CN109182163B - 一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的提供了一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂及制备方法，所述复合菌剂由5株菌株构成，通过长年创造性筛选和积累得到低温条件可高效表达分解纤维素、半纤维素和木质素的酶，突破低温酶活力不足，腐熟降解秸秆困难等特点，在室外温度1℃‑6℃的环境下均表现优异，使腐熟天数提高了2‑3天，特别适合北方地区。

Description

一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物领域，具体涉及一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂及其应用。
背景技术
目前我国播种玉米面积在3亿亩左右，仅次于稻、麦，在粮食作物中居第三位，在世界上仅次于美国，玉米是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。玉米一直都被誉为长寿食品，含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、微量元素、纤维素等，具有开发高营养、高生物学功能食品的巨大潜力。玉米秸秆是供作饲料为主粮、经、饲兼用作物，玉米秸秆也是工、农业生产的重要生产资源。玉米秸秆含有丰富的营养和可利用的化学成分，可用作畜牧业饲料的原料，长期以来，玉米秸秆就是牲畜的主要粗饲料的原料之一，农作物秸秆属于农业生态系统中一种十分宝贵的生物质能资源。绝大多数秸秆被废弃于河道、路旁腐烂或在田间被直接焚毁，不但堵塞河道和道路交通，而且严重污染了环境并造成资源的巨大浪费。农作物秸秆属于农业生态系统中一种十分宝贵的生物质能资源。
由于秸秆在短期内不易腐解，导致秸秆资源长期没有得到合理的开发，除少量用于垫圈、喂养牲畜、部分用于堆沤肥外，大部分都作为生活燃料烧掉了，但秸秆中纤维素含量高，也存在少量木质素，在常温下性质十分稳定，因此降解非常缓慢。国内现有的秸秆腐熟剂很多，但大都由于环境温度或菌体生长速度的限制而对秸秆的降解效果大打折扣，尤其在北方，玉米产量十分高而气温寒冷的地区，微生物降解秸秆的腐熟利用更受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂，通过低温驯化5株菌株，按一定配比混合而成，尤其适合北方低温天气，对腐熟秸秆效果优异。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂含有5株菌株，产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis) CCTCC AA208050Laceyella；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年7月5日，保藏单位地址是中国湖北省武市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
优选地，所述复合菌剂含有5株菌株将菌液按照以下质量比混合，产纤维素酶类芽孢杆菌25％、产木聚糖酶链格孢菌15％、产漆酶疣孢漆斑菌30％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌15％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌15％。
一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂制备，是通过以下技术路线实现：富集培养各菌株、低温降解纤维素复合菌系的筛选及驯化、复合菌剂的混合，检测纤维素、半纤维素和木质素降解率的衡量所述复合菌剂的有效性。
更具体地，将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/ml。将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌25％、产木聚糖酶链格孢菌15％、产漆酶疣孢漆斑菌30％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌15％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌15％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
上述复合菌在降解秸秆中的应用。
本发明获得的有益效果：
本发明的所提供的一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂，所述复合菌剂由5株菌株构成，通过长年创造性筛选和积累得到低温条件可高效表达分解纤维素、半纤维素和木质素的酶，突破低温酶活力不足，腐熟降解秸秆困难等特点，在室外温度1℃-6℃的环境下均表现优异，将秸秆降解腐熟时间提前到8-9天，特别适合北方地区。
具体实施方式
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法，用疣孢漆斑菌T2901 制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10μL稀释好的菌悬液滴于 ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4％加入PDA培养基中)上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50％，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。
实施例2菌株的低温驯化
(1)富集培养菌株
将菌株接种到盛有150mL PDA培养基的三角瓶中，加入大小均为长度5cm，宽度2cm的滤纸片，30℃恒温震荡培养1h混匀，并将上清液做10-1-10-9稀释，各取1mL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的PDA培养基里，28℃静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的材料。PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L
天然玉米秸秆粉摇床培养：称取菌种来源样品5g加入以天然玉米秸秆粉为唯一碳源的 100mL玉米秸秆粉培养基(将PDA培养基中滤纸用玉米秸秆粉替代中，28℃150rpm培养，15d吸取5mL培养液转入新的玉米秸秆粉富集培养基，富集培养4代。
(2)低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化
采用滤纸崩解法，上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系，初始培养温度为28℃，在该温度下继代培养4代，选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短，pH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2℃，直至培养温度降低至4℃，通过观察滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力，边传代边挑选出降解能力保持较好的培养物，在驯化过程中，在8℃温度条件下连续培养8代，滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。
经过初步的低温驯化，结果在4℃条件下，得到的5株菌生长较好，说明其能够在低温条件正常生长。
该5株菌株为：产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA 208050Laceyella；
所述产漆酶疣孢漆斑菌T2901(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
实施例3复合菌剂的制备
将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/ml。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌25％、产木聚糖酶链格孢菌15％、产漆酶疣孢漆斑菌30％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌15％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌15％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
实施例4复合菌剂相关酶的检测
首先，采用相应酶检测平板对该菌产酶进行测定，纤维素、半纤维素用刚果红平板(刚果红培养基((NH4)2SO4 2g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.5g，CMC-Na 20g，NaCl 0.5g，刚果红0.3g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH7.2-7.6)检测即可，而三种木质素降解酶则分别需要愈创木酚、苯胺蓝等进行检测。待测试完成，采用DNS法，测定发酵液中两种纤维素酶 CMCase和FPase的活性，分别为79.88U/ml和54.62U/ml；同样采用DNS法测定木聚糖酶的活性为31.12U/ml。其中，一个酶活单位为每分钟每毫升酶液催化反应物生成1μg 单糖产物的酶量。分别以ABTS、藜芦醇、Mn 2+为反应底物，采用分光光度法，测定发酵液中漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(Lip)和锰过氧化物酶(Mnp)活性。经测定，三种酶的活性分别为78.34U/ml、62.84U/ml、44.35U/ml。定义每分钟氧化1μmol底物(ABTS、藜芦醇、Mn 2+)为一个酶活单位(U)，复合菌剂能够分泌降解纤维素、半纤维素、木质素的相关酶，而且酶活力普遍较高。
实施例5秸秆的降解
制得的复合菌剂，实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，昼夜温度为1℃-6℃，将玉米秸秆收获后将秸秆铺于实验田中，添加本发明复合菌剂，实验田按照每亩施用1kg实施例1制备的菌剂，对照组则不用秸秆发酵复合菌剂，然后灌水，观察秸秆腐熟变化情况：
表1不同处理的秸秆腐熟情况
Figure BDA0001769257870000051
结果表明，与未添加复合菌剂相比，复合菌剂能将秸秆降解腐熟时间提前到8-9天，即使 1℃-6℃的低温天气也能使秸秆有效腐熟，十分适合北方天气。

Claims (1)

1.一种低温高效降解玉米秸秆的复合菌剂，其特征在于：所述复合菌剂含有5株菌株，按照以下质量比混合，产纤维素酶类芽孢杆菌（Bacillus cellulosilyticus）25%、产木聚糖酶链格孢菌（Alternaria humicola ）15%、产漆酶疣孢漆斑菌（Myrothecium verrucaria）突变菌株T2901 30%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus Krassilnikov）15%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌（Laceyella tengchongensis）15%，进行充分搅拌混合获得混合菌液；
所述产纤维素酶类芽孢杆菌的保藏号为CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌的保藏号为CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌的保藏号为GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌的保藏号为 CCTCC AA 208050 ；
所述产漆酶疣孢漆斑菌突变菌株T2901，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
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