CN115399216A - 一种基于悬铃木落叶的改良粘壤土及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于悬铃木落叶的改良粘壤土及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

为解决落叶处理问题，草炭和岩棉所带来的环境污染和资源枯竭问题，本发明提供一种改良粘壤土的制备方法，包括：(1)筛选菌株：收集悬铃木落叶，收集悬铃木落叶上的菌种，涂布培养、纯化，对菌种进行初筛，挑选出纤维素降解能力强的菌株进行生长曲线的测定，取最佳生长状态的菌株后进行纤维素酶活测定的复筛，筛选得到菌株；(2)制备菌剂：将菌株制成固体菌剂；(3)制备改良粘壤土：将固体菌剂与粉碎的悬铃木落叶混合进行有氧发酵，有氧发酵完成后得到有机基质，将有机基质与粘壤土混合，制备得到改良粘壤土。本发明解决了城市落叶难以处理等难题，采用本发明提供的改良粘壤土能够显著提高不结球白菜的生物产量、根系活力、可溶性糖含量。

Description

一种基于悬铃木落叶的改良粘壤土及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，涉及一种基于悬铃木落叶的改良粘壤土及其制备方法和应用。
背景技术
随着环保意识的普及以及各个城市对绿化要求的提升，城市落叶已成为城市垃圾的重要组成部分，平均每年落叶量高达几十亿吨，除了生活环境得到很大程度的改善之外，也带来了环保负担的加重以及落叶处理技术的落后等问题。地球上每年都有几百亿吨纤维素类生物质产生,是地球上数量最大的可再生资源，其中城市落叶占据相当的比重，这些物质如果不加以利用，将对自然资源造成巨大的浪费。目前大多数城市处理落叶的方法为集中焚烧，这种方法看似最为方便，实际其对环境造成的污染将远远大于其节省的蝇头小利，并且其焚烧之后会产生的大量浮沉等物质会严重影响环境卫生和危害居民健康。
近些年来，随着设施农业的飞速发展，使得基质栽培得到了广泛的应用，草炭和岩棉被认为是最好的栽培基质，但具有不可再生性和难以降解性，随着其大量的使用，所带来的一些环境污染问题和资源枯竭问题也逐渐显露出来，因此寻求成本低廉、易得无污染及可替代草炭等有限资源的新型栽培基质是当今各国无土栽培科研工作者的研究热点之一。国外研究者开发了以椰子壳、树皮、锯末等废弃物为主要材料，将其进行资源化处理后作为新型栽培基质使用，不仅可以大大的降低栽培成本，还解决了草炭和岩棉所带来的环境污染问题和资源枯竭问题。
本发明旨在以悬铃木落叶为菌源材料，从中筛选出具有高效纤维素降解能力的菌种，然后经过培养，接种到提前处理好的悬铃木落叶堆体上，使其发酵为新型有机基质，并提供该基质在栽培不结球白菜中的应用，为处理城市落叶提供理论依据，同时还可以作为减少草炭使用和减少农业栽培成本的新型有机基质。
发明内容
为解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供一种悬铃木落叶的循环利用处理方法，并提供一种成本低廉、易得无污染及可替代草炭等有限资源、并且特别有适宜不结球白菜的新型栽培基质。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种改良粘壤土的制备方法，所述方法包括：
(1)筛选菌株：收集悬铃木落叶，收集悬铃木落叶上的菌种，涂布培养、纯化，对获得的菌种进行初筛，挑选出纤维素降解能力强的菌株进行生长曲线的测定，取最佳生长状态的菌株后进行纤维素酶活测定的复筛，筛选得到菌株；
(2)制备菌剂：将(1)筛选得到的菌株制成固体菌剂；
(3)制备改良粘壤土：将(2)得到的固体菌剂与粉碎的悬铃木落叶混合进行有氧发酵，有氧发酵完成后得到有机基质，将有机基质与粘壤土混合，制备得到改良粘壤土。
进一步的，(1)中所述收集悬铃木落叶上的菌种具体操作为，取收集到的悬铃木落叶加入蒸馏水振荡培养，得到菌株悬浮液。
进一步的，(1)中所述涂布培养具体操作为，将菌株悬浮液稀释至适宜浓度，涂布于固体平板培养基，37℃培养36h，所述固体平板培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，成分为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20g，pH值7.0～7.2，水1000ml。
进一步的，(1)中所述纯化为挑选涂布培养得到的颜色、形态不一致的菌落在固体平板上用划线法进行纯化，直至每个平板上的菌落颜色及形态单一；优选的，还包括对纯化得到的菌种进行菌种保藏操作，所属保藏为用无菌牙签挑取单菌落后在固体培养基上划线，待长出菌苔后标好编号后放入4℃冰箱保藏，优选的，所述固体平板培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，成分为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20g，pH值7.0～7.2，水1000ml。
进一步的，(1)中所述初筛为采用刚果红染色法鉴别菌种的纤维素降解能力；所述复筛为挑取生长曲线的测定得到最佳生长状态的菌株接种到液体培养基中，在恒温振荡培养箱中于37℃，200rpm条件下振荡培养36h制得种子液，然后取种子液接种纤维素酶产酶液体培养基中，于37℃，200rpm条件下振荡培养，定时取样测纤维素酶酶活，当纤维素酶酶活最大时筛选得到菌株；
优选的，所述纤维素酶产酶液体培养基成分为羧甲基纤维素钠15g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，将上述成分加热使其充分溶解后，冷却并调节pH至7.0-7.2。
进一步的，所述(1)还包括对筛选得到的菌株进行菌株形态学和/或分子生物学鉴定，确定菌株种属以及是否致病。
进一步的，(2)中所述固体菌剂的制备方法为将(1)得到的菌株与麸皮以体积比1:1.5-1:3混合后进行发酵培养，发酵条件为37℃培养48h，让菌株附着于麸皮上，制成固体菌剂；优选的，将(1)得到的菌株与麸皮以体积比1:1.5混合。
进一步的，(3)中所述固体菌剂与粉碎的悬铃木落叶的体积比为1:5-3:5，所述有氧发酵条件为起始温度为自然室温，含水率为60％，并且保持25℃～40℃，15-20天，所述有机基质与粘壤土体积比为1:1-9:10(有机基质添加比例为50％-90％)。
本发明的第二个目的是提供采用前述的制备方法制备得到的改良粘壤土。
本发明的第三个目的是提供前述的改良粘壤土在栽培不接球白菜中的应用，所述改良粘壤土能够提高不结球白菜的生物产量和/或根系活力和/或可溶性糖含量。
本发明的有益效果如下：
本发明使用的材料为城市落叶--悬铃木落叶，目前大部分的城市落叶都是经过集中收集后进行焚烧和填埋处理，这些处理方法看似方便，但不仅浪费了大量的自然资源，还对城市环境造成不可估量的污染，严重影响城市的环境卫生和居民的身体健康。本发明采用资源化处理的方式处理城市落叶，比现有的填埋和焚烧技术更节省处理成本、减少对城市环境的污染以及对城市居民的健康危害，同时还解决了城市落叶难以处理等难题，将城市垃圾变为含有大量有机物质的栽培基质，在很大程度上减少了城市垃圾处理的成本以及对城市环境卫生的污染。
本发明用筛选到的高效降解纤维素酶的菌株对悬铃木落叶进行堆肥实验，经过资源化处理后的悬铃木落叶是具有大量矿物质营养物质的新型有机基质，其与粘壤土按一定比例混合后能够有效改善粘壤土栽培不结球白菜，能够有效减少草炭等不可再生资源的使用，并且能在很大程度上减少农业栽培成本以及栽培后栽培基质的处理成本，且不会对栽培环境造成二次污染。
采用本发明提供的新型有机基质改良粘壤土栽培不结球白菜能够显著提高不结球白菜的生物产量、根系活力、可溶性糖含量，有效改善不结球白菜的食用品质。
附图说明
图1 XJ10的透明圈
图2 不同菌株的D/d值
图3 XJ10的生长曲线
图4 XJ10的纤维素酶活力
图5 XJ10的形态观察图
图6 XJ10的电镜形态观察图
图7 XJ10的电泳凝胶图
图8 XJ10的系统发育树图谱
图9 悬铃木落叶资源化处理时堆体温度和室内温度变化趋势
图10 悬铃木落叶资源化处理时pH和EC变化趋势
其中，(a)为悬铃木落叶堆体的EC值随时间的变化趋势，图中显示，随着发酵时间的延长，堆体的EC值逐渐增大，并且在2020/12/3左右不再变化，可视为堆体发酵基本完成；(b)为悬铃木落叶堆体的pH值随时间的变化趋势，图中显示，随着发酵时间的延长，堆体的pH值逐渐增大，并且在2020/12/15左右不再变化，堆体pH逐渐达到中性偏弱碱性。
图11 新型有机基质改善粘壤土混合栽培不结球白菜效果图
图12 新型有机基质改良粘壤土栽培不结球白菜的根系活力和可溶性糖含量变化
其中，(a)为不结球白菜的根系活力的变化，由图可以看出，改良粘壤土能够给不结球白菜的根部提供良好的生长空间，使根系活力增大，根部的吸收能力增强；(b)为不结球白菜的可溶性糖含量变化，由图可以看出，添加新型有机基质的粘壤土中的营养物质增多，能够提高不结球白菜的可溶性糖含量，使不结球白菜的营养品质得到提升。
具体实施方式
实施实例1：目标菌株的筛选
(1)样品处理 收集悬铃木落叶，称取样品3g，放入装有玻璃珠且无菌的三角瓶中，加入200ml无菌蒸馏水，用封瓶膜封口后放入恒温振荡培养箱中，在37℃，200rpm条件下振荡30min，使落叶中的微生物游离到水中，得到菌株悬浮液。
(2)稀释 先用移液枪吸取1ml上述菌株悬浮液加入装有9ml无菌蒸馏水的试管中，配制成10-1稀释度的溶液，用漩涡振荡器振荡使其充分混合后再用移液枪吸取1ml 10-1稀释度的溶液加入到另一支装有9ml无菌蒸馏水的试管中得到10-2稀释度的溶液，依次类推，将菌株悬浮液分别制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的溶液。
(3)涂布 取每个稀释度的溶液进行涂布操作。将各稀释度的溶液用漩涡振荡器振荡使其充分混匀后，用移液枪吸取100ul菌株悬浮液点到固体平板中央位置，在培养基表面用涂布棒轻轻涂匀，每个稀释度涂3个固体平板。将稀释度、涂布时间标记好后，放入37℃生化培养箱中倒置静态培养。其中，固体平板的培养基成分为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂20g，pH值7.0～7.2，水1000ml。
(4)纯化、保藏 培养36h后取出平板，发现10-6稀释度菌落分布状态较好，不密不疏，可以很好的观察菌落形态，方便挑取单个菌。挑选颜色、形态不一致的菌落在固体平板上用划线法进行纯化，直至每个平板上的菌落颜色及形态单一后，进行菌种保藏操作，即用无菌牙签挑取单菌落后在固体培养基上划线，待长出菌苔后标好编号后放入4℃冰箱保藏。其中，固体平板的培养基成分为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20g，pH值7.0～7.2，水1000ml。
(6)初筛 将保藏的菌株用划线的方法进行活化，然后用无菌牙签挑取单菌落点接到纤维素平板筛选培养基上，每个菌种点接两次，并做三次重复，然后放入37℃生化培养箱中倒置静态培养，36h后取出纤维素酶筛选平板，倒入刚果红染色液直至染液铺满整个平板，染色20min后弃去刚果红染色液，然后倒入氯化钠漂洗液脱色20min，最弃去氯化钠漂洗液，观察菌落周围透明圈情况，并测量菌落直径(d)及透明圈直径(D)，计算D/d，选用比值较大的菌株进行菌株纤维素酶活性的复筛，如图1和图2所示，XJ10的D/d值最大，透明圈直径(D)/菌落直径(d)为3.35。其中，纤维素酶筛选平板培养基配方为羧甲基纤维素钠15g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，将上述成分加热使其充分溶解后，冷却并调节pH至7.0-7.2，然后再加入20g琼脂。
(7)生长曲线的测定 将初筛得到D/d的比值较大的细菌XJ10接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中(牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20g，pH值7.0～7.2，水1000ml)，放入37℃，200rpm的恒温振荡培养箱中进行培养，每3小时取样测菌体生长量，即菌液在600nm处的吸光值，如图3所示，XJ 10在36h时生长值达到最大值为1.58。
(8)复筛 取上一步中得到的D/d的比值较大的菌株进行纤维素酶活性的复筛实验。首先挑取该菌株在固体平板上的单菌落并接种到液体培养基中，在恒温振荡培养箱中于37℃，200rpm条件下振荡培养36h制得种子液，然后取1ml种子液接种纤维素酶产酶液体培养基中，于37℃，200rpm条件下振荡培养，每12h取样测纤维素酶酶活，即取1.5ml发酵液于无菌离心管中，在1000rpm条件下离心10min，取上清液作为粗酶液进行纤维素酶酶活的测定，如图4所示，在48h时酶活均达到最大值。其中，纤维素酶产酶液体培养基成分为羧甲基纤维素钠15g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，将上述成分加热使其充分溶解后，冷却并调节pH至7.0-7.2。
实施例2：菌株形态学鉴定
(1)菌落形态：将纯化的目标菌株点接到固体分离平板上，倒置放入37℃生化培养箱中培养36h后取出固体平板，如图5所示，观察到细菌菌落圆形，小而薄，表面光滑、湿润、较粘稠，半透明，色泽一致，质地均匀，易挑取。
(2)单菌株形态：挑取培养36h的XJ10于洁净载玻片上，滴加适量无菌蒸馏水使菌体和无菌水充分混合，于酒精灯上进行固定，然后采用革兰氏染液对菌体进行染色，用显微镜观察菌体，如图6所示，XJ10菌株为长杆状。
实施例3：菌种的分子生物学鉴定
(1)将纯化的菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃，200rpm恒温摇床中培养48h得到种子液。
(2)用1.5ml无菌离心管收集1ml种子液，在4℃，10000rpm条件下离心10min收集菌体弃去上清液，得到细菌菌体，用细菌基因组总DNA提取试剂盒按其操作说明提取菌株基因组总DNA，置于-20℃保存备用。
(3)采用PCR的方法扩增16S rDNA。PCR体系为(20ul)：模板DNA 1ul，上下游引物各1ul，primer star 10ul，水7ul。PCR反应条件：95℃预变性2min；98℃10s、54℃15s、72℃2min，共35个循环；72℃延伸5min，10℃终止反应。取PCR扩增产物20ul做琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图7所示，长度在1800bp左右。
(4)将得到的PCR产物送去生物公司测序，得到双向测通序列为
CTTGCGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTGTAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCAATTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGACCAGCTTTGATAGGATTGGCTCCACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTACTGGCCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCGCCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCATTCTAGAGTGCCCACCCGAAGTGCTGGCAACTAAAATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTCCTCTGTCCCGAAGGAAAGGTMYATCTCTRDACCGGTCAGAGGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATATCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCACCCAGTTTCCAGTGCGAACCAAGGTTGAGCCTTGGCCTTAAACACCAGACTTAAATGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCACTCCGATAGCAGTTACTCTATCGGACGTTCTTCCCTGGCAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGGCTTTCGCCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGTTCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCAGGCCCATCCGCAAGTGACAGATTGCTCCGTCTTTCATCATTCCCTCAGGAGAGGAAATGAGATATCCGGTATTAGCTCACGTTTCCGTGGGTTATCCCGGTCTTGCAGGCAGGTTGCCTACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACCATCAGGAGAGCAAGCTCTCCATCAAGTCCGCTCGACTGCATTATAGCGGTGCGCCC(SEQ IDNO.1)。
(5)提交菌株XJ10的16S rDNA序列于GenBank数据库，经Blast相似性搜索，获取相近典型菌株的基因序列，作出XJ10的发育树(如图8所示)，该菌株属于芽孢杆菌属。
实施例4：菌种的保藏
(1)平板保藏：将纯化的菌株用无菌牙签采用连续划线的方法在牛肉膏蛋白胨固体培养基上划线，倒置于37℃恒温生化培养箱中培养48h，将长出菌苔的平板放置在4℃冰箱冷藏保存，该菌种在两个月内有效。其中，固体培养基成分为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20g，pH值7.0～7.2，水1000ml。
(2)甘油保藏：将XJ10菌种接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃，200rpm恒温摇床中培养48h得到种子液。按照1：1的比例将种子液和40％的甘油转移到保菌管中，放置-70℃，该菌种在六个月内有效。其中，液体培养基成分为牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，pH值7.0～7.2，水1000ml；40％甘油为甘油和无菌水按2：3的比例配置。
实施例5：固体菌剂的制备
将保藏的菌株进行固体平板活化后，接种于液体培养基(配比为：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，pH值7.0～7.2，水1000ml)，按照实施例1中复筛的结果对菌种进行培养，48h后将培养的菌种与麸皮混合后进行发酵培养，(菌种:麸皮混合体积比＝1:1.5，发酵条件为37℃恒温培养48h)，让菌种附着于麸皮上，制成固体菌剂。
实施例6：悬铃木落叶的资源化处理
将制成的固体菌剂与提前粉碎的悬铃木落叶充分混匀，体积比为3:5，然后进行有氧发酵，有氧发酵起始条件：温度为室温，含水率为60％，并且保持25℃左右15-20天。定时进行翻堆、测定堆体温度和室内温度，实时监测堆体发酵进程，并且详细记录每次测量数据。
冬季进行废弃物的资源化处理，虽然发酵进程不如夏季发酵进程快，但其不会受外界较高温度的影响导致菌体死活以及产生刺鼻气味影响环境卫生。
悬铃木落叶资源化处理过程中室内温度和堆体温度变化如图9所示，由于是秋冬季进行悬铃木的资源化处理，室内温度相对较低，因此堆体温度维持25℃以上保持15-20天左右即可视为发酵完成，本试验发酵堆体从2020/11/16起，到2020/12/9堆体温度一直在25℃以上，可视为发酵完成，检测发酵堆体无刺鼻气味、无明显霉菌菌落，且堆体温度随室内温度变化明显。悬铃木落叶堆体的pH和电导率EC值随时间变化如图10所示，(a)为悬铃木落叶堆体的EC值随时间的变化趋势，图中显示，随着发酵时间的延长，堆体的EC值逐渐增大，并且在2020/12/3左右不再变化，可视为堆体发酵基本完成；(b)为悬铃木落叶堆体的pH值随时间的变化趋势，图中显示，随着发酵时间的延长，堆体的pH值逐渐增大，并且在2020/12/15左右不再变化，堆体pH逐渐达到中性偏弱碱性。pH和EC值均随时间变化而逐渐增大，并且在堆体发酵完成时逐渐保持稳定。
实施例7：新型有机基质改良粘壤土栽培不结球白菜
粘壤土土质细密，春季气温回升缓慢，栽培蔬菜的成熟期较晚；虽然保水保肥力强，但排水不良，缺水后易干裂,不宜耕作；播种后保苗比较困难，植株根部易老化，发育比较迟缓。但这类土壤中含有丰富的养分，有丰产潜力，稍加在土壤理化性质方面做改善，将成为良好的栽培土壤。本试验以经过资源化处理的悬铃木落叶制成的新型有机基质与粘壤土混合，致力于改善粘壤土栽培不结球白菜所带来的难题。
(1)试验材料 本试验在南京市南京农业大学园艺学院生科楼楼顶大棚内进行，不结球白菜种子来源于南京农业大学园艺学院不结球白菜课题组；
(2)混配基质 将发酵好的悬铃木落叶与粘壤土按照体积比为3:5、7:10、4:5、9:10，即添加新型有机基质的比例为60％、70％、80％、90％，充分拌匀混合备用；
(3)催芽、移栽 将颗粒饱满且大小一致的种子置于铺有被蒸馏水浸湿的双层滤纸的玻璃培养皿中，每个培养皿中均匀放置50粒种子。三天左右后，将长势一致且健壮的不结球白菜幼苗移入提前混配好并且浇透水的混合土壤中。
(4)栽培管理 每天定时观察不结球白菜幼苗的生长状态，及时补水打药，以保证不结球白菜受到外界环境干扰的可能性尽可能的小。
(5)测定不结球白菜的农艺性状和农艺品质，鉴定新型栽培有机基质改良粘壤土栽培不结球白菜的有益效果，结果显示，发酵好的悬铃木落叶与粘壤土在体积比为3:5、7:10、4:5、9:10时能够显著提高不结球白菜的生物产量、根系活力、可溶性糖含量，如图11所示，与没有添加新型有机基质的纯粘壤土处理的CK组相比，新型有机基质改良粘壤土栽培不结球白菜能够显著提高不结球白菜的生物产量；如图12所示，(a)为不结球白菜的根系活力的变化，由图可以看出，改良粘壤土能够给不结球白菜的根部提供良好的生长空间，使根系活力增大，根部的吸收能力增强；(b)为不结球白菜的可溶性糖含量变化，由图可以看出，添加新型有机基质的粘壤土中的营养物质增多，能够提高不结球白菜的可溶性糖含量，使不结球白菜的营养品质得到提升。新型有机基质改良的粘壤土栽培不结球白菜能够显著提高不结球白菜的根系活力，说明新型有机基质能够改善粘壤土的理化性质，使不结球白菜的根系能够在适宜的环境中吸收水分和养分，进而促进地上部生长发育，提高不结球白菜的生物产量。新型有机基质改良的粘壤土栽培不结球白菜显著提高了不结球白菜的可溶性糖含量，有效改善不结球白菜的食用品质，说明新型有机基质能够提供充足的养分，供不结球白菜生长发育。
本发明为一种有效改良粘壤土栽培不结球白菜的新型有机基质，其特征在于新型基质的主要材料为悬铃木落叶，通过菌种的筛选以及资源化处理—堆肥等农业微生物技术，制作出有效改良粘壤土栽培不结球白菜的新型基质。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种基于悬铃木落叶的改良粘壤土及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus )
<400> 1
cttgcggtta cctcaccgac ttcgggtgtt gtaaactctc gtggtgtgac gggcggtgtg 60
tacaagaccc gggaacgtat tcaccgcggc atgctgatcc gcgattacta gcaattccga 120
cttcatgcag gcgagttgca gcctgcaatc cgaactgaga ccagctttga taggattggc 180
tccacctcgc ggcttcgctt cccgttgtac tggccattgt agtacgtgtg tagcccaggt 240
cataaggggc atgatgattt gacgtcatcc ccgccttcct ccggtttgtc accggcagtc 300
attctagagt gcccacccga agtgctggca actaaaatca agggttgcgc tcgttgcggg 360
acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct gtctcctctg 420
tcccgaagga aaggtmyatc tctrdaccgg tcagagggat gtcaagacct ggtaaggttc 480
ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatact ccactgcttg tgcgggtccc cgtcaattcc 540
tttgagtttc agtcttgcga ccgtactccc caggcggaat gcttaatgtg ttaacttcgg 600
caccaagggt atcgaaaccc ctaacaccta gcattcatcg tttacggcgt ggactaccag 660
ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcgcctca gcgtcagtta cagcccagag 720
agtcgccttc gccactggtg ttcctccaca tatctacgca tttcaccgct acacgtggaa 780
ttccactctc ctcttctgca ctcaagtcac ccagtttcca gtgcgaacca aggttgagcc 840
ttggccttaa acaccagact taaatgaccg cctgcgcgcg ctttacgccc aataattccg 900
gacaacgctt gccccctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cggggctttc 960
ttctcaggta ccgtcactcc gatagcagtt actctatcgg acgttcttcc ctggcaacag 1020
agctttacga tccgaaaacc ttcatcactc acgcggcgtt gctccgtcag gctttcgccc 1080
attgcggaag attccctact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtgtc tcagtcccag 1140
tgtggccgtt caccctctca ggtcggctac gcatcgtcgc cttggtgagc cgttacctca 1200
ccaactagct aatgcgccgc aggcccatcc gcaagtgaca gattgctccg tctttcatca 1260
ttccctcagg agaggaaatg agatatccgg tattagctca cgtttccgtg ggttatcccg 1320
gtcttgcagg caggttgcct acgtgttact cacccgtccg ccgctaacca tcaggagagc 1380
aagctctcca tcaagtccgc tcgactgcat tatagcggtg cgccc 1425

Claims (10)

1.一种改良粘壤土的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)筛选菌株：收集悬铃木落叶，收集悬铃木落叶上的菌种，涂布培养、纯化，对获得的菌种进行初筛，挑选出纤维素降解能力强的菌株进行生长曲线的测定，取最佳生长状态的菌株后进行纤维素酶活测定的复筛，筛选得到菌株；
(2)制备菌剂：将(1)筛选得到的菌株制成固体菌剂；
(3)制备改良粘壤土：将(2)得到的固体菌剂与粉碎的悬铃木落叶混合进行有氧发酵，有氧发酵完成后得到有机基质，将有机基质与粘壤土混合，制备得到改良粘壤土。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(1)中所述收集悬铃木落叶上的菌种具体操作为，取收集到的悬铃木落叶加入蒸馏水振荡培养，得到菌株悬浮液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(1)中所述涂布培养具体操作为，将菌株悬浮液稀释至适宜浓度，涂布于固体平板培养基，37℃培养36h，所述固体平板培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(1)中所述纯化为挑选涂布培养得到的菌落在固体平板上用划线法进行纯化；优选的，还包括对纯化得到的菌种进行菌种保藏操作，所属保藏为用无菌牙签挑取单菌落后在固体培养基上划线，待长出菌苔后标好编号后放入4℃冰箱保藏，优选的，所述固体平板培养基为牛肉膏蛋白胨培养基。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(1)中所述初筛为采用刚果红染色法鉴别菌种的纤维素降解能力；所述复筛为挑取生长曲线的测定得到最佳生长状态的菌株接种到液体培养基中，在恒温振荡培养箱中于37℃，200rpm条件下振荡培养36h制得种子液，然后取种子液接种纤维素酶产酶液体培养基中，于37℃，200rpm条件下振荡培养，定时取样测纤维素酶酶活，当纤维素酶酶活最大时筛选得到菌株；
优选的，所述纤维素酶产酶液体培养基成分为羧甲基纤维素钠15g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，将上述成分加热使其充分溶解后，冷却并调节pH至7.0-7.2。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述(1)还包括对筛选得到的菌株进行菌株形态学和/或分子生物学鉴定，确定菌株种属以及是否致病。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(2)中所述固体菌剂的制备方法为将(1)得到的菌株与麸皮以体积比1:1.5-1:3混合后进行发酵培养，发酵条件为37℃恒温培养48h，让菌株附着于麸皮上，制成固体菌剂；优选的，将(1)得到的菌株与麸皮以体积比1:1.5混合。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，(3)中所述固体菌剂与粉碎的悬铃木落叶的体积比为1:5-3:5，所述有氧发酵条件为起始温度为自然室温，含水率为60％，并且维持25℃～40℃，15-20天，所述有机基质与粘壤土体积比为1:1～9:10。
9.采用权利要求1～8所述的制备方法制备得到的改良粘壤土。
10.权利要求9所述的改良粘壤土在栽培不结球白菜中的应用，其特征在于，所述改良粘壤土能够提高不结球白菜的生物产量和/或根系活力和/或可溶性糖含量。
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