CN101591623A - 一种蜡状芽孢杆菌菌株及用它制备的拟除虫菊酯类农药的降解酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜡状芽孢杆菌菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M209001。还公开了一种由所述的蜡状芽孢杆菌菌株为出发菌株制备的拟除虫菊酯类农药降解酶及其制备方法。该菌株是一株从茶树体内分离到的对拟除虫菊酯类农药降解效能高的蜡状芽孢杆菌，其胞内粗酶液对拟除虫菊酯类农药如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和甲氰菊酯的降解效能高，对有机磷农药如乐果、敌敌畏、甲胺磷和毒死蜱等降解效能低。

Description

一种蜡状芽孢杆菌菌株及用它制备的拟除虫菊酯类农药的降解酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种蜡状芽孢杆菌菌株，尤其是一种茶树内生、可高效降解拟除虫菊酯类农药的蜡状芽孢杆菌菌株，还涉及用它制备的拟除虫菊酯类农药的降解酶及其制备方法。属于微生物技术领域。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高和健康意识的增强，绿色食品越来越受到人们的青睐。茶叶是一种天然保健饮品，并被称誉为21世纪的健康饮料，当今全球有近半数人饮茶。然而由于病虫害的直接或间接危害，对提高茶叶经济效益造成了一定的负面影响。茶叶是以嫩梢为主要收获物的经济作物，传统的化学防治方法给茶叶产品带来农残超标、生态系统恶化等严重问题。我国每年由于农药残留超标被退回或销毁的茶叶就有上万吨，损失巨大。

目前，化学农药仍是作物病虫害防治的主体，但它造成了农药残留、环境污染、有害生物抗药性产生、非靶标生物受害，乃至生态平衡受破坏等重大问题。即使是拟除虫菊酯类农药低毒、杀虫谱广，也存在着降解速度慢等问题，对生态环境同样会产生一定的影响。联合国粮农组织和世界卫生组织已对它们在农产品中的残留限量作出了严格的规定。微生物降解农药的研究一直是国内外的研究热点，至今已取得了很大进展，表现在降解农药的微生物种类不断被发现，降解机理日趋深入，降解效果稳定提高等方面。拟除虫菊酯类降解菌主要有假单胞菌(Pseudom onas spp.)、芽孢杆菌(Bacillusspp.)和产碱菌属(A lcaligenes spp.)等。人们研究发现，生长在不同污染环境中的植物能选择性地增加含有污染物降解基因的内生细菌。

微生物对农药的降解研究始于40年代末，一直是国内外的研究热点，至今已取得了很大进展。微生物对农药的作用方式多样，多数属于通过酶促反应降解农药。农药的酶促反应主要是由微生物的胞内酶引起的：将农药吸附于微生物细胞表面；农药穿透细胞膜进入膜内；农药在细胞膜内通过与降解酶结合发生酶促反应。农药降解酶在农药残留降解的应用中，具有降解效率高、作用底物浓度低、降解谱广、安全无毒、环境适应强等优点，具有良好的应用前景。目前生物农药的研发远不能满足无公害茶园防治病虫害的需要，而国内外对直接应用内生细菌防治茶树病害的研究很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种枯草芽孢杆菌菌株，其为茶树内生农药降解菌，以便高效能的降解拟除虫菊酯类农药。所要解决的技术问题之二是，提供一种从菌株中制备出拟除虫菊酯类农药降解酶的方法，并且制备出降解酶。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是，一株蜡状芽孢杆菌TR2(Bacillus cereus TR2)菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M209001。

上述的蜡状芽孢杆菌TR2(Bacillus cereus TR2)菌株，其为从茶树体内分离得到，其菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，周生鞭毛，椭圆形芽孢，兼性厌氧，在平板上长成的菌落初为乳白色、圆形、边缘整齐、略凸起、表面湿润、半透明、略粘稠，后期为灰白色、近圆形、边缘波浪状、凸起呈乳头状或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。其能在茶树体内内生、对茶轮斑病防病效果好以及对拟除虫菊酯类农药降解效能高。

本发明采取的技术方案之二是，一种从上述菌株中制备拟除虫菊酯类农药降解酶的方法，包括下列内容：

1、将TR2菌株的新鲜培养物接种于添加50mg/L氯氰菊酯的基础培养基中，37℃、180r/min下培养72h。

2、将培养液7500r/min离心10min，分别得上清液和菌体。

3、将菌体用0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，按3ml缓冲液+1g菌体的比例配成菌悬液。

4、将菌悬液置于冰浴中超声波破碎处理7次，每次50s。

5、然后，10000r/min离心10min，取上清液，得胞内粗酶液，即为拟除虫菊酯类农药降解酶。

上述的方法中，其破碎菌体所用机械为JY92-II型超声波细胞粉碎机(200W)。

一种拟除虫菊酯类农药降解酶，以蜡状芽孢杆菌TR2菌株(CCTCC NO：M209001)为出发菌株，应用上述的制备方法制得。

上述拟除虫菊酯类农药降解酶，其降解拟除虫菊酯类农药适宜的pH为5.5-9.0；适宜的温度为30-45℃；其米氏常数(K_m)为692.39nmol/mL，最大反应速率(V_max)为89.29nmol/min。该降解酶在pH6.0-9.0之间较稳定，在pH7.5最稳定，在pH4.0-5.0和pH10.0以上则易于变性失活，在40℃以下稳定性好，高于50℃易于变性失活。3-苯甲基苯甲醛是菌株TR2降解氯氰菊酯的主要中间代谢产物。

上述的拟除虫菊酯类农药降解酶，其对氯氰菊酯反应的pH值优选8.0；温度优选35℃。

菌株TR2(CCTCC NO：M209001)是一株从茶树体内分离到的对拟除虫菊酯类农药降解效能高的细菌菌株，经鉴定为蜡状芽孢杆菌(BacillusCereus)。其胞外粗酶液对拟除虫菊酯类农药无降解活性，其胞内粗酶液对拟除虫菊酯类农药如氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和甲氰菊酯的降解效能高，对有机磷农药如乐果、敌敌畏、甲胺磷和毒死蜱等降解效能低。

经室内盆栽试验测定，菌株TR2对氯氰菊酯的最优化降解条件为喷菌后1d喷药、处理时间10d、喷菌量为5mL/株(菌液浓度为10⁸cfu/mL)以及喷药量为1mg/kg。茶园小区试验测定结果表明，菌株TR2对氯氰菊酯的降解率达83.4％，能将氯氰菊酯残留量控制在0.15mg/kg以下。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明进一步详细说明。

图1是酪蛋白标准曲线图；

图2是菌株TR2粗酶液的SDS-PAGE图谱；

图3是底物对粗酶液酶活力的影响；

图4是pH值对粗酶液酶活力的影响；

图5是粗酶液的pH稳定性；

图6是温度对粗酶液酶活力的影响；

图7是粗酶液的温度稳定性；

图8是粗酶液与氯氰菊酯的L ineweaver-Burk图。

具体实施方式

实施例1

分离筛选TR2菌株

采用植物表面消毒法对不同茶树品种的健叶和病叶进行表面处理后，以不同培养基进行内生细菌的分离。细菌分离培养基为NA、KB和TSA。细菌增殖培养基为NA或NB。真菌培养与拮抗测定用培养基为改良PDA。测定农药降解采用以氯氰菊酯为唯一碳源的基础培养基。根据菌落形态、颜色等随机挑取单菌落，按常规方法纯化后保存，供测试鉴定。测定所有分离菌株对茶叶斑病菌的拮抗性以及在氯氰菊酯平板上的生长能力。

内生细菌的鉴定

参照东秀珠等(东秀珠，蔡妙英：常见细菌鉴定手册[M]，科学出版社，2001：43~66页)的方法，对目标菌株进行常规鉴定及生理生化测定如革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色、接触酶、葡萄糖产酸产气等，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为标准菌株。

细菌分离培养试验结果见表1。茶树体内存在大量的内生细菌，分离到的内生细菌数量为2.9×10⁶~39.4×10⁶cfu/(g·fw)，不同培养基间差异并不显著，不同品种间有一定的差异，同一品种间病叶与健叶的内生细菌数量差异显著。

表1不同品种茶叶分离的内生细菌数量

                                    (×10⁶cfu/g.fw)

经测定(结果见表2)，上述的分离菌株中有14株对四种茶树叶斑病菌

表2目标菌株对四种茶树叶斑病菌的抑制率

                                            (％)

都有不同程度的拮抗效果，且在氯氰菊酯平板上生长良好，将它们作为目标菌株，编号为TR1至TR14；其中，TR2和TR3对四种茶树叶斑病菌菌丝具有较强的抑制率。

进一步鉴定显示，TR2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其生理生化特征见表3。

表3TR2的生理生化特征

注：“+”代表阳性反应  “-”代表阴性反应。

Note：Symbol‘+’means positive reaction，and symbol‘-’means negative reaction

内生性测定：采用抗利福平和拮抗茶轮斑病菌的双抗法，测定目标菌株对茶树苗的内生定殖能力。定殖试验结果表明，14个目标菌株都能在接种后不同时间取的茶叶样品中分离到与原始菌株相同菌落形态的细菌菌株，而对照样品中未分离到细菌。其中TR1、TR2和TR7在接种茶树苗30d后仍能分离到相当数量的目标细菌，证明它们有较强的内生定殖能力。几项关健性生理生化测定结果表明，这些分离菌株均为枯草芽孢杆菌。拮抗试验表明，14个目标菌株对茶轮斑病菌菌丝、分生孢子的形成和萌发都有一定程度的抑制作用，结果见表4。

表4目标菌株对茶轮斑病菌的影响

注：综合指数是以各项的最大值作为100，其它值按与最大值的比率计算其相应值；然后计算各项的平均值，下同。

Note：The composite index number is an average value of each numerica1 value，which is a ratio of origin value to the maximum value

其中TR2和TR3对病菌菌丝有明显的抑制作用，对峙培养7d后，出现直径为41.5mm和32.0mm的抑菌圈。靠近TR2生长边缘处的病菌菌丝不能向外扩展生长，而且变黑而形成一条黑色抑菌带，其宽达13.5mm。镜检发现受抑制的菌丝绝大部分变畸形，顶端和中间形成大量圆球形囊状体，有的菌丝细胞囊状体的壁已消融、破裂。同时，TR2、TR3和TR7对茶轮斑病菌分生孢子形成的抑制率较高，分别可达89.5％、94.3％和90.0％。另外，TR2培养液处理24h后，茶轮斑病菌分生孢子的萌发率仅有3.5％，而清水处理中分生孢子萌发率达95.0％，其萌发抑制率为86.9％；48h后清水中萌发的分生孢子均能形成附着胞，而培养液中萌发的孢子未见附着胞形成。拮抗性测定结果表明，与TR2的野生菌株相比，分离菌株对茶轮斑病菌仍具有很强的拮抗性。经测定，上述分离菌株在氯氰菊酯平板上生长良好。

对病原真菌生长的影响

采用对峙生长法，测定目标菌株对茶轮斑病菌菌丝、分生孢子形成的抑制作用。采用载玻片悬滴法室温培养，测定目标菌株对茶轮斑病菌分生孢子萌发的抑制作用。目标菌株防病试验结果表明，14个目标菌株除TR10外对茶轮斑病都有不同程度的防治效果，如表5。其中TR2和TR3对茶轮斑病的防病效果最好，先接种目标菌株24h后再接种茶轮斑病菌其防病效果分别可达到90.3％和80.2％，这与前面的拮抗测定结果基本吻合。

表5目标菌株对茶轮斑病的防病效果

                                            (％)

注：处理I为同时接种目标菌株和茶轮斑病菌；处理II为先接种目标菌株24h后接种茶轮斑病菌；处理III为先接种茶轮斑病菌24h后接种目标菌株

Note：Treatment I is a treatment thar inoculating the screened bacteria strains and Pestallozzia theae simultaneity.Treatment II is atreatment that inoculating Pestallozzia theae pathogen 24 hours after inoculating the screeued bacteria strains.Treatment III is atreatment that inoculating the screened bacteria strains 24 hours after inoculating Pestallozzia theae pathogen

防病测定

室内盆栽采用灌根法和喷雾法测定目标菌株对茶轮斑病的防病效果。设同时接种目标菌株和茶轮斑病菌、先接种目标菌株24h后接种茶轮斑病菌和先接种茶轮斑病菌24h后接种目标菌株等3个处理。

表6目标菌株对氯氰菊酯的降解率

                                        (％)

农药降解效能测定：采用外标法制作氯氰菊酯的标准曲线。以100mg/L氯氰菊酯为唯一碳源的基础培养液中接种目标菌株后，30℃，150r/min振荡培养，设不接菌的处理为对照，分别于6、12、24、48、72h和120h取样。石油醚液相萃取法处理样品，HP6890气相色谱仪(色谱柱型号为HP-5)检测，采用常规测试条件，计算降解率。

氯氰菊酯降解试验结果表明，14个目标菌株对氯氰菊酯都有不同程度的降解作用，见表6。其中TR10、TR7和TR2对氯氰菊酯的降解效能较高。从时间上来看，6~48h内目标菌株对氯氰菊酯的降解率呈直线增长，而48h后降解率就没有太大变化。

本实施例中，通过对茶树内生细菌的分离与筛选，获得一株能在茶树体内内生、对茶轮斑病防病效果好以及对氯氰菊酯降解效能高的枯草芽孢杆菌TR2，其菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，周生鞭毛，椭圆形芽孢，兼性厌氧，在平板上长成的菌落初为乳白色、圆形、边缘整齐、略凸起、表面湿润、半透明、略粘稠，后期为灰白色、近圆形、边缘波浪状、凸起呈乳头状或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。

实施例2

从蜡状芽孢杆菌TR2菌株(CCTCC NO：M209001)中制备拟除虫菊酯类农药降解酶

本实施例中涉及的培养基：降解菌的保存采用添加氯氰菊酯(50mg/L)的NA培养基。降解菌的降解效能测定采用添加氯氰菊酯(50mg/L)的基础培养基。

本实施例中涉及的供试农药：10％氯氰菊酯乳油(南京红太阳集团有限公司)、2.5％氟氯氰菊酯乳油(苏州富美实植物保护剂有限公司)、20％甲氰菊酯乳油(浙江威尔达化工有限公司)、40％乐果乳油(重庆民丰农化股份有限公司)、80％敌敌畏乳油(江苏梅兰集团有限公司)、70％甲胺磷原油和40％毒死蜱乳油(山东华阳科技股份有限公司)、氯氰菊酯标样(北京康林科技有限公司)。

粗酶液的制备

将菌株TR2的新鲜培养物接种于添加氯氰菊酯(50mg/L)的基础培养基中，37℃、180r/min下培养72h。培养液7500r/min离心10min，分别得上清液和菌体。

取上清液，边搅拌边加硫酸铵至饱和度为100％，4℃盐析过夜。离心收集蛋白沉淀，用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)溶解后用同一种缓冲液透析(MWCO＝5000)至无硫酸根离子，得胞外粗酶液。

将菌体用0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤2次，按3ml缓冲液+1g菌体的比例配成菌悬液。将菌悬液置于冰浴中用JY92-II型超声波细胞粉碎机(200W)超声波破碎处理7次，每次50s。然后，10,000r/min离心10min，取上清液，得胞内粗酶液，即为拟除虫菊酯类农药降解酶。

粗酶液的可溶性蛋白含量测定

用Folin-酚法(中国科学院上海植物生理研究所编.现代植物生理学实验指南[M].第1版，北京：科学出版社，1999，35-38页)测定粗酶液的可溶性蛋白质含量。制作如图1所示标准酪蛋白曲线，根据测定结果与标准曲线分别计算出胞外粗酶液和胞内粗酶液的可溶性蛋白含量。根据图1所示酪蛋白标准曲线，可以看出酪蛋白的标准含量在650nm下的吸光值近似呈一线性直线关系。测定结果显示，菌株TR2提取出来的胞外粗酶液和胞内粗酶液在650nm下的吸光值分别为1.35和1.21，相对应于图1的标准曲线，可以计算出菌株TR2胞外粗酶液和胞内粗酶液的可溶性蛋白质含量分别为0.540mg/ml和0.502mg/ml。

粗酶液的SDS-PAGE电泳

分别灌制12％的分离胶和5％的浓缩胶，配方参照《蛋白质技术手册》(汪家政、范明：蛋白质技术手册[M].北京：科学出版社，2001，77-108页)。粗酶液与2xLSB按1∶1比例在Ep2pendorf管内混匀，100℃加热3～5min，冷切后8,000rpm离心10min，上样，最外侧加样孔内上蛋白质分子标准品(Marker)。电泳，8～10V/cm胶，当溴酚蓝距凝胶底部约1～5mm处停止电泳，下胶。考马斯亮蓝R-250染色、脱色，拍照。

如图2所示，胞外粗酶液和胞内粗酶液的SDS-PAGE图谱显示：胞内粗酶液的蛋白条带数目多于胞外粗酶液的，其在25KDa和40KDa左右有两条明显的粗条带。

影响粗酶液酶活力的因素测定

酶的底物特异性测定

反应体系：2.7ml已预热的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH7.0，含50mg/L氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、乐果、甲胺磷、毒死蜱和敌敌畏)中，加入0.3ml预热的粗酶液，总体积为3ml。35℃反应20min后，加入0.2ml 1.0mol/L HCl终止酶反应。每处理重复3次，以不加粗酶液的作为对照。石油醚三步萃取法处理样品，并定容至10ml。气相色谱法检测样品的底物含量，根据结果计算粗酶液对不同底物的降解率。

取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力(％)，以确定粗酶液对不同底物的降解差异。菌株TR2胞内粗酶液对不同底物的降解率测定结果如图3所示。在所有测定的底物中酶对氯氰菊酯的降解效能最高(在pH7.0和35℃的反应条件下反应20min的降解率为71.5％)，其次是甲氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲胺磷和毒死蜱，对乐果和敌敌畏最低。

不同pH值对酶活力的影响

分别用pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的磷酸缓冲液(含50mg/L氯氰菊酯)与粗酶液配成不同的反应体系。35℃反应20min后，加入0.2ml的1.0mol/L HCl终止酶反应。每处理重复3次，分别设不加粗酶液的作为对照。样品的提取和检测同上，根据结果计算不同反应pH值下粗酶液对氯氰菊酯的降解率。取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力(％)，以确定粗酶液的最适反应pH。

菌株TR2胞内粗酶液在不同反应pH值下对氯氰菊酯的降解率测定结果如图4所示。粗酶液在pH4.0～10.0之间对氯氰菊酯都有不同程度的降解，其反应适宜的pH应在5.5～9.0，最适pH为8.0(35℃下反应20min的降解率为80.3％)。

酶的pH稳定性测定

将粗酶液于pH4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的磷酸缓冲液中35℃保温1h，各对应的pH梯度分别设不加粗酶液的作为对照。然后再和氯氰菊酯(终浓度为50mg/L)在35℃、最适pH值下反应20min后，加入0.2ml 1.0mol/L HCl终止酶反应。样品的提取和检测同上，根据结果计算粗酶液对氯氰菊酯的降解率。取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力(％)，以确定粗酶液在不同pH条件下的稳定性。

菌株TR2胞内粗酶液对不同pH的稳定性测定结果见图5。粗酶液在pH4.0～10.0的磷酸缓冲液中保温1h后对氯氰菊酯的降解都有不同程度的变化，其在pH6.0～9.0之间较为稳定，在pH7.5下最稳定(35℃、pH8.0下反应20min的降解率为82.3％)，而在pH4.0～5.0和pH10.0易于变性失活。

不同温度对酶活力的影响

用0.02mol/L磷酸缓冲液(最适pH值，含50mg/L氯氰菊酯)与粗酶液配成反应体系。反应体系分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等不同温度下反应20min后，加入0.2ml 1.0mol/L HCl终止酶反应。每处理重复3次，分别设不加酶液的作为对照。样品的提取和检测同上，根据结果计算不同反应温度下粗酶液对氯氰菊酯的降解率。取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力(％)，以确定粗酶液的最适反应温度。菌株TR 2胞内粗酶液在不同反应温度下对氯氰菊酯的降解率测定结果如图6。粗酶液在15～50℃之间对氯氰菊酯都有不同程度的降解，其反应适宜的温度应在30～45℃之间，最适温度为35℃(pH8.0下反应20min的降解率为85.9％)。

酶的热稳定性测定

将粗酶液于最适pH值的缓冲液中，在20、30、40、50、60、70℃下保温1h，各对应的温度梯度分别设不加粗酶液的作为对照。然后再和氯氰菊酯(终浓度为50mg/L)在最适反应条件下反应20min后，加入0.2ml 1.0mol/LHCl终止酶反应。样品的提取和检测同上。取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力(％)，根据结果计算粗酶液对氯氰菊酯的降解率，以确定粗酶液在不同温度条件下的稳定性。

菌株TR2胞内粗酶液对不同温度的稳定性测定结果见图7。粗酶液在40℃以下稳定性良好(35℃、pH8.0下反应20min的降解率为84.6％)，在50℃、60℃和70℃下保温1h后对氯氰菊酯的降解随着温度的升高而迅速下降。

粗酶液米氏常数Km和最大反应速率Vmax的测定

分别用含有不同氰氰菊酯浓度(10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L)的磷酸缓冲液(0.02mol/L，最适pH值)与粗酶液配成不同的反应体系。在最适温度下反应20min，最后用0.2ml的1.0mol/L的盐酸终止反应。每处理重复3次，分别设不加酶液的作为对照。样品的提取和检测同上，根据结果计算粗酶液对不同氯氰菊酯浓度的降解率。根据氯氰菊酯的初始浓度和测得的反应速率作Lineweaver-Burk图，求得粗酶液降解氯氰菊酯的米氏常数Km和最大反应速率Vmax。

根据菌株TR2胞内粗酶液对不同氯氰菊酯浓度的降解率测定结果，然后以氯氰菊酯的初始浓度和测得的反应速率作Lineweaver-Burk图，见图8。结果表明，粗酶液的反应速率倒数(y)与氯氰菊酯浓度倒数(x)的线性方程为y＝7.7548x+0.0112，决定系数r＝0.9970；因此，粗酶液对氯氰菊酯的米氏常数为Km＝692.39nmol/ml，最大反应速率Vmax＝89.29nmol/min。

Claims (7)

1、一种蜡状芽孢杆菌菌株，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M209001。

2、根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌菌株，其为从茶树体内分离得到，其菌体呈杆状，革兰氏染色阳性，周生鞭毛，椭圆形芽孢，兼性厌氧，在平板上长成的菌落初为乳白色、圆形、边缘整齐、略凸起、表面湿润、半透明、略粘稠，后期为灰白色、近圆形、边缘波浪状、凸起呈乳头状或中央凹陷、表面干燥、不透明、粘稠。

3、一种由权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌菌株中制备拟除虫菊酯类农药降解酶的方法，包括下列内容：

a、将TR2菌株的新鲜培养物接种于添加50mg/L氯氰菊酯的基础培养基中，37℃、180r/min下培养72h；

b、将培养液7500r/min离心10min，分别得上清液和菌体；

c、将菌体用0.02mol/L、pH7.0磷酸缓冲液洗涤2次，按3ml缓冲液+1g菌体的比例配成菌悬液；

d、将菌悬液置于冰浴中超声波破碎处理7次，每次50s；

e、然后，10000r/min离心10min，取上清液，得胞内粗酶液，即为拟除虫菊酯类农药降解酶。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在其步骤d中，破碎菌体所用机械为JY92-II型200W超声波细胞粉碎机。

5、一种拟除虫菊酯类农药降解酶，以蜡状芽孢杆菌菌株CCTCC NO：M209001为出发菌株，应用权利要求3所述的制备方法制得。

6、根据权利要求5所述的拟除虫菊酯类农药降解酶，其特征在于：其降解拟除虫菊酯类农药适宜的pH为5.5-9.0；适宜的温度为30-45℃；其米氏常数K_m为692.39nmol/mL，最大反应速率V_max为89.29nmol/min。

7、根据权利要求6所述的拟除虫菊酯类农药降解酶，其特征在于：其降解拟除虫菊酯类农药的pH值为8.0；温度为35℃。

Images