CN110835613B - 含枯草芽孢杆菌的复合菌剂及在低温下降解秸秆中的应用 - Google Patents

含枯草芽孢杆菌的复合菌剂及在低温下降解秸秆中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含枯草芽孢杆菌的复合菌剂，所述复合菌剂由6株菌株构成，在室外温度1℃‑6℃的环境下可以使水稻秸秆腐熟天数提高了2‑3天，特别适合北方地区。本发明的复合菌剂与水稻秸秆混合，对番茄的种植效果较好，即使在室温10℃左右，与不加复合菌剂的对照组比较可以使番茄植株生长更旺盛，收获期提前了14天，产量增加607kg/亩，病虫害发生率降低7.1％。本发明添加大量的芽孢杆菌能够有效的抑制土壤中的的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物，达到很强的净化土壤的作用。本发明所提供的复合菌剂作为辅肥增产效果明显，可有效地增强番茄对病虫害的抵抗能力，改善番茄品质。

Description

含枯草芽孢杆菌的复合菌剂及在低温下降解秸秆中的应用
技术领域
本发明涉及一种微生物领域，具体涉及一种含枯草芽孢杆菌的复合菌及其在低温下降解秸秆的应用。
背景技术
水稻秸秆即稻草是一个相当有特色的经济副产品，用途相当多。除供牛羊等牲畜食用，以稻草编成的草绳、草鞋与蓑衣，是许多农人的必备品。但最佳的方式是就地掩埋稻草，除不会制造空气污染外，尚可加强土壤的养份。据中国台湾农业改良会研究，稻田中就地掩埋稻草，能对水稻增产，同时田中的磷、钾、钙、铁、硅含量也都会增加。
由于北方的气温长期很低，稻草在短期内不易腐解，导致稻草资源长期没有得到合理的开发近年来，随着木质纤维素生物降解研究的不断深入，生物降解过程中各种微生物间的协同关系也逐渐受到人们的重视。研究表明，木质纤维素降解复合菌系的稳定性需要靠不同种类的微生物，包括具有纤维素降解能力的菌株和不具有纤维素降解能力的菌株间的相互作用来维持，从而充分利用微生物间的协同关系。因此，直接从自然界筛选出木质纤维素降解复合菌系成为现今新的研究热点。然而，目前所报道的复合菌系大多是在高温条件下表现出木质纤维素降解能力或需要对降解原料进行化学预处理，这些处理在一定程度上操作要求较高，耗能较多。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种含枯草芽孢杆菌的复合菌，通过低温驯化6株菌株，按一定质量比比混合而成，尤其适合北方低温天气，对腐熟秸秆效果优异。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种含枯草芽孢杆菌的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂含有6株菌株并按一定质量比混合，产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、枯草芽孢杆菌 30％，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA 208050Laceyella；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.7740；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌T2901(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期为2017年07月05日，保藏单位地址是中国湖北省武市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
一种含枯草芽孢杆菌的复合菌剂，是通过以下技术路线实现：富集培养各菌株、低温降解纤维素复合菌系的筛选及驯化、复合菌剂的混合、复合菌剂对秸秆的降解。
更具体地，将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、枯草芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL，将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、枯草芽孢杆菌30％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
上述复合菌在降解秸秆中的应用。
本发明获得的有益效果：
本发明所提供一种含枯草芽孢杆菌的复合菌剂，所述复合菌剂由6株菌株构成，在室外温度1℃-6℃的环境下可以使水稻秸秆腐熟天数提高了2-3天，特别适合北方地区。本发明的复合菌剂与水稻秸秆混合，对番茄的种植效果较好，即使在室温10℃左右，与不加复合菌剂的对照组比较可以使番茄植株生长更旺盛，收获期提前了14天，产量增加607kg/亩，病虫害发生率降低7.1％。本发明添加大量的芽孢杆菌能够有效的抑制土壤中的的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物，达到很强的净化土壤的作用。本发明所提供的复合菌剂作为辅肥增产效果明显，可有效地增强番茄对病虫害的抵抗能力，改善番茄品质。本发明的复合菌剂以及添加大量的枯草芽孢杆菌能够有效的抑制土壤中的的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物，达到很强的净化土壤的作用。
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法，用疣孢漆斑菌T2901 制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10μL稀释好的菌悬液滴于 ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4％加入PDA培养基中)上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50％，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。
实施例2菌株的低温驯化
(1)富集培养菌株
将菌株接种到盛有150mL PDA培养基的三角瓶中，加入大小均为长度5cm，宽度2cm的滤纸片，30℃恒温震荡培养1h混匀，并将上清液做10-1-10-9稀释，各取1mL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的PDA培养基里，28℃静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的材料。PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，富集培养4代。
(2)低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化
采用滤纸崩解法，上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系，初始培养温度为28℃，在该温度下继代培养4代，选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短，pH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2℃，直至培养温度降低至4℃，通过观察滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力，传代的同时挑选出降解能力保持较好的培养物，在驯化过程中，在4℃温度条件下连续培养8代，滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。
经过初步的低温驯化，结果在4℃条件下，得到的6株菌生长较好，说明其能够在低温条件正常生长。
该6株菌株为：产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、枯草芽孢杆菌，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA 208050Laceyella；
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.7740；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901，保藏号是CCTCC NO:M2017413。
实施例3复合菌剂的制备
将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、枯草芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、枯草芽孢杆菌30％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
实施例4水稻秸秆的降解
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，昼夜温度为1℃-6℃，将水稻秸秆收获后将秸秆铺于实验田中，添加本发明复合菌剂，实验田按照每亩施用1.8kg实施例1制备的菌剂，对照组则不用秸秆发酵复合菌剂，然后灌水，观察秸秆腐熟,变化情况：
表1不同处理的秸秆腐熟情况
Figure BDA0001769420180000051
结果表明，与未添加复合菌剂相比，复合菌剂能将水稻秸秆降解腐熟时间提前到9天，即使在1℃到6℃的低温天气也能使秸秆有效腐熟，十分适合北方天气。
实施例5复合菌处理水稻秸秆后还田种番茄
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，将水稻秸秆粉粹至3-5cm，秸秆与复合菌剂按质量比1000：1混合，堆肥4天得到微生物有机肥，作为基肥一次性施入，施用量1500kg/亩，栽种番茄后，加入常规氮磷化肥作为追肥，每次追肥10kg/亩，整个植物生长期和果实成熟期追肥5次，对照组与实验组加入等量的水稻秸秆，并用加等量的常规氮磷化肥作追肥。12月份定植后，每隔4天对棚内的室温、叶子和果实生长情况进行数据测试记录，结果如表2：
表2
组别 平均室温℃ 叶色 收货期提前天数 产量kg/亩 植物病害发生率％
对照组 10.5 绿 无 5263 9.9
实验组 10.8 浓绿 14 5870 2.3
试验结果表明，将本产品与常规化肥混合施入土壤后，植物植株生长旺盛，植株健壮，叶片浓绿，收获期提前了14天，产量增加607kg每亩，病虫害发生率降低7.1％。本发明添加大量的枯草芽孢杆菌能够有效的抑制土壤中的的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物，达到很强的净化土壤的作用。试验表明本产品作为辅肥增产效果明显，可有效地增强番茄对病虫害的抵抗能力，改善番茄品质。

Claims (1)

1.一种含枯草芽孢杆菌的低温高效降解秸秆复合菌剂，其特征在于：产纤维素酶类芽孢杆菌20%、产木聚糖酶链格孢菌10%、产漆酶疣孢漆斑菌20%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10%、枯草芽孢杆菌30%；
所述产纤维素酶类芽孢杆菌为Bacillus cellulosilyticus CGMCC 1.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌为Alternaria humicola CGMCC 3.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌为Bacillus mucilaginosus Krassilnikov GIM1.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌为 Laceyella tengchongensis CCTCC AA208050；
所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis CGMCC 1.7740；
所述产漆酶疣孢漆斑菌为Myrothecium verrucaria 突变菌株T2901，保藏号是CCTCCNO:M2017413。
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