上升，到14d时处理组迅速上升到30℃，对照2组却受温度所限，升温缓慢，不利于中温微生物的新陈代谢。

②种子发芽指数

种子发芽指数(GI)是通过测试堆肥浸提液的生物毒性来评价堆肥腐熟程度，被普遍认为是测定堆肥产品植物毒性最有效、最敏感、最能反映堆肥产品植物毒性大小的腐熟度评价指标。当GI＞50％时可认为堆肥基本无毒性，当GI超过80％时可视为堆肥已消除植物毒性，达到了完全腐熟。由表2可知，堆肥的起始GI和3d时的GI均为0，说明此时粪便仍然有很高的毒性，4d时GI值开始上升，堆肥结束时，处理组堆肥呈现基本无毒性，而对照1组和2组没有达到此标准。

表2 堆肥GI值(％)

结论：低温纤维素降解复合菌液能够在较低温度环境下使畜禽粪便堆肥物料快速起温，促进堆肥化过程，使其快速达到无毒害标准，对解决冬季北方寒冷地区畜禽粪便的冻结堆积问题有重大意义。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、筛选低温纤维素降解菌；

步骤二、将筛选得到的低温纤维素降解菌与堆肥用纤维素降解菌混合制备成混合菌液；

步骤三、在堆肥槽内加入牛粪便、锯末以及步骤二中制得的混合菌液，并调整含水量。

2.根据权利要求1所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：所述低温纤维素降解菌的筛选方法按照下列步骤进行：一、纤维素降解菌的分离与纯化，二、低温纤维素降解菌的初筛与复筛，三、低温纤维素降解菌酶活力测定。

3.根据权利要求2所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：所述纤维素降解菌的分离与纯化的过程如下，称取10g牛粪便样品放入装有玻璃珠的250mL锥形瓶中，加入100mL灭菌蒸馏水，在摇床中振荡30min；取10mL悬液加入到灭菌后的富集培养基中，20℃恒温振荡培养3～4d，至培养基变浑浊。将浑浊的培养基进行10倍梯度稀释，取合适倍数的稀释液于羧甲基纤维素平板上均匀涂布，20℃培养3～4d，至形成单个菌落；将单个菌落反复划线培养，以此得到纯菌株。

4.根据权利要求2所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：所述低温纤维素降解菌的初筛与复筛的过程如下，将纯纤维素降解菌株用接种环划线接种子羧甲基纤维素培养基上，20℃培养至形成单个菌落；用0.2％刚果红染色15min，用蒸馏水洗去染液后，再以1mol/L NaCl浸洗15min，根据产生水解圈与否判断是否为纤维素降解菌，其次据水解圈直径的大小，筛选出水解圈与菌落直径比值较大的菌株；得到的菌种分别在0℃、4℃、10℃、15℃下培养3～4d。

5.根据权利要求2所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：所述低温纤维素降解菌酶活力测定的过程如下，取0.05moL/L含有2％CMC-Na的柠檬酸缓冲液1.5mL于离心管中，加入0.5mL制备好的粗酶液，50℃放置30min，后加入试剂DNS，100℃水浴5min，立即冰浴，加8mL水稀释，并于540nm处测溶液的光密度值。

6.根据权利要求2所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：所述低温纤维素降解菌酶活力测定的过程如下：取4个离心管都加入0.05moL/L的柠檬酸缓冲液1.5mL，再加入0.5mL制备好的粗酶液，其中一管作为对照管并加入1.5mL试剂DNS将酶活性失活；四个离心管50℃水浴预热5min，各加入0.05g定量滤纸条，50℃放置反应30min；反应后向另外3个离心管中各加入1.5mLDNS试剂以终止酶反应；将四支离心管充分混匀后100℃水浴加热5min，取出冰浴冷却后用蒸馏水定容至10mL，以对照管为空白对照，测定540nm处测溶液的光密度值。

7.根据权利要求1所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：在步骤二中，所述低温纤维素降解菌为产碱杆菌属的粪产碱杆菌以及芽孢杆菌属的龙舌兰芽孢杆菌。

8.根据权利要求1所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：在步骤三中，所述牛粪便与锯末的重量比3∶1。

9.根据权利要求1所述的一种利用低温纤维素降解菌群提高低温下堆肥效率的方法，其特征在于：在步骤三中，所述堆肥反应物中含水量为55-60％。