CN102051338B - 利用甘薯淀粉废水生产有机磷农药降解菌剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用甘薯淀粉废水生产蜡样芽孢杆菌有机磷农药高效降解菌剂的方法，属于环境生物技术领域。有机磷农药降解株菌采用的是一株分离自油菜叶面的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其菌剂的生产方法包括5个步骤：培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、菌剂制备，以甘薯淀粉废水提供发酵培养基的主要碳源和水。由本发明技术方案不仅为高浓度甘薯淀粉废水的资源化利用提供了一条新途径，而且生产的有机磷农药降解菌剂能高效原位降解植物叶片上有机磷农药残留，保障食品安全，保护生态环境。

Description

利用甘薯淀粉废水生产有机磷农药降解菌剂的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种以甘薯淀粉废水为主要原料，生产有机磷农药高效降解菌剂的方法。

技术背景

有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，至今仍是农药中的用量最多的类别，在农业生产中起到了举足轻重的作用，我国有机磷农药的生产和使用量占农药总生产和使用量的一半以上。但是，有机磷农药具有较强的毒性，长期、大量使用后，其在农作物上的残留会引起食品安全问题，也影响了我国农产品出口，而且散落的农药也会使水和土壤受到污染。

利用微生物降解有机磷农药残留的生物修复方法具有低成本、无毒、无二次污染等优点，是最具应用前景的削减农药污染的方法之一。有机磷农药降解微生物筛选常用的方法是从长期遭受农药污染的土壤或水体中采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离得到单菌落，然后经驯化培养，或紫外化学诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工程、基因工程等技术手段构建工程菌株。例如：中国发明专利(申请号：200610090054.7)公开了一株降解有机磷农药的施氏假单胞菌，是从农药厂排污口土壤样品中分离的；中国发明专利(申请号：200410081019.X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌，是从长期农药污染的土壤中分离获得。

植物的叶际是指植物的地上部分，包括叶、茎、花、果等的表面或内部的小环境。在植物的叶际范围内生活着多种微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物。对于叶际微生物而言，植物叶际环境相当恶劣，在强烈的日照下，其表面干燥，温度可以达到50℃，紫外线强烈，而夜晚温度又骤降，还有刮风、下雨等天气变化等。对于分离自土壤、污泥等来源的农药降解微生物，不一定能适应植物叶际的恶劣环境，其降解效率往往会受到显著影响。我们从植物的叶际分离到一株有机磷农药高效降解菌株，能够在叶际长期生存，比较适应多变的叶际环境，适合原位降解作物表面的农药残留。

甘薯易腐烂，不宜长期存放。甘薯的深加工，可以解决因贮存鲜薯不当而导致大量烂薯的现象，甘薯精制淀粉经过不同深度的加工，可生产出数百种有价值的产品，增值10-30倍左右。但是，目前的加工工艺，每生产1吨甘薯淀粉大约产出6吨高浓度有机废水，这些废水的COD值高达10000mg/L以上，主要含有溶解性淀粉、蛋白质、果胶、有机酸及少量的油脂，易腐败发酵，使水质发黑发臭，排入河流会消耗水中的溶解氧，促进藻类及水生植物繁殖，量大时河流严重缺氧，发生厌氧腐败，散发恶臭，鱼、虾、贝类等水生动物可能会因此而窒息死亡。而采用一般污水处理工艺将如此高浓度的废水处理达标，消耗惊人。从另一个角度考虑，甘薯淀粉废水中的有机质(包括：蛋白质、果胶、糖类等)是微生物生长的良好营养底物，可以做成微生物培养基，发酵生产微生物产品。

本专利发明了一种用甘薯淀粉废水为主要原料，生产有机磷农药降解菌剂的方法，采用的菌株是从油菜叶际分离出的一株高效降解有机磷农药的芽孢杆菌。目前尚未发现文献报道用甘薯淀粉废水生产有机磷农药降解菌剂的生产方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用甘薯淀粉废水为主要原料，生产高效降解有机磷农药的叶际微生物菌剂的方法。

本发明采用的降解有机磷农药的菌株是由我们实验室从油菜的叶面上分离筛选出来的。将其编号为N20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年12月3日，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。保藏编号为：CGMCC No.3497。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为GU086424。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与蜡样芽孢杆菌的相似性最高，可以达到99％以上。

本发明所述的菌剂的生产方法如下：

1、培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏1g，氯化钠5g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化钠5g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

3)种子培养基(液体，10L)：MgSO₄1.0g，KH₂PO₄5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄15.0g，蛋白胨10g，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5；

4)发酵培养基(液体，200L)：MgSO₄20g，KH₂PO₄100g，NaCl 100g，K₂HPO₄300g，(NH₄)₂SO₄0.8kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15-30min。

2、菌种活化：挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，35℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至5×10⁹-2×10¹⁰CFU/mL，加入甘氨酸(质量分数0.3％-2％)和甘油(质量分数0.5％-5％)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。

由本发明技术方案生产的有机磷农药降解菌剂能够有效降解作物表面残留的有机磷农药。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：有机磷农药降解菌剂生产

(1)培养基配制：

2)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏1g，氯化钠5g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

5)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化钠5g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

6)种子培养基(液体，10L)：MgSO₄1.0g，KH₂PO₄5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄15.0g，蛋白胨10g，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5；

7)发酵培养基(液体，200L)：MgSO₄20g，KH₂PO₄100g，NaCl 100g，K₂HPO₄300g，(NH₄)₂SO40.8kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15min。

2、菌种活化：挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，30℃连续划线挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150r/min摇床振荡培养20h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％的接种量接种菊酯农药降解菌，于30℃，通空气培养20h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基中，接种有机磷农药降解菌，于30℃，通空气培养30h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至10¹⁰cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.5％)和甘油(质量分数1.5％)，灌装保藏。

实施例2：有机磷农药降解菌剂对油菜叶面敌敌畏农药残留的降解效果

1)选取两个完全相同的油菜地块，各30m²，均匀喷洒1000倍稀释的80％敌敌畏乳油农药；

2)喷洒敌敌畏12h后，害虫已被杀死，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释600倍)，以喷施清水作对照；

3)喷洒菌剂24h后，五点取样法检测油菜叶面敌敌畏残留，发现喷洒菌剂的处理组与不喷洒菌剂的对照组相比，敌敌畏残留量显著降低，低于蔬菜中敌敌畏残留国家限量标准(0.1mg/kg)。

实施例3：有机磷农药降解菌剂对油菜叶面乐果的降解效果

1)选取两个完全相同的油菜地块，各30m²，均匀喷洒1000倍稀释的50％乐果乳油农药；

2)12h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释600倍)，以喷施清水作对照；

3)48d后，五点取样法检测油菜叶面乐果的残留，发现处理组较对照组油菜中乐果残留量显著降低，低于蔬菜中乐果残留国家限量标准。

本发明所提供的降解有机磷农药的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年12月3日，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。保藏编号为：CGMCC No.3497。

Claims (1)

1.一种利用甘薯淀粉废水生产蜡样芽孢杆菌有机磷农药降解菌剂的方法，其特征在于：发酵培养基以甘薯淀粉废水为主要原料，生产步骤包括：

(1)培养基配制：

1)菌种保藏培养基：蛋白胨2g，酵母膏1g，氯化钠5g，琼脂20g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

2)菌种活化培养基：蛋白胨2g，酵母膏2g，氯化钠5g，加甘薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5；

3)种子培养基：MgSO₄1.0g，KH₂PO₄5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄15.0g，蛋白胨10g，加甘薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5；

4)发酵培养基：MgSO₄20g，KH₂PO₄100g，NaCl 100g，K₂HPO₄300g，(NH₄)₂SO₄0.8kg，加甘薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15-30min；

(2)菌种活化：挑取蜡样芽孢杆菌CGMCC3497菌株至菌种保藏培养基，35℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；

(3)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子；

(4)液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物；

(5)菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至5×10⁹-2×10¹⁰CFU/mL，加入质量分数为0.3％-2％的甘氨酸和质量分数为0.5％-5％的甘油，灌装保藏，使用时用水稀释500-1000倍。