CN101705201B

CN101705201B - 一株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法

Info

Publication number: CN101705201B
Application number: CN2009102413559A
Authority: CN
Inventors: 彭霞薇; 姜丹; 荆梦; 安晓宇; 杨建州; 白志辉
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2029-12-07
Also published as: CN101705201A

Abstract

本发明涉及一株分离自油菜叶际的能够高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，并提供其菌剂的生产方法，属于生物技术领域。经鉴定这株菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，并将其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.3497，该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到GenBank数据库，登录号为GU086424。其菌剂的生产方法包括5个步骤：培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、菌剂制备，发酵培养基己糖蜜为主要原料。由本发明技术方案生产的有机磷农药降解菌剂能高效原位降解植物叶片上有机磷农药残留，保障食品安全，保护生态环境。

Description

一株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株分离自油菜叶际的能高效降解有机磷类农药的芽孢杆菌，及其菌剂的生产方法。

技术背景

有机磷农药以其品种多、药效高、防治范围广谱等特点，至今仍是农药中的用量最多的类别，在农业生产中起到了举足轻重的作用，我国有机磷农药的生产和使用量占农药总生产和使用量的一半以上。但是，有机磷农药具有较强的毒性，长期、大量使用后，其在农作物上的残留会引起食品安全问题，也影响了我国农产品出口，而且散落的农药也会使水和土壤受到污染。

利用微生物降解有机磷农药残留的生物修复方法具有低成本、无毒、无二次污染等优点，是最具应用前景的削减农药污染的方法之一。有机磷农药降解微生物筛选常用的方法是从长期遭受农药污染的土壤或水体中采集样品，经富集培养、平板划线等操作，分离得到单菌落，然后经驯化培养，或紫外化学诱变等方法获取高效降解菌株，或通过细胞工程、基因工程等技术手段构建工程菌株。例如：中国发明专利(申请号：200610090054.7)公开了一株降解有机磷农药的施氏假单胞菌，是从农药厂排污口土壤样品中分离的；中国发明专利(申请号：200410081019.X)公开了一株降解有机磷农药的苍白杆菌，是从长期农药污染的土壤中分离获得。

植物的叶际是指植物的地上部分，包括叶、茎、花、果等的表面或内部的小环境。在植物的叶际范围内生活着多种微生物，主要有细菌、真菌、放线菌等，这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物。对于叶际微生物而言，植物叶际环境相当恶劣，在强烈的日照下，其表面干燥，温度可以达到50℃，紫外线强烈，而夜晚温度又骤降，还有刮风、下雨等天气变化等。对于分离自土壤、污泥等来源的农药降解微生物，不一定能适应植物叶际的恶劣环境，其降解效率往往会受到显著影响。而从植物的叶际分离的农药降解微生物能够在叶际长期生存，比较适应多变的叶际环境，更适合原位降解作物表面的农药残留。

本专利是从油菜叶际分离出的一株高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，能够在植物叶际环境下保持良好的降解性能。目前尚未发现从油菜叶际分离出降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂生产方法的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解有机磷农药的叶际微生物菌剂的生产方法。

本发明采用的降解有机磷农药的菌株是由我们实验室从油菜的叶面上分离筛选出来的。将其编号为N20，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年12月3日，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。保藏编号为：CGMCC No.3497，保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为GU086424。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与蜡样芽孢杆菌的相似性最高，可以达到99％以上。

本发明所述的菌剂的生产方法如下：

1、培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

3)种子培养基(液体，10L)：MgSO₄1.0g，KH₂PO₄5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄15.0g，蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.0-7.5；

4)发酵培养基(液体，200L)：MgSO₄20g，KH₂PO₄100g，NaCl 100g，K₂HPO₄300g，糖蜜12kg，(NH₄)₂SO₄0.8kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15-30min。

2、菌种活化：挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至10¹⁰cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.3％-2％)和甘油(质量分数0.5％-5％)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。

由本发明技术方案生产的有机磷农药降解菌剂能够有效降解作物表面残留的有机磷农药。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：有机磷农药降解菌剂生产

(1)培养基配制：

1)菌种保藏培养基(固体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.2；

2)菌种活化培养基(液体，1L)：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.2；

3)种子培养基(液体，10L)：MgSO₄1.0g，KH₂PO₄5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄15.0g，蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.2；

4)发酵培养基(液体，200L)：MgSO₄20g，KH₂PO₄100g，NaCl 100g，K₂HPO₄300g，糖蜜12kg，(NH₄)₂SO₄0.8kg，加水至200L，pH 7.2；

以上培养基均在121℃灭菌15min。

2、菌种活化：挑取有机磷农药降解菌至菌种保藏培养基，30℃连续划线挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于30℃，150r/min摇床振荡培养20h；

3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％的接种量接种菊酯农药降解菌，于30℃，通空气培养20h，得到液体种子。

4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基中，接种有机磷农药降解菌，于30℃，通空气培养30h，得到活菌体培养物。

5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至10¹⁰cell/mL，加入甘氨酸(质量分数0.5％)和甘油(质量分数1.5％)，灌装保藏。

实施例2：有机磷农药降解菌剂对油菜叶面敌敌畏农药残留的降解效果

1)选取两个完全相同的油菜地块，各30m²，均匀喷洒1000倍稀释的80％敌敌畏乳油农药；

2)6h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释600倍)，以喷施清水作对照；

3)24h后，五点取样法检测油菜叶面敌敌畏残留，发现处理组较对照组敌敌畏残留量减少80％左右。

实施例3：有机磷农药降解菌剂对油菜叶面乐果的降解效果

1)选取两个完全相同的油菜地块，各30m²，均匀喷洒1000倍稀释的50％乐果乳油农药；

2)6h后，均匀喷施农药降解菌剂(用清水稀释800倍)，以喷施清水作对照；

3)36d后，五点取样法检测油菜叶面乐果的残留，发现处理组较对照组乐果残留量减少65％左右。

本发明所提供的降解有机磷农药的菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年12月3日，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。保藏编号为：CGMCC No.3497。

Claims

1.一株能够高效降解有机磷农药的芽孢杆菌，其特征在于：该菌株是一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.3497。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌，其特征在于：该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到GenBank数据库，登录号为GU086424。

3.用权利要求1所述芽孢杆菌生产菌剂的方法，其特征在于：发酵培养基以糖蜜为主要营养物质，生产步骤包括：

(1)培养基配制：

1)菌种保藏培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，琼脂20g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

2)菌种活化培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠5g，加水至1L，pH 7.0-7.5；

3)种子培养基：MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 5.0g，NaCl 5.0g，K₂HPO₄ 15.0g，蔗糖100g，蛋白胨50g，加水至10L，pH 7.0-7.5；

4)发酵培养基：MgSO₄ 20g，KH₂PO₄ 100g，NaCl 100g，K₂HPO₄ 300g，糖蜜12kg，(NH₄)₂SO₄ 0.8kg，加水至200L，pH 7.0-7.5；

以上培养基均在121℃灭菌15-30min；

(2)菌种活化：挑取有机磷农药降解菌CGMCC No.3497至菌种保藏培养基，30℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落接种于菌种活化培养基中，于30℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h；

(3)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种步骤(2)活化的有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子；

(4)液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5％-10％的接种量接种步骤(3)制备的有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物；

(5)菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，超滤浓缩，调节至5×10⁹-2.0×10¹⁰CFU/mL，加入质量分数在0.3％-2％范围内的甘氨酸和质量分数在0.5％-5％范围内的甘油，灌装保藏；使用时用水稀释300-1000倍。