CN107502548A - 一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法 - Google Patents

一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，该方法包括如下步骤：1)、将供试纤维素降解菌株进行活化与复壮，制备单菌株供试菌液；2)、将所述单菌株供试菌液经反复冻融筛选得到耐低温菌株；3)、测定所述耐低温菌株的秸秆降解能力，并保留比不接种菌的空白对照的秸秆分解失重率相对提高10％以上的菌株。该方法简便、快速、高效，尤其适合于东北黑土适配性好的秸秆低温降解菌株的筛选。

Description

一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体而言，涉及一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法。
背景技术
我国作物秸秆资源丰富，数量巨大，种类多样，每年的作物秸秆产出量7～8亿吨。由于秸秆在短期内不易腐解，利用效率低，绝大部分秸秆废弃或被焚烧，在种植业为主的地区，作物秸秆已经成为生产中的障碍。所以，焚烧秸秆遍及广大乡村，由此引起环境污染与有机资源的严重浪费。据统计，全国用作还田和有机肥料的作物秸秆仅占总量的20％左右，焚烧占17％，尚有50％未被利用。
我国北方地区的诸多省份都是农业大省，对秸秆处理的需求更为迫切。北方地区秋冬季节气候冷凉，不利于玉米秸秆木质素、纤维素的降解。所以突破北方地区不良气候的条件下，秸秆大规模、快速腐熟还田技术瓶颈是实现我国北方地区秸秆利用亟待解决的问题。选育和利用作物秸秆高效耐低温的降解微生物菌株，研发高效降解菌剂，建立作物秸秆田间原位生物转化还田技术，是解决我国北方秸秆降解问题的重要发展趋势之一。
利用秸秆降解微生物进行玉米、小麦、水稻秸秆的降解与原位还田具有巨大的应用潜力。然而，现有技术中还没有针对耐低温及高降解活性的微生物的成熟的筛选体系，阻碍了秸秆降解技术的发展。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，所述的方法可快速筛选得到目的菌株，操作简单，易于实现。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，包括如下步骤：
1)、将供试纤维素降解菌株进行活化与复壮，制备单菌株供试菌液；
2)、将所述单菌株供试菌液经反复冻融筛选得到耐低温菌株；
3)、测定所述耐低温菌株的秸秆降解能力，并保留比不接种菌的空白对照的秸秆分解失重率相对提高10％以上的菌株。
本发明提供的菌株筛选方法广泛适用于各种具有纤维素降解能力的菌株，例如各种芽孢杆菌，如苏云金芽孢杆菌、香草芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌等，由于耐低温菌株的数量相对于高秸秆降解能力菌株的数量更少一些，因此本发明先进行耐低温验证，后进行秸秆降解能力测定以提高筛选效率。
本发明所定义的高秸秆降解能力菌株，即比不接种菌的空白对照的秸秆分解失重率相对提高10％以上的菌株。
其中，所述秸秆为玉米、小麦或水稻秸秆，最优选为玉米秸秆。
优选的，在步骤1)中，将待检菌落接种于不加琼脂的细菌液体培养基内，在26～30℃温度下培养60～80h，制备单菌株供试菌液；
更优选的，所述不加琼脂的细菌液体培养基含有以下成分：
牛肉膏2～4g/L，蛋白胨8～12g/L，NaCl 3～7g/L，琼脂16～18g/L；溶剂为水。
优选的，如上所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，在步骤2)中，以1.5mL～3mL单菌株供试菌液：40克土壤的比例将所述单菌株供试菌液接种于无菌土壤中26℃～30℃培养2～4天后再进行反复冻融。
优选的，如上所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，所述无菌土壤的含水量为30％～50％田间持水率。
优选的，所述无菌土壤经湿热灭菌3～5次制得。
优选的，所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，所述反复冻融具体为以-18℃～-22℃保温20h～28h；18℃～22℃保温20h～28h为一个循环，冻融7～11个循环；
更优选的，冻融的循环次数还可以选择8、9、10次；
更优选的，所述反复冻融具体为以-18保温24h；20℃保温20h～28h为一个循环，冻融9个循环；
7～11个循环已接近一般纤维素降解菌株的耐寒能力极限，且用此方法筛选得到纤维素降解菌株完全可以适应我国东北地区的寒冷环境。
优选的，所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，在所述反复冻融后，取菌体存活数量大于1011cfu/g土壤为所述耐低温菌株。
优选的，在所述反复冻融后，对菌体计数的方法包括：
在摇瓶内加入无菌水，140～200r/min振荡20～40分钟制备土壤悬液，逐级稀释，平板计数法进行活菌计数测定。
优选的，所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，在步骤3)中，所述测定所述耐低温菌株的秸秆降解能力的方法包括：
将所述耐低温菌株接种到纤维素降解菌培养基与秸秆的混合体系中，在28℃～32℃、150r/min～190r/min振荡培养，测定培养第10～20天的秸秆失重率；
优选的，测定培养第10天、15天和20天的秸秆失重率；
其中，在第10天、15天和20天的任一次测定中的秸秆失重率比不接种菌的空白对照的秸秆分解失重率相对提高10％以上的菌株都可以作为目标菌株。
优选的，每个处理重复2～4次，同时做纤维素降解菌培养基+秸秆的空白对照。
优选的，如上所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，所述纤维素降解菌培养基的成分包括：
KH2PO4 0.3～0.8g/L、MgSO4 0.15～0.40g/L、蛋白胨1～3g/L、羧甲基纤维素钠1.5～2.0g/L、刚果红0.1～0.3g/L、琼脂16～18g/L；溶剂为水，pH＝6.8～7.2；
更优选的，所述纤维素降解菌培养基的成分为：
KH2PO4 0.5g/L、MgSO4 0.25g/L、蛋白胨2g/L、羧甲基纤维素钠1.88g/L、刚果红0.2g/L、琼脂17g/L；溶剂为水，pH＝7.0；
刚果红是结合到培养基的羧甲基纤维素钠上，但分解纤维素的细菌可以产纤维素酶，能分解羧甲基纤维素钠成为寡糖，这样刚果红就不能结合上去了，再将结合不牢的刚果红洗去就留下大大小小的透明圈，根据透明圈的大小可以方便的判断分解纤维素的能力。
一种耐低温秸秆复合菌系的筛选方法，在如上所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法之后还包括：
将筛选得到的多株耐低温秸秆降解菌株进行配列组合得到的多组菌株等比混合菌剂后分别接种于混合有秸秆的灭菌蛭石内，保持所述蛭石的饱和吸水状态，在23℃～27℃日间温度、18℃～22℃夜间温度的条件下培养；接种所述菌剂秸秆失重率与不接种所述菌剂的空白对照在培养第18～22天时失重率提高大于10％者为所筛选的复合菌系。
如上所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法在单菌株秸秆耐低温及降解功能验证中的应用。
如果样品中存在目标微生物，则可以按照本发明提供的筛选方法获得相应的微生物；如果样品中不存在目标微生物，同样也可以重复筛选检定的过程，以对单菌株秸耐低温及秆降解的能力进行验证。
如上所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法筛选得到的微生物菌株。
本发明筛选得到的性能较优的微生物有：
本发明提供的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，菌株名为A1，保藏编号CGMCCNO.14088；
本发明提供的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)，菌株名为A2，保藏编号CGMCC NO.14089；
本发明提供的香草芽孢杆菌(Bacillus vanillea)，菌株名为B2，保藏编号CGMCCNO.14090；
本发明提供的弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)，菌株名为D3，保藏编号CGMCCNO.14091；
上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间均为：2017年5月4日。经保藏中心于5月4日检测为存活菌株。
与现有技术相比，本发明建立了一套简便、快速、高效的东北黑土适配性好的秸秆低温降解菌株和菌株组合的筛选方法。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实施例1
1、实验材料
1.1菌株与土壤
供试菌株：菌种库保藏纤维素降解细菌。
东北黑土：吉林公主岭田间0～20cm表土。
1.2培养基
1.2.1细菌培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂16～18g，去离子水1L。
1.2.2细菌发酵培养基(YPD全营养培养基)：溶解酵母膏/酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L于1L去离子水中，pH 7.0。
1.2.3纤维素降解菌培养基：KH2PO4 0.5g、MgSO4 0.25g、蛋白胨2g、羧甲基纤维素钠(CMC)1.88g、刚果红0.2g、琼脂16～18g，去离子水1L，pH 7.0。
1.2.4基础营养液(赫奇逊氏培养基)：磷酸二氢钾1.0g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，去离子水1L，pH自然。
单菌株低温活性筛选方法
2.1菌株活化与复壮
接种环挑取保藏斜面管内的菌落接种于不加琼脂的细菌液体培养基(1.2.1)内，在28℃温度下培养72h，制备单菌株供试菌液。
2.2菌株低温活性筛选
250ml三角摇瓶内加入40克土壤，喷水润湿润至含水量为30～50％田间持水率，透气膜封口湿热灭菌3～5次，用细菌培养基(1.2.1)平板检验土壤无活菌后，接种2ml供试菌液，28℃培育3天，然后以-20℃保温24h；20℃保温24h为一个循环。冻融循环9次后，在摇瓶内加入100ml无菌水，往复震荡(转速170r/min)30分钟制备土壤悬液，逐级稀释，平板计数法进行活菌计数测定。当冻融循环后土壤中菌体数量>1011cfu/g土时，所接种的菌株判定为低温高活性。
表1
接种菌株 冻融循环9次后计数(cfu/g.土)
A1 1.38×1012
A2 2.72×1011
B1 9.50×1012
B2 1.16×1012
D1 6.50×1012
D2 5.60×1016
D3 1.26×1012
2.3摇瓶法筛选高效秸秆降解菌株
于100mL三角瓶中，加入50ml基础营养液(1.2.4)和5g烘干玉米碎秸秆，湿热法灭菌后，接种表1高活性低温菌株，在30℃、170r/min振荡培养10天、15天和20天，每个处理重复三次，同时做基础营养液+秸秆对照CK，测定培养10天、15天和20天秸秆失重率，接种菌株处理秸秆的减重率比不接种菌空白对照秸秆减重率相对提高10％以上分别为降解功能强的菌株。
表2
表3
根据表2和表3，接种10天降解效果好的菌株有A1、A2、B1和B2，接种15天秸秆降解功能强的菌株有B1、B2、D1、D2和D3，接种20天的高效秸秆降解菌株包括A1、A2、B2和D3。
2.4复合菌系筛选
设置A1A2-B-D型4株菌组合即除去2株菌之后任意B1或B2菌与D1、D2或D3的组合。将各菌株组合的菌悬液按照体积比1∶1混合，分别接种6mL于混合有5克烘干秸秆的灭菌蛭石内，保持蛭石饱和吸水状态，在人工气候室培养20天(25℃日、20℃夜)；测定20d时秸秆失重率，每个重复3次，同时做基础营养液+秸秆对照CK。接种菌剂秸秆失重率与相对空白提高百分率为促腐率，促腐率大于10％者为所筛选的复合菌系。实验结果得到A1A2B3D3、A1A2B2D3、A1A2B2D1、A1A2B2D5、A1A2B2D4等5组复合菌系。
其中，A1即对应本发明保藏的弯曲芽孢杆菌A1；A2对应本发明保藏的苏云金芽孢杆菌A2；B2对应本发明保藏的香草芽孢杆菌B2；D3对应本发明保藏的弯曲芽孢杆菌D3；
表4
实施例2
实施例2与实施例1的各操作一致，区别仅在于替换下列步骤：
步骤1.2.3替换为：纤维素降解菌培养基：KH2PO4 0.3g、MgSO4 0.4g、蛋白胨1g、羧甲基纤维素钠(CMC)1.5g、刚果红0.3g、琼脂18g，去离子水1L，pH 7.0。
步骤2.2替换为：250ml三角摇瓶内加入40克土壤，喷水润湿润至含水量为30～50％田间持水率，透气膜封口湿热灭菌3～5次，用细菌培养基(1.2.1)平板检验土壤无活菌后，接种1.5ml供试菌液，26℃培育4天，然后以-18℃保温28h；22℃保温28h为一个循环，冻融循环7次后，在摇瓶内加入100ml无菌水，往复震荡(转速170r/min)25分钟制备土壤悬液，逐级稀释，平板计数法进行活菌计数测定。当冻融循环后土壤中菌体数量>1011cfu/g土时，所接种的菌株判定为低温高活性。
步骤2.3替换为：
于100mL三角瓶中，加入50ml基础营养液(1.2.3)和5g烘干玉米碎秸秆，湿热法灭菌后，接种高活性低温菌株，在28℃、150r/min振荡培养10天、15天和20天，每个处理重复三次，同时做基础营养液+秸秆对照CK，测定培养10天、15天和20天秸秆失重率，接种菌株处理秸秆的减重率比不接种菌空白对照秸秆减重率相对提高10％以上分别为降解功能强的菌株。
实施例3
实施例3与实施例1的各操作一致，区别仅在于替换下列步骤：
步骤1.2.3替换为：纤维素降解菌培养基：KH2PO4 0.8g、MgSO4 0.15g、蛋白胨3g、羧甲基纤维素钠(CMC)2.0g、刚果红0.1g、琼脂16g，去离子水1L，pH 7.2。
步骤2.2替换为：250ml三角摇瓶内加入40克土壤，喷水润湿润至含水量为30～50％田间持水率，透气膜封口湿热灭菌3～5次，用细菌培养基(1.2.1)平板检验土壤无活菌后，接种3ml供试菌液，30℃培育2天，然后以-22℃保温20h；18℃保温20h为一个循环，冻融循环11次后，在摇瓶内加入100ml无菌水，往复震荡(转速170r/min)35分钟制备土壤悬液，逐级稀释，平板计数法进行活菌计数测定。当冻融循环后土壤中菌体数量>1011cfu/g土时，所接种的菌株判定为低温高活性。
步骤2.3替换为：
于100mL三角瓶中，加入50ml基础营养液(1.2.3)和5g烘干玉米碎秸秆，湿热法灭菌后，接种高活性低温菌株，在32℃、190r/min振荡培养10天、15天和20天，每个处理重复三次，同时做基础营养液+秸秆对照CK，测定培养10天、15天和20天秸秆失重率，接种菌株处理秸秆的减重率比不接种菌空白对照秸秆减重率相对提高10％以上分别为降解功能强的菌株。
实验例田间效果验证
从实施例1筛选得到的5组复合菌系中任选1组开展田间秸秆降解效果验证，以A1A2B2D3为例。在细菌发酵培养基中(1.2.2)制备单株菌液，糠麸粉按固液比1：2比例吸附单菌液，制备单菌剂A1、A2、B2、D3；4种单菌剂等比例混合、风干装袋，完成复合菌剂的制备。
玉米10月收获后粉碎，在秸秆表面均匀施撒5公斤复合菌剂，深翻30公分把秸秆埋入土中，同时埋入秸秆样袋，第二年春天开始测定秸秆样品腐解率(以减重率计算)。
表5
表6
表7
由表6和表7结果看出，在公主岭和双城春季玉米苗期和大喇叭口期(5月～7月)生长阶段，本方法筛选的复合菌剂在田间对翻埋秸秆有很好的促腐效果。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、将供试纤维素降解菌株进行活化与复壮，制备单菌株供试菌液；
2)、将所述单菌株供试菌液经反复冻融筛选得到耐低温菌株；
3)、测定所述耐低温菌株的秸秆降解能力，并保留比不接种菌的空白对照的秸秆分解失重率相对提高10％以上的菌株。
2.根据权利要求1所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，在步骤2)中，以1.5mL～3mL单菌株供试菌液：40克土壤的比例将所述单菌株供试菌液接种于无菌土壤中26℃～30℃培养2～4天后再进行反复冻融。
3.根据权利要求2所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述无菌土壤的含水量为30％～50％田间持水率。
4.根据权利要求1所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述反复冻融具体为以-18℃～-22℃保温20h～28h；18℃～22℃保温20h～28h为一个循环，冻融7～11个循环。
5.根据权利要求4所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，在所述反复冻融后，取菌体存活数量大于1011cfu/g土壤为所述耐低温菌株。
6.根据权利要求1所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，在步骤3)中，所述测定所述耐低温菌株的秸秆降解能力的方法包括：
将所述耐低温菌株接种到纤维素降解菌培养基与秸秆的混合体系中，在28℃～32℃、150r/min～190r/min振荡培养，测定培养第10～20天的秸秆失重率；
优选的，测定培养第10天、15天和20天的秸秆失重率。
7.根据权利要求6所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法，其特征在于，所述纤维素降解菌培养基的成分包括：
KH2PO4 0.3～0.8g/L、MgSO4 0.15～0.40g/L、蛋白胨1～3g/L、羧甲基纤维素钠1.5～2.0g/L、刚果红0.1～0.3g/L、琼脂16～18g/L；溶剂为水，pH＝6.8～7.2。
8.一种耐低温秸秆复合菌系的筛选方法，其特征在于，在权利要求1～8任一项所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法之后还包括：
将筛选得到的多株耐低温秸秆降解菌株进行配列组合得到的多组菌株等比混合菌剂后分别接种于混合有秸秆的灭菌蛭石内，保持所述蛭石的饱和吸水状态，在23℃～27℃日间温度、18℃～22℃夜间温度的条件下培养；接种所述菌剂秸秆失重率与不接种所述菌剂的空白对照在培养第18～22天时失重率提高大于10％者为所筛选的复合菌系。
9.权利要求1～8任一项所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法在单菌株秸秆耐低温及降解功能验证中的应用。
10.权利要求1～8任一项所述的耐低温秸秆降解菌株的筛选方法筛选得到的微生物菌株。
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