CN109251880B - 一种蜡样芽胞杆菌及其在改善水体磷污染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种蜡样芽胞杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2018679。本发明所述蜡样芽胞杆菌具有厌氧释磷好氧聚磷的功能，属于一种聚磷菌，当其处于好氧聚磷能力状态时，其可以使污水样品中磷去除率高达95％，使水体中磷含量达到国家规定标准，且其去磷速度快，去磷效果维持时间久，在治理污水磷污染中具有广阔的应用前景。

Description

一种蜡样芽胞杆菌及其在改善水体磷污染中的应用
技术领域
本发明涉及污水处理技术领域，尤其是涉及一种蜡样芽胞杆菌及其在改善水体磷污染中的应用。
背景技术
近年来，随着工农业的飞速发展，人类对环境开发资源利用活动的日益增加，许多富含氮磷等营养成分的废水未经合理处理而直接输入水体，从而导致我国地表水体富营养化现象日趋严重。磷作为水体富营养化的限制性因子，采用合理方法降低污水中磷含量已成为重中之重。传统的除磷方式包括物理方法和化学方法，比如，机械除藻、引水冲淤、以及投加化学试剂等措施。但是上述方法不仅投入成本高，且不能达到治本的目的，同时易引起对水体的二次污染。
相比于物理和化学方法，利用微生物自身的降解、吸收和转化等途径除去磷的方法，因具有在除去水体中磷的同时，还可以修复已经受损的水体生态平衡，并且微生物除磷所需成本低，操作简单容易掌控，且具有长期的治理效果等优点，而逐渐成为研究热点。
聚磷菌，又称聚磷微生物是一类特殊兼性菌，是指一类能够吸收磷酸盐并将磷酸盐聚集成多磷酸盐储存于细胞内的微生物，包括不动杆菌属、气单胞菌属、微丝菌属等。聚磷菌在厌氧状态下会释放磷，在好氧状态下能够超量吸收磷，使体内的含磷量比一般的细菌体内的含量高出数倍，并将磷以聚磷酸盐颗粒异染粒的形式储存于细胞内。常见的聚磷菌
红树林是陆地向海洋过渡的处于潮间带环境的特殊生态系统，其土壤因受海潮搬运等原因而兼有海洋和陆地两者的性质却又与二者不同，生活着多种具有治理水体富营养化能力的微生物。
发明内容
基于此，本发明的一个目的在于，提供一种新的、红树林土壤来源的聚磷菌，其属于蜡样芽胞杆菌属。该菌株能够吸收水体中的磷聚集到自身机体中，并且其聚集磷的能力持久，从而能够有效降低水体中磷的含量，解决水体富营养化问题。
本发明采用的技术方案如下：
一种蜡样芽胞杆菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018679。
本发明所述的蜡样芽胞杆菌株具有厌氧释磷和好氧聚磷的功能，当其处于好氧聚磷能力状态时，其可以使污水样品中磷去除率高达95％，使水体中磷含量达到国家规定标准，且其去磷速度快，去磷效果维持时间久，故在污水磷污染治理中具有广阔的应用前景。
本发明还提供所述蜡样芽胞杆菌株的两种培养方法，其中一种培养方法，包括以下步骤：
S1接种：所述蜡样芽胞杆菌株以1.0×105～5.0×106个/ml接种浓度、体积比1:100接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于28℃，以180～220rpm速度振荡，恒温培养24～48小时。
进一步地，所述培养基为2216E液体培养基，所述2216E液体培养基包括以下重量份的原料：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。
另一种培养方法，包括以下步骤：
S1接种：所述蜡样芽胞杆菌株以1.0×105～5.0×106个/ml接种浓度、体积比1:100接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于37℃，以180～220rpm速度振荡。恒温培养24～48小时。
进一步地，所述培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。
优选地，步骤S1中的接种浓度为2.5×106个/ml。
优选地，步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1％。
优选地，步骤S2中的培养时长为28小时。
优选地，步骤S2中的培养时长为24小时。
本发明的另一个目的在于提供所述的蜡样芽胞杆菌株在改善水体磷污染中的应用。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1为基于本发明的蜡样芽胞杆菌株在2216E琼脂固体培养基上培养48h后的菌落形态图；
图2为本发明的蜡样芽胞杆菌株在聚磷培养基上培养48h后的菌落形态图；
图3为基于本发明的蜡样芽胞杆菌株在LB固体培养基上培养48h后的菌落形态图；所述LB固体培养基的配方按照以下重量份组成：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、琼脂粉15份、无菌水1000份；。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入10ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存；
图4为本发明的蜡样芽胞杆菌16SrRNA序列的PCR扩增核酸电泳图；
图5为基于本发明的蜡样芽胞杆菌株与相似菌种的16S rRNA序列条形码构建的进化树；
图6为不同处理时长培养本发明的蜡样芽胞杆菌株与去磷性能之间的关系图。
具体实施方式
本发明所述的蜡样芽胞杆菌株，命名为Bacillus cereus.MS2，于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国湖北省武汉市武汉大学校内中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC NO:M2018679。
实施例一：分离纯化方法
本发明所述的蜡样芽胞杆菌株的分离纯化方法，步骤如下：
S1：称取10g的土壤样品，所述土壤样品来自广东省海陵岛红树林国家湿地公园的红树林土壤；然后，于超净工作台中，向土壤样品中添加90ml无菌水，置于振荡器上振荡60min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液；待土壤分散后，吸取100ul土壤悬液到900ul无菌水中得到10倍稀释液，然后依次稀释10倍，得到102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液，整个过程在超净工作台中进行。
S2：取100ul的10倍稀释液、102倍稀释液、103倍稀释液、104倍稀释液、105倍稀释液和106倍稀释液分别涂布于2216E琼脂固体培养板上，然后将培养板置于培养箱28℃恒温培养2～3天，培养板上长出菌斑。
S3：培养结束后，根据菌落生长情况从适当稀释梯度平板一一挑取形状、颜色、大小等不同的单菌斑进行平板划线，分离出本发明所述的蜡样芽胞杆菌株。本发明所述的蜡样芽胞杆菌株在2216E琼脂固体培养板上培养48h的形态，如图1所示，本发明蜡样芽胞杆菌菌落呈灰白色不规则状，质地较软，表面粗糙，菌落向周围扩散。
S4：从2216E挑取已纯化培养的菌株，接种于内含200ml 2216E液体培养基的500ml锥形瓶中，在28℃、180rpm恒温摇床培养条件下培养28h，制得种子液。所述种子液与甘油按照1:4的体积比装管并混匀得到浓度为1.0×105～5.0×106个/ml的甘油种子液，在管壁上做好标记后，于-20℃保存，或于-80℃长期保存。
所述2216E琼脂固体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、琼脂15份、无菌水1000份。配制方法为：称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，于超净台上倒入培养皿中，每个培养皿约倒入20ml培养基，冷却凝固后，将固体培养板于4℃保存。
所述2216E液体培养基的配方按照以下重量份组成：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例二：确认本发明的蜡样芽胞杆菌株是否具有聚磷功能
S1接种：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液；
S2培养基鉴定：吸取20ul已活化的菌液涂布于聚磷菌固体培养基上，置于生化培养箱中28℃恒温培养2～4天，观察聚磷菌培养基上是否有菌生长，若有菌生长，则表明菌株具有一定的聚磷功能；若无菌生长，则表明菌株无聚磷能力。
结果如图2所示：本发明的蜡样芽胞杆菌株(Bacillus cereus.MS2)在聚磷菌培养基上生长良好，培养48h后菌落呈白色、圆形、表面光滑状态。表明本发明的蜡样芽胞杆菌株(Bacillus cereus.MS2)具有聚磷功能，属于聚磷菌，有初步应用于降解污水中磷的潜力。
所述2216E液体培养基配方与实施例一相同。
所述聚磷菌固体培养基培养基的配方按照以下重量份组成：硫酸铵2.75份、磷酸二氢钠20份、磷酸二氢钾3份、七水硫酸镁0.25份、氯化钙0.25份、柠檬酸钠4.0份、氯化钠2.5份、蔗糖0.01份、琼脂粉15份、无菌水1000份。称取和量取上述各组分后，将各组分搅拌溶解在无菌水中后分装至锥形瓶中，然后将锥形瓶用灭菌纸封口后，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例三：培养方法
第一种培养方法，使用2216E液体培养基，过程如下所示：
培养前活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液。
S1接种：取已活化的菌液按照1：100体积比接种于500ml 2216E液体培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌的培养瓶，置于恒温摇床中28℃、以180～220rpm速度恒温振荡培养24～48h，可获得高密度的菌悬液。
从时间上较为优化地考虑，当培养基为2216E液体培养基，在步骤S2中，转速为180rpm，恒温培养时间为28h，恒温培养温度为28℃为最佳培养方式。
所述2216E液体培养基配方与实施例一相同。
第二种培养方法，使用LB液体培养基，过程如下所示：
培养前活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到LB液体培养基中，置于恒温摇床中37℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液。
S1接种：取已活化的菌液按照1：100体积比接种于500ml LB液体培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌的培养瓶，置于恒温摇床中37℃、以180～220rpm速度恒温振荡培养24～48h，可获得高密度的菌悬液。
从时间上较为优化地考虑，当培养基为LB液体培养基，在步骤S2中，转速为180rpm，恒温培养时间为24h，恒温培养温度为37℃为最佳培养方式。
所述LB液体培养基的配方按照以下重量份组成：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。制作方法为：准确添加各组分，最后定容，分装至锥形瓶，置于灭菌锅内121℃、101KPa高压蒸汽灭菌20min，待灭菌锅温度降至70℃以下，压力恢复至0KPa时取出，保存备用。
实施例四：PCR扩增16S rRNA序列并测序
S1：取基因组DNA
采用Omega Bacterial DNA Kit(D3350-01)试剂盒提取基因组DNA。首先，取实施例一中所述的种子液2ml于无菌的2ml离心管中，12000rpm离心2min，弃上清保留沉淀；然后，向沉淀中加入100ul 1×TE Buffer，涡旋混匀，加入10ul溶菌酶混匀，37℃温浴10min；加入100ul BTL Buffer和20ul蛋白酶K，混匀，55℃温浴1h，中间振荡混匀三次；加入5ulRNaseA酶，混匀，室温静置5min后，10000rpm离心2min，取200ul上清液转移至新的无菌的1.5ml离心管中；加入200ul BTL Buffer，混匀，置于65℃温浴10min；加入200ul无水乙醇，涡旋混匀，将样品全部转移至吸附柱中，10000rpm离心2min，弃上清和吸附柱，将吸附柱放入新的收集管中；向吸附柱中加入500ul HBC Buffer，10000rpm离心2min，弃上清；向吸附柱上加入700ul DNA Wash Buffer，10000rpm离心2min，弃上清，重复两次；将空的吸附柱重新放入收集管中，10000rpm离心2min；向吸附柱中加入用30ul～50ul Elution Buffer(已于65℃预热)溶解DNA沉淀，即得到基因组DNA，-20℃保存备用。
S2：PCR扩增16SrRNA序列
以步骤S1所得基因组DNA为模板，Eubac27F和Eubac1492R为引物进行PCR扩增，PCR反应体系(50μl)如下：
Figure BDA0001879882160000061
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸1min，变性、复性和延伸的过程反复循环30次；72℃再延伸10min，4℃保存PCR扩增产物。
所述上游引物Eubac27F的序列为：agagtttgat cctggctcag
所述下游引物Eubac1492R的序列为：ggttaccttg ttacgactt
S3：PCR产物进行核酸电泳
取5ul步骤S2所得的PCR产物点样后于120V电压下进行核酸电泳25min。电泳结果如附图4所示，以本发明所述的假单胞菌株的基因组DNA为模板扩增出的16S rRNA片段条带单一且亮度高，且16S rRNA序列长度约为1500bp。
S4：16S rRNA序列进行测序
步骤S2所得的PCR产物经纯化回收后，取30ul纯化产物送广州擎科生物技术有限公司进行序列双向测通测定，测序结果显示本发明所述蜡样芽胞杆菌菌株的16S rRNA序列长度为1460bp，具体序列如下所示：
Figure BDA0001879882160000062
Figure BDA0001879882160000071
实施例五：构建系统进化树
将本发明所述的蜡样芽胞杆菌株的16S rRNA序列输入NCBI中，进行BLAST比对，并基于条形码16S rRNA区段序列构建NJ系统进化树，如附图5所示，根据系统进化树本发明所得的菌株，其16S rRNA序列与蜡样芽胞杆菌Bacillus sp.Z7(EU236738.1)的序列相似度达到99％，并且其与蜡样芽胞杆菌属的16S rRNA条形码数据库中大部分序列高度相似但不存在完全重合，也没有唯一邻近的物种序列，因此可知，本发明所得的菌株在分类上属于蜡样芽胞杆菌属Bacillus cereus，且为一个新种，暂时命名为Bacillus cereus.MS2。
实施例六：治理污水的方法和去磷能力检测
S1菌种活化：取实施例一中-20℃保存的甘油种子液以1：100体积比接种量接种到2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃恒温振荡培养28h，获得已活化的菌液；
S2制备菌悬液：取已活化的菌液按照1：50体积比接种于500ml 2216E液体培养基中，置于恒温摇床中28℃、180rpm恒温振荡培养28h，可获得高密度的菌悬液；
S3制得菌体：将菌悬液以12000r/min转速离心10min去除上清，保留沉淀；然后用无菌水吹打清洗沉淀，并以12000r/min转速离心5min，去上清留沉淀，反复清洗三次，得到用于污水除磷的菌体；
S4投放菌体：将菌体以0.1％质量体积比投入到湖泊污水中以对污染水体进行除磷。
在本实施例中，将菌体投放在污染水体中之后，还进行了厌氧—好氧流程处理，以再次检测本发明的蜡样芽胞杆菌是否具有厌氧释磷、好氧聚磷的特性(即是否为聚磷菌)。厌氧—好氧流程处理的具体流程为：将菌体以0.1％质量体积比投入到内含40L污水样品密闭玻璃容器中，搅拌混匀，向容器中充入氮气6min然后保藏容器密闭状态，打开容器的搅拌功能，使转速保持在30r/min状态处理12h，此为厌氧处理；再将容器打开，改为用400目纱布封口，搅拌速度提高为60r/min处理36h，此为好氧处理；好氧处理后，使污水样品静止放置至168h。在不同的处理时间点(0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、168h)取水样，再将水样以12000r/min的转速离心10min，取上清液，测定此时上清液(即水样)中的总磷(TP)的浓度，并计算其去除率。
其中，所述污水样品采集于广州市华南农业大学校内鄱阳湖，其水质指标为pH＝6.4、TP＝4.71mg/L(远超过水体磷含量标准0.3mg/ml)，同时采集水体底部污泥；将采集到的水样置于玻璃容器，并在玻璃缸底部填充10cm高度的污泥以营造水体环境。
本实施例中，采用钼锑抗分光光度计法测定水体中磷含量TP。
a.样品预处理：取25ml水样置于50ml离心管中，加入1ml过硫酸钾，混匀后密闭，置于高压蒸汽灭菌锅中加热(101KPa，30min)进行消解，待加热完毕，灭菌锅温度降至60℃时取出，室温冷却；
b.显色：取5ml经消解的水样加入50ml比色管中，加去离子水至50ml，此时向比色管总加入1ml 10％抗坏血酸溶液，混匀20s后加入2ml钼酸盐溶液充分混匀，室温放置15min；
c.测量：取3ml已显色的溶液加入至比色管中，测其吸光度(OD700)；
d.钼酸铵标准曲线：取数枝50ml比色管，分别加入磷酸盐标准使用溶液0、0.5ml、1ml、3ml、5ml、10ml、15ml，加水至50ml；向比色管总加入1ml 10％抗坏血酸溶液，混匀20s后加入2ml钼酸盐溶液充分混匀，室温放置15min；取3ml已显色的溶液加入至比色管中，测其吸光度(OD700)；从而得到吸光度与磷酸盐含量关系的钼酸铵标准曲线。
e.根据步骤d所得的钼酸铵标准曲线，以及步骤c测得的吸光度值，按照以下公式计算出水样中的磷含量：
磷酸盐(P，mg/L)＝m/v
式中：m—由标准曲线查得的含磷量，ug；v—水样体积，ml
其中，磷酸盐标准使用液：将磷酸二氢钾于110℃干燥2h然后冷却，称取0.2197g溶于5mL水中，加入5ml盐酸溶液(即水与盐酸的体积比为1:1)，定容至1L，即获得磷酸盐标准溶液；然后取10ml磷酸盐标准溶液用水稀释定容至250ml，即为磷酸盐标准使用液。
测量结果如附图6所示，当进行12h厌氧处理时，污水样品中总磷(TP)浓度继续上升，并于12h时达到6.13mg/L的高浓度，表明此阶段本发明的的蜡样芽胞杆菌处于释磷状态，将体内的磷释放到水体中。当从厌氧处理改为好氧处理后，污水样品中磷浓度呈直线下降，当处理48h时，污水中总磷浓度仅为0.22mg/L，磷去除率高达95％，具有良好的除磷效果，表明过氧处理阶段本发明的蜡样芽胞杆菌处于聚磷状态，将水体中的磷吸收到自身机体中。当好氧处理结束后(即48h后)，水体中的磷浓度依旧维持在很低的水平，表明本发明的蜡样芽胞杆菌的除磷效果具有一定的长期性，拥有很大的污水治理潜力。并且通过厌氧-好氧流程处理，再次表明了本发明的蜡样芽胞杆菌具有厌氧释磷、好氧聚磷的特性，是一种聚磷菌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Figure BDA0001879882160000101
Figure BDA0001879882160000111
序 列 表
<110> 广东中绿园林集团有限公司
<120> 一种蜡样芽胞杆菌及其在改善水体磷污染中的应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 本发明所述的蜡样芽胞杆菌株的16S rRNA序列
<400> 1
tgccatctct gtccacctta ggcggctggc tccaaaaggt taccccaccg acttcgggtg 60
ttacaaactc tcgtggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120
gcatgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcatgt aggcgagttg cagcctacaa 180
tccgaactga gaacggtttt atgagattag ctccacctcg cggtcttgca gctctttgta 240
ccgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300
cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt caccttagag tgcccaactt aatgatggca 360
actaagatca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacaacca tgcaccacct gtcactctgc tcccgaagga gaagccctat ctctagggtt 480
gtcagaggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc 600
caggcggagt gcttaatgcg ttaacttcag cactaaaggg cggaaaccct ctaacactta 660
gcactcatcg tttacggcgt ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt 720
tcgcgcctca gtgtcagtta cagaccagaa agtcgccttc gccactggtg ttcctccata 780
tctctacgca tttcaccgct acacatggaa ttccactttc ctcttctgca ctcaagtctc 840
ccagtttcca atgaccctcc acggttgagc cgtgggcttt cacatcagac ttaagaaacc 900
acctgcgcgc gctttacgcc caataattcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 960
ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttaggt accgtcaagg tgccagctta1020
ttcaactagc acttgttctt ccctaacaac agagttttac gacccgaaag ccttcatcac1080
tcacgcggcg ttgctccgtc agactttcgt ccattgcgga agattcccta ctgctgcctc1140
ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg atcaccctct caggtcggct1200
acgcatcgtt gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcgac gcgggtccat1260
ccataagtga cagccgaagc cgcctttcaa tttcgaacca tgcggttcaa aatgttatcc1320
ggtattagcc ccggtttccc ggagttatcc cagtcttatg ggcaggttac ccacgtgtta1380
ctcacccgtc cgccgctaac ttcataagag caagctctta atccattcgc tcgacttgca1440
tgtatagcac ccgccagccc 1460
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 上游引物Eubac27F
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 下游引物Eubac1492R
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus.MS2)，其特征在于：所述蜡样芽胞杆菌于2018年10月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018679。
2.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1接种：所述蜡样芽胞杆菌株以1.0×105～5.0×106个/ml接种浓度、体积比1:100接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于28℃，以180～220rpm速度振荡，恒温培养24～48小时。
3.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于：所述培养基为2216E液体培养基，所述2216E液体培养基包括以下重量份的原料：蛋白胨5份、酵母浸粉1份、柠檬酸铁0.1份、氯化钠19.45份、氯化镁5.98份、硫酸钠3.24份、氯化钙1.8份、氯化钾0.55份、碳酸钠0.16份、溴化钾0.08份、氯化锶0.034份、硼酸0.022份、硅酸钠0.004份、氟化钠0.0024份、硝酸钠0.0016份、磷酸氢二钠0.008份、无菌水1000份。
4.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1接种：所述蜡样芽胞杆菌株以1.0×105～5.0×106个/ml接种浓度、体积比1:100接种量接种于培养基中；
S2培养：将接种有所述蜡样芽胞杆菌株的培养基，于37℃，以180～220rpm速度振荡，恒温培养24～48小时。
5.如权利要求4所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于：所述培养基为LB液体培养基，所述LB液体培养基包括以下重量份的原料：胰蛋白胨10份、酵母浸粉5份、氯化钠10份、无菌水1000份。
6.如权利要求2或4任意一种所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于：步骤S1中的接种浓度为2.5×106个/ml。
7.如权利要求2或4任意一种所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于：步骤S1中的菌液与培养基体积比接种量为1％。
8.如权利要求2所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于：步骤S2中的培养时长为28小时。
9.如权利要求4所述的蜡样芽胞杆菌株的培养方法，其特征在于：步骤S2中的培养时长为24小时。
10.权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌在改善水体磷污染中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111960549A (zh) * 2020-04-14 2020-11-20 南京清盾环保科技有限公司 一种用于去除污水中磷元素的药剂及其制备方法
CN115553170A (zh) * 2022-09-15 2023-01-03 深圳中绿环境集团有限公司 一种硬质化海堤植被构建方法
CN117603888B (zh) * 2024-01-22 2024-04-09 南京万瑞环境科技有限公司 一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7279104B2 (en) * 2001-10-03 2007-10-09 Waterpure Technologies, Inc. Waste treatment method
GB2421239B (en) * 2004-12-20 2010-06-23 Rhodia Uk Ltd Treatment of sewage sludge
CN101705201B (zh) * 2009-12-07 2011-12-28 北京林业大学 一株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法
CN102827787B (zh) * 2012-05-17 2014-03-12 哈尔滨工业大学宜兴环保研究院 一株反硝化聚磷菌蜡样芽孢杆菌H-hrb01及筛选方法和应用
CN103789240A (zh) * 2014-01-25 2014-05-14 西北农林科技大学 一种提高蜡样芽孢杆菌解磷能力的发酵培养基及发酵方法
CN104059864B (zh) * 2014-05-26 2016-08-24 绍兴柯桥江滨水处理有限公司 一株蜡样芽胞杆菌及其制备方法、应用
CN104630092B (zh) * 2014-12-13 2018-05-22 河南农业大学 一种烟草根际促生菌yc9及其应用
CN105925507B (zh) * 2016-06-02 2019-05-07 华南农业大学 具有重金属钝化和促进植物生长功能的蜡样芽孢杆菌及应用
CN106591277A (zh) * 2016-12-07 2017-04-26 华南农业大学 一种具有解磷、钝化重金属功能的固定化芽孢杆菌及其制备与应用

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