CN113897306A - 一种复合微生物菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种复合微生物菌剂及其应用，包括：藤黄微球菌，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61867，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；枯草芽孢杆菌，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61868，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；拟蕈状芽孢杆菌，在2019年6月13日以保藏编号为GDMCC NO：60687，保藏于广东省微生物菌种保藏中心。本发明克服了现有技术的不足，设计合理，结构紧凑，该微生物菌剂易分离培养，发明人还建立了相应培养方法。研究表明，该复合微生物菌剂对作物具有很好的促生效果。该菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其溶磷功能稳定、高效、环境友好的优势，在农业种植方面具有很好的应用前景。

Description

一种复合微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其应用。
背景技术
长期以来，化肥在提高农作物产量方面发挥了巨大的作用，化肥在农业投入中所占的比例为40％-60％。但是化肥的大量使用不仅直接造成了农田土壤的板结硬化、土壤中菌群的结构变化，还间接带来了生态安全、食品安全等一系列问题，造成了大量的社会经济损失和严重的环境污染。
在国家农业现代化和可持续发展的战略要求下，开发新型的微生物肥料代替部分化肥就显得越来越重要。复合微生物菌剂作为生物肥料领域的一种新型微生物制剂，具有增产、抗病等诸多有益功能，是未来肥料领域的发展趋势。
复合微生物菌剂一般是将两种或多种微生物按照一定的比例混合进行繁殖培养，充分发挥菌群的相互作用，达到最佳应用效果的一种微生物菌剂。菌群的生命活动可以分解土壤中的化学物质，促进植物对营养物质的吸收。有些微生物还可以通过释放生长激素，抑制有害微生物的生长繁殖，具有化肥、有机肥和微生物肥三者的优点，是近年来研究较多的一种微生物菌剂。
为此，我们提出一种复合微生物菌剂及其应用。
发明内容
本发明的目的在于解决或者至少缓解现有技术中存在的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种复合微生物菌剂，包括：
藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61867，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61868，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)，在2019年6月13日以保藏编号为GDMCC NO：60687，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
该复合微生物菌剂重量组成份为：藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)1-2份，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)1-2份，拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)1-2份。
可选地，复合微生物菌剂在广西茅尾海以及弄岗国家级自然保护区的土壤中分离得到。
可选地，所述藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)，拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)的比例为1：1：1。
可选地，一种制备复合微生物菌剂的方法，包括如下步骤：
步骤1、材料准备；
步骤1.1、样品采样；
步骤1.2、制造分离纯化培养基：
步骤2、菌株的分离纯化；
步骤2.1、分离纯化：
将2g土壤样品加入18ml无菌水中制备土壤悬液，摇床(180r/min)震荡30min后，用无菌水梯度稀释成10-1-10-6倍的样品，取10-3、10-4两个稀释倍数的样品0.1ml涂于PDA培养基平板上，用于分离真菌；取10-5、10-6两个稀释倍数的样品0.1ml涂于LB固体培养基上，用于分离细菌；将PDA平板置于28℃培养箱，经2d、7d、14d后挑取单菌落于固体培养基纯化；将LB平板置于37℃培养箱，36h后挑取形态特征明显不一样的菌落在新的平板上划线，获得单菌落。
可选地，分离纯化培养基分别包括：
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL；
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL；
PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
可选地，一种复合微生物菌剂发酵液的制备方法，在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述菌液1ml接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后，采用3株菌按1：1：1的方式混合。
可选地，一种利用复合微生物菌剂发酵液促进植物生长的应用，其特征在于：将发酵完成的菌剂，采用喷雾的方法，按1％添加到肥料上，然后向植物施肥。
可选地，还包括对制备而成的复合微生物菌剂发酵液真空冷冻干燥，形成固体。
本发明实施例提供了一种复合微生物菌剂及其应用。具备以下有益效果：该复合微生物菌剂易分离培养，发明人还建立了相应培养方法。研究表明，该微生物菌剂对作物具有很好的促生效果。该菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其溶磷功能稳定、高效、环境友好的优势，在农业种植方面具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中3种株菌分别对枳壳苗株高增量柱形图；
图2为本发明中3种株菌分别对枳壳苗地径增量柱形图；
图3为本发明中3种株菌分别对枳壳苗叶片数增量柱形图；
图4为本发明提供的复合微生物菌剂对沃柑株高增量柱形图；
图5为本发明提供的复合微生物菌剂对沃柑地径增量柱形图；
图6为添加有本发明提供的复合微生物菌剂的肥料对桉树苗的株高增效效果柱形图；
图7为添加有本发明提供的复合微生物菌剂的肥料对桉树苗的地径增效效果柱形图；
图8为添加有本发明提供的复合微生物菌剂的肥料对玉米鲜重的增产效果柱形图；
图9为添加有本发明提供的复合微生物菌剂的肥料对玉米干重的增产效果柱形图；
图10为添加有本发明提供的复合微生物菌剂的肥料对沃柑地径的增量柱形图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种微生物菌剂，分别包含下列三株菌：
藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61867，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61868，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)，在2019年6月13日以保藏编号为GDMCC NO：60687，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
该复合微生物菌剂重量组成份为：藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)1-2份，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)1-2份，拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)1-2份。三种株菌的比例为1：1：1。
上述微生物菌剂在农业种植中的应用。
上述应用在于使用微生物菌剂浇灌作物。
上述微生物菌剂用于制备液体菌剂或者冻干粉。通过冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将药液里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将药液里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成。
上述液体菌剂或者冻干粉添加到液体肥或者固体肥中，形成液体菌肥或固体菌肥。更加利于保存和运输。
上述微生物菌剂能提升液体菌肥或固体菌肥对作物的效果。
发明人在广西茅尾海以及弄岗国家级自然保护区的土壤中分离得到本发明的功能微生物，藤黄微球菌，保藏编号为GDMCC NO：61867，分类命名为Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052。枯草芽孢杆菌，保藏编号为GDMCC NO：61868，分类命名为Bacillussubtilis-GXMD-hs-13035。拟蕈状芽孢杆菌，保藏编号为GDMCC NO：60687，分类命名为Bacillus Paenibacillus Gxun-30。
该微生物菌剂易分离培养，发明人还建立了相应培养方法。研究表明，该微生物菌剂对作物具有很好的促生效果。该菌株的发现丰富了我国的可利用微生物资源，其溶磷功能稳定、高效、环境友好的优势，在农业种植方面具有很好的应用前景。
实施例2
一、菌株的分离纯化鉴定
包括如下步骤：
步骤1材料准备
步骤1.1样品采样：采样土壤地点为广西弄岗国家级自然保护区，拨开表层土，采表层以下15cm深度的土样，保存于4℃培养箱中，带回实验室进行下一步处理。
步骤1.2分离纯化培养基：
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL。
PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
步骤2菌株的分离纯化
步骤2.1分离纯化
将2g土壤样品加入18ml无菌水中制备土壤悬液，摇床(180r/min)震荡30min后，用无菌水梯度稀释成10-1-10-6倍的样品，取10-3、10-4两个稀释倍数的样品0.1ml涂于PDA培养基平板上，用于分离真菌。取10-5、10-6两个稀释倍数的样品0.1ml涂于LB固体培养基上，用于分离细菌。将PDA平板置于28℃培养箱，经2d、7d、14d后挑取单菌落于固体培养基纯化。将LB平板置于37℃培养箱，36h后挑取形态特征明显不一样的菌落在新的平板上划线，获得单菌落。
步骤3菌株鉴定
将分离纯化好的菌株，用chelex-100法提取DNA，并对16SrRNA基因进行PCR扩增，16SrRNA基因序列由广州生工生物技术公司测定。根据测序结果，选取无害的且活性强的菌株开展实验。
实验例1
单株菌促生实验
2.1菌株发酵液的制配
将保存菌种在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述菌液1ml接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后用于浇灌实验苗。
2.2小苗促生实验
使用枳壳苗开展实验，具体步骤如下：
缓苗：将枳壳实验苗移栽至装有土+基质(1：1)的花盆中，确保原始的土营养相对一致。
选苗：缓苗一段时间后，挑取长势相对一致的枳壳苗开展实验。作实验组和对照组，其中实验组用本发明提供的菌株发酵液浇灌，对照组用等量的LB液体培养基浇灌。做好标记后，随机摆放。
浇菌：实验组每株实验苗浇5ml菌株发酵液，对照组每株实验苗浇5mlPDB液体培养基。每两周浇一次。
测量：使用直尺、游标卡尺等测量实验苗的株高、地径等指标。在浇灌菌剂前，测量初始数据，两个月后再次测量相关指标。实验结果表明，在两个月内，本发明提供的微生物菌剂中包含的三株菌的发酵液对枳壳苗具有明显的促生长效果。其中浇灌菌株Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052发酵液的枳壳苗相比于对照组的枳壳苗株高增加10.24％、地径增粗12.86％，叶片数增多59.41％。浇灌菌株Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035发酵液的枳壳苗相比于对照组的枳壳苗株高增加14.59％、地径增粗84.64％，叶片数增多41.18％。浇灌菌株Bacillus Paenibacillus Gxun-30发酵液的枳壳苗相比于对照组的枳壳苗株高增加4.42％、地径增粗43.21％，叶片数增多3.92％。实验结果如附图1-3所示。
实验例2
混合菌株促生实验
3.1菌株发酵液的制配
将上述筛选得出的单株菌发酵液对枳壳苗有明显促生效果的菌株，在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述菌液1ml接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后，采用3株菌按1：1：1的方式混合，用于浇灌实验苗。
3.2中苗促生实验
使用一年生沃柑苗开展实验，具体步骤如下：
选苗：挑取长势相对一致的沃柑开展实验。作实验组和对照组，其中实验组用本发明提供的菌株发酵液浇灌，对照组用等量的LB液体培养基浇灌。做好标记后，随机摆放。
浇菌：实验组每株实验苗浇5ml菌株发酵液，对照组每株实验苗浇5mlPDB液体培养基。每四周浇一次。
测量：使用直尺、游标卡尺等测量实验苗的株高、地径等指标。在浇灌菌剂前，测量初始数据，四个月后再次测量相关指标。实验结果表明，本发明提供的微生物菌剂对沃柑具有明显的促生长效果。在四个月内，浇灌上述微生物菌剂的沃柑相比于对照组的沃柑株高增加87.50％、地径增粗52.48％，。除此之外，上述菌株发酵液还能对沃柑起促梢效果。实验结果如附图4--5所示。
实验例3
桉树肥料增效实验
菌株发酵液的制配及添加
将上述筛选得出的对沃柑具有明显促生效果的混合微生物，先单株菌分别在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述3株菌的菌液1ml混合后同时接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后即可。将发酵完成的菌剂，采用喷雾的方法，按1％添加到肥料上。
缓苗：将桉树实验苗移栽至装有土+基质(1：1)的花盆中，确保原始的土营养相对一致。
选苗：缓苗一段时间后，挑取长势相对一致的桉树苗开展实验。作实验组和对照组，其中实验组施用上述添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料，对照组施用未添加微生物菌剂的肥料。做好标记后，随机摆放。
施肥：实验组每株实验苗施20g添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料，对照组每株实验苗施20g未添加微生物菌剂的肥料。只施肥一次。
测量：使用直尺、游标卡尺等测量实验苗的株高、地径等指标。在施肥前，测量初始数据，两个月后再次测量相关指标。
实验结果表明，施用添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料的桉树苗比对照组生长情况好。在两个月，施用添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料的桉树苗相比于对照组的桉树苗株高增加0.33％、地径增粗9.16％，实验结果如附图6--7所示。
实验例4
玉米肥料增效实验
菌株发酵液的制配及添加
将上述筛选得出的对沃柑具有明显促生效果的混合微生物，先单株菌分别在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述3株菌的菌液1ml混合后同时接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后即可。将发酵完成的菌剂，采用喷雾的方法，按1％添加到肥料上。
种苗：选取一块土质较为均匀的实验地，播种玉米。
选苗：待玉米长出10cm后，对实验地进行划区后开展实验。作实验组和对照组，其中实验组施用上述添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料，对照组施用未添加微生物菌剂的肥料。做好标记。
施肥：实验组每株实验苗施20g添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料，对照组每株实验苗施20g未添加微生物菌剂的肥料。只施肥一次。
测量：玉米主要测量的指标为产量，即玉米的鲜重及干重。
实验结果表明，施用添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料的玉米比对照组产量高。施用添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料的玉米相比于对照组的玉米鲜重增加1.25％、干重增加1.25％，实验结果如附图8--9所示。
实验例5
沃柑肥料增效实验
菌株发酵液的制配及添加
将上述筛选得出的对沃柑具有明显促生效果的混合微生物，先单株菌分别在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述3株菌的菌液1ml混合后同时接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后即可。将发酵完成的菌剂，采用喷雾的方法，按1％添加到肥料上
使用一年半生沃柑苗开展实验，具体步骤如下：
选苗：挑取长势相对一致的沃柑开展实验。作实验组和对照组，其中实验组施用上述添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料，对照组施用未添加微生物菌剂的肥料。做好标记后。
施肥：实验组每株实验苗施0.5kg添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料，对照组每株实验苗施0.5kg未添加微生物菌剂的肥料。只施肥一次。
测量：使用游标卡尺测量实验苗的地径。在施肥前，测量初始数据，两个月后再次测量相关指标。
实验结果表明，施用添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料的沃柑比对照组生长情况好。在两个月，施用添加有本发明提供的微生物菌剂的肥料的沃柑相比于对照组的沃柑地径增粗7.48％，实验结果如附图10所示。
基因序列如下：
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Figure BDA0003259163710000141
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Figure BDA0003259163710000171
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需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于，包括：
藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61867，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)，在2021年8月12日以保藏编号为GDMCC NO：61868，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)，在2019年6月13日以保藏编号为GDMCC NO：60687，保藏于广东省微生物菌种保藏中心；
该复合微生物菌剂重量组成份为：藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)1-2份，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)1-2份，拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)1-2份。
2.如权利要求1所述的一种复合微生物菌剂，其特征在于：所述复合微生物菌剂在广西茅尾海以及弄岗国家级自然保护区的土壤中分离得到。
3.如权利要求1所述的一种复合微生物菌剂，其特征在于：所述藤黄微球菌(Micrococcus luteus-GXMD-hs-11052)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis-GXMD-hs-13035)，拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus Paenibacillus Gxun-30)的比例为1：1：1。
4.如权利要求1所述的一种制备复合微生物菌剂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1、材料准备；
步骤1.1、样品采样；
步骤1.2、制造分离纯化培养基：
步骤2、菌株的分离纯化；
步骤2.1、分离纯化：
将2g土壤样品加入18ml无菌水中制备土壤悬液，摇床(180r/min)震荡30min后，用无菌水梯度稀释成10-1-10-6倍的样品，取10-3、10-4两个稀释倍数的样品0.1ml涂于PDA培养基平板上，用于分离真菌；取10-5、10-6两个稀释倍数的样品0.1ml涂于LB固体培养基上，用于分离细菌；将PDA平板置于28℃培养箱，经2d、7d、14d后挑取单菌落于固体培养基纯化；将LB平板置于37℃培养箱，36h后挑取形态特征明显不一样的菌落在新的平板上划线，获得单菌落。
5.如权利要求4所述的一种复合微生物菌剂及其应用，其特征在于：所述分离纯化培养基分别包括：
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL；
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化钠5.0g，琼脂粉15g，蒸馏水1000mL；
PDA培养基：马铃薯200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL。
6.如权利要求4所述的一种复合微生物菌剂发酵液的制备方法，其特征在于：在LB固体培养基上划线，挑单菌落到1mlLB液体培养基中震荡培养过夜，将上述菌液1ml接种到液体培养基中，摇床(30-32℃、150-200r/min)震荡培养一天后，采用3株菌按1：1：1的方式混合。
7.如权利要求6所述的一种复合微生物菌剂发酵液的制备方法，其特征在于：还包括对制备而成的复合微生物菌剂发酵液真空冷冻干燥，形成固体。
8.如权利要求6所述的一种利用复合微生物菌剂发酵液促进植物生长的应用，其特征在于：将发酵完成的菌剂，采用喷雾的方法，按1％添加到肥料上，然后向植物施肥。
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