CN104031864B - 枯草芽孢杆菌多功能菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可降解木质素、纤维素和广谱性染料，并可高效降解毒死蜱的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）MZS1 CCTCC NO：M2014042。本发明的菌株在5%的毒死蜱浓度下依然生长良好。菌株对土壤和水体中的毒死蜱具有良好的降解能力，并且能与土著菌形成稳定的群落关系，协同进行毒死蜱的降解。

Description

枯草芽孢杆菌多功能菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种多功能菌株及其应用，具体涉及一株可降解木质素、纤维素和广谱性染料，并可高效降解毒死蜱的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MZS1CCTCC NO：M2014042，以及该菌株的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

光合作用产生的生物量有50％-60％以木质纤维素形式储存在植物的组织中。当植物体死亡或者组织凋落后，纤维素和木质素等难分解组分往往成为限制植物残体降解的重要因素，极大地影响了生态系统物质循环过程。微生物分解是木质纤维素最主要的分解方式，因此筛选高效的木质纤维素降解微生物也就非常重要。

具有木质纤维素分解能力的微生物在自然界广泛分布，已经有大量的纤维素降解微生物被从各种环境系统中分离出来并进行了研究。大多都是丝状真菌，尤以木霉、曲霉、青霉最多，全球约90％以上纤维素酶是通过木霉产生的，其中瑞氏木霉的纤维素酶能有效地将纤维素转化为葡萄糖，被普遍认为是最具有工业应用价值的纤维素酶生产菌。随后也不断有细菌、放线菌甚至古菌资源被陆续发掘。近年来对木质纤维素降解酶类及基因资源的研究也有不少报道。

当前可被利用的生物质资源很多，例如稻草、玉米芯、玉米秸秆、小麦秸秆等农业废弃物；树叶、病树等林业废弃物；木薯渣、甘蔗渣、废纸、生活垃圾等一些工业和生活废物，这些原料都可以用来进行生物能源的生产。我国秸秆每年有7亿吨，可资源化利用量上亿吨，这些废弃物是农业和工业生产中诸多材料廉价、丰富的资源来源。充分发掘木质纤维素降解的微生物资源，在生态产业化的实现中也具有较强的经济、社会和现实意义。

此外，作为替代高毒有机磷类农药的主要品种，毒性中等的毒死蜱在世界范围内的应用日益广泛。随着毒死蜱的生产使用大幅增加，其在我国无公害农产品的生产中得以广泛应用，并且用以替代已禁用的甲胺磷、对硫磷等高效但高毒的有机磷农药。据估计,未来几年全球毒死蜱的年均需求增长率约为10％，到2015年全球需求量将达到25.8万吨左右。在全球范围内，毒死蜱被广泛应用于包括水稻、麦类、玉米、棉花、甘蔗、茶叶、果树和花卉等众多大田作物和经济作物。

农业生产中使用中，除了发挥其防治害虫的作用外，大部分毒死蜱最终进入土壤环境。由于毒死蜱在土壤中降解慢，残留期长，因此易对土壤生态系统造成潜在危害。并且，由于它的生物富集作用，会对周围的环境、生物以及人类产生危害作用。近年来的研究表明，毒死蜱对人的神经系统和脑发育具有一定的毒害作用，尤其是对儿童具有潜在的健康危害。毒死蜱导致的环境污染问题日益突出，不容忽视。随着其用量的不断增加，全球已在大范围的水生生态系统和陆生生态系统检测到了毒死蜱的残留，一些发达国家也开始禁用毒死蜱。以生物修复作为理论基础的农药残留微生物降解技术是目前降低农产品和农业生产环境中农药残留的重要方法，具有高效、环保的特点，也是人们开始关注的焦点。因此，筛选安全、经济、有效的微生物来治理和修复毒死蜱造成的环境污染更是具有重要的经济、社会价值和现实意义。

现有技术中，中国专利申请CN 201110443310.7(一株克雷伯氏菌株及其处理土壤和果蔬表面毒死蜱农药残留的方法，唐敦义等)提供了一株能降解毒死蜱农药残留的微生物新菌种——克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)dsp-B，Genbank登录号为HQ836365，以及利用该降解菌株研制的毒死蜱农药残留降解菌剂。生产工艺为斜面种→摇瓶种子液→种子罐→发酵罐→产品，其制备工艺简单、生产成本低廉，且易于大面积推广应用，施用时直接喷洒非常方便，解决了农业生产中农药喷洒该菌剂产品后可快速、高效地降解水体、土壤及果蔬表面的残留毒死蜱含量，从而残留超标问题，可生产出无毒无公害的绿色农产品，有效提高农产品的品质和经济价值。该发明报道了在实验室条件下，毒死蜱浓度100mg/L，降解率约85％，但无更高浓度毒死蜱降解处理报道；土壤实验中，毒死蜱浓度100mg/L，降解率约76％；未进行水体毒死蜱污染处理实验，也无更高浓度毒死蜱处理报道。

此外，红假单胞菌PSB07-26对白菜和土壤中毒死蜱的生物降解(李兴华等，安全与环境学报，2014，14(1)：219-221)一文应用光合细菌红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.)PSB07-26对大白菜和土壤中毒死蜱残留的生物修复进行了研究。室内模拟试验结果表明，培养28d，PSB07-26对土壤中添加5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg毒死蜱的降解率分别为25.44％、44.57％和44.08％。田间试验结果表明：随着PSB07-26含量的增加，其对大白菜和土壤中毒死蜱的降解率升高；施用PSB07-26菌剂6750mL/hm²，3d后对大白菜中毒死蜱的降解率为20.97％，9d后对菜田土壤中毒死蜱的降解率为39.14％。15mg/kg毒死蜱的降解率仅44.08％，降解率低，大田应用中的毒死蜱的降解率仅为39.14％。

可以看出，采用安全、经济、有效的微生物治理和修复毒死蜱造成的环境污染是切实可行且生态环保的方法，而目前这类资源微生物数量的报道有限，对更高浓度(>2g/L)的毒死蜱耐受或降解情况也鲜有报道，甚至于相关的多功能微生物资源的研究报道几乎没有。

发明内容

本发明提供了一种可降解木质素、纤维素、染料，并能高效降毒死蜱的多功能降解菌株。

本发明所述的降解菌株，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MZS1，该菌株保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC NO：M2014042，保藏日期：2014年2月23日，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。

该菌株的个体(菌体)和群体(菌落)特征为：革兰氏染色反应为阳性；菌体呈杆状，两端钝圆，长约1.5-2.25μm，宽约0.5-0.75μm；具有芽孢形态，芽孢椭圆形、中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，周生鞭毛；生长在葡萄糖营养琼脂上的幼龄细胞用吕氏美蓝染液淡染色，原生质内无不着色颗粒；相差显微镜上观察到菌体翻转运动。与参考文献(周德庆.微生物学实验手册.上海:上海科技出版社，1981；布坎南R E，吉本斯N E，等编，李季伦等译.Bergey氏细菌鉴定手册.北京:科学出版社，1984)报道的枯草杆菌菌株的个体和群体特征基本一致。经过序列测定，该菌的16S rRNA序列与Bacillus subtilis的相似性为99％。菌株的16S rRNA序列的GeneBank登录号KJ882376，序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了该菌株用于木质素和纤维素的降解、广谱性染料脱色以及毒死蜱的降解。

本发明通过对菌株的多功能检测，除了对木质素和纤维素的降解、广谱性染料脱色功能进行了检测外，还对该菌株的毒死蜱降解功能进行了检测，发现该菌株在实验室条件下对毒死蜱的耐受浓度提高到5％(50g/L)，菌株在5％的毒死蜱浓度下依然生长良好。菌株对土壤和水体中的毒死蜱具有良好的降解能力，并且能与土著菌形成稳定的群落关系，协同进行毒死蜱的降解。

附图说明

图1是菌株MZS1芽孢形态特征。

图2是菌株MZS1菌体及鞭毛形态特征。

图3是染料对照(1)和脱色后代谢产物(2)的紫外-可见光光度计图谱。

图4是毒死蜱浓度与吸光度的关系。

图5是菌株MZS1在不同浓度毒死蜱下的生长曲线。

图6是菌株MZS1在不同浓度毒死蜱下的降解率曲线。

图7是不同毒死蜱浓度下菌株MZS1降解毒死蜱的绝对去除量。

图8是菌株MZS1对不同浓度毒死蜱的降解率。

图9是菌株对不同处理水和土壤中毒死蜱的降解残留量。

图10是菌株对不同处理水和土壤中毒死蜱的降解率。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1菌株的分离纯化

从岷江冷杉原始林下获得土壤冻融末期的凋落物样品，带回实验室部分置-4℃保存，剩余的制备成凋落物粉(冻干，剪碎后过40-60目筛)置灭菌的聚丙烯袋-20℃保存。

在无机盐培养基(无机盐培养基：K₂HPO₄1g/L；NaH₂PO₄1g/L；(NH4)₂SO₄0.5g/L；MgSO₄0.2g/L；CaCl₂0.1g/L；FeSO₄0.05g/L；MnSO₄0.02g/L；dH₂O1000mL；pH7.2；121℃灭菌20min)中，每100mL培养基加入0.5g-4℃保存备用的凋落物样品，37℃，180r/m摇床培养3d，取富集液按5％的接种量接种到相同新鲜培养基，相同条件下培养3d，3次转接后，取0.1mL培养液涂布在含有0.1g/L苯胺蓝的BM(基本培养基BM：酵母膏0.1g/L；葡萄糖2g/L；dH2O1000mL；自然pH；115℃灭菌30min)平板上，37℃避光培养，观察有无褪色圈的产生及褪色圈的大小，检测产木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的菌株。挑取褪色圈大的菌株点种到刚果红培养基中，37℃避光培养，检测菌株褪色圈的产生，最终筛选到一株具有高活性胞外过氧化物酶产生能力的木质素和纤维素降解菌株MZS1，苯胺蓝平板培养48h后产生明显褪色圈，随着时间的延长，褪色圈不断扩大，最终整个平板蓝色全褪去；刚果红平板培养24h后即产生透明圈。

实施例2菌株的鉴定

(1)个体特征

上述菌株MZS1革兰氏染色反应为阳性；菌体呈杆状，两端钝圆，长约1.5-2.25μm，宽约0.5-0.75μm；具有芽孢形态，芽孢椭圆形、中生或近中生，芽孢囊不明显膨大(见图1)，鞭毛周生(见图2)；生长在葡萄糖营养琼脂上的幼龄细胞用吕氏美蓝染液淡染色，原生质内无不着色颗粒；相差显微镜上观察到菌体翻转运动。

(2)群体特征

在牛肉膏蛋白胨固体培养基上生长的菌株MZS1的菌落呈不规则干燥、灰白色、不透明、稍突起、有皱折、边缘不整齐隆起，菌落与培养基紧贴，不易挑取，挑入水中时保持膜状。在牛肉膏蛋白胨液体培养基中旺盛生长，液体浑浊，无沉淀，静止培养则在液体表面形成较光滑的一层薄膜，表面有颗粒，振荡时菌膜成团沉底。

(3)生理生化特征

对菌株MZS1进行了一系列生理生化检测，见表1。

表1菌株MZS1的生理生化特征

注：+表示阳性或可以利用，-表示阴性或不能利用

(4)分子鉴定

采用细菌16S rRNA基因通用引物扩增菌株MZS1的16S rRNA序列，PCR扩增获得1550bp的16S rRNA序列，将序列提交GeneBank，登录号KJ882376。在NCBI上在线BLAST比对，进行序列相似性比较分析，分析结果显示与所得序列同源性较高的前10株菌均为Bacillussubtilis，相似性均为99％。因此，根据16S rRNA序列相似性分析，结合形态观察及生理生化试验，鉴定菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MZS1。菌株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014042，保藏日期为：2014年2月23日。

实施例3木质素和纤维素的降解

接种枯草芽孢杆菌MZS1至LB液体培养基中,37℃、150r/min振荡培养16h。按5％(V/V)的接种量，接种菌液到发酵培养基(发酵培养基：每L含有10g凋落物粉的BM培养基)，37℃、200r/m发酵培养15d后，将发酵液4000rpm、室温离心30min，65℃烘干，测定木质素和纤维素的含量，木质素和纤维素的降解率分别为67.82％和41.51％，选择性系数为1.63，结果见表2。

降解率＝木质素(或纤维素)的降解总量/原样品中木质素(或纤维素)的总量×100％

选择性系数＝木质素降解率/纤维素降解率

表2菌株MZS1对凋落物中木质素和纤维素的降解率(means±SD n＝6)

实施例4广谱性染料脱色

接种枯草芽孢杆菌MZS1至LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养16h-18h。按5％(V/V)的接种量，接种菌液到含有不同染料(染料的初始浓度为均为100mg/L)的培养基中，菌株MZS1能分别以4种不同结构类型的染料(刚果红、胭脂红、中性红、苯胺蓝和孔雀绿)为唯一碳源生长，并且能分别降解这几种不同的染料，取最适脱色条件下经24h脱色的培养液50mL，10000r/min离心5min，取上清液进行紫外-可见光光谱扫描，以不加菌液的染料无机盐培养基作为对照。

如图3所示，通过对降解产物的紫外-可见光谱分析，可以看出经菌株脱色后，染料培养液的特征性吸收峰明显下降，甚至消失，并且都没有其他峰出现，说明脱色过程中染料被降解了。染料浓度为100mg/L时，除了对杂环类染料中性红的降解效率不高之外，100mg/L的刚果红、胭脂红、孔雀绿和苯胺蓝染料几乎被菌株MZS1分别彻底降解。

实施例5毒死蜱的降解

(1)毒死蜱标准曲线

利用毒死蜱在紫外光区293nm处有特征吸收峰的性质，采用紫外分光光度法测定溶液中毒死蜱的残留量(王金花.毒死蜱降解微生物的筛选及其降解特性研究[M],山东农业大学，2004.)。

具体方法为：配置不同浓度的毒死蜱标准液，各取2mL，加入等体积石油醚和适量NaCl，在漩涡振荡器上振荡提取30min，静置1h分层，取石油醚层用紫外分光光度计测定在293nm波长的吸光值(A293)。根据浓度和A293值制定标准曲线。

结果表明，在0-250mg/L的范围内，毒死蜱的浓度与吸光度值呈良好的线性关系，如图4。

(2)样品中毒死蜱的检测

A.液体培养毒死蜱的检测

在毒死蜱的降解实验培养结束后，取培养液10000r/m离心5min。取上清液，加入等体积石油醚和适量的NaCl，漩涡震荡器上充分振荡提取30min，静置1h分层，取石油醚层进行测定。根据标准曲线进行换算液体中毒死蜱的浓度(毒死蜱高于250mg/L的萃取液稀释适当倍数，使得毒死蜱的浓度符合标准曲线的线性范围，再进行检测)。

毒死蜱降解率计算：

降解率＝(未接菌培养液毒死蜱浓度-接菌培养液毒死蜱浓度)/未接菌培养液毒死蜱浓度×100％

B.土壤中的毒死蜱提取

每个样品各取5g土壤于100mL的三角烧瓶中，用20mL石油醚，25℃恒温震荡提取1h，离心，过滤，收集滤液合并，浓缩并定容至5mL，测定，根据标准曲线换算土壤中毒死蜱的浓度(毒死蜱浓度高于250mg/L的定溶液离心后稀释适当倍数，使得毒死蜱的浓度符合标准曲线的线性范围，再进行检测)。

(3)生长曲线与降解情况

接种菌株MZS1至LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养16h。按5％(V/V)的接种量，接种菌液到含不同毒死蜱浓度(0、500mg/L和1000mg/L，每个浓度各3个平行)的LB培养基，每隔2-3h取培养液测定菌悬液OD600；每隔6h或7h取菌液用无菌不加毒死蜱的培养液稀释5倍，测定毒死蜱的降解率。

结果如下：毒死蜱的浓度会影响菌株的生长，浓度越大，菌株生长适应的时间就越长，并且越晚进入生长的对数期，500mg/L浓度下比不含毒死蜱情况下，菌株晚7h左右进入对数期，而1000mg/L浓度下晚17h左右(图5)。菌株对毒死蜱的降解率随时间的增加而增加，菌株生长进入平台期后，降解率增加趋势逐渐减缓，最终达到最大降解率(图6)，毒死蜱浓度1000mg/L，经过45h左右的降解，降解率为61.69％，毒死蜱浓度500mg/L，经过45h左右的降解，降解率为82.50％，虽然浓度低降解率大，但是高浓度条件下，毒死蜱的绝对去除量最终高于低浓度的条件下的降解量(图6和图7)。

(4)毒死蜱浓度与菌株降解情况

接种菌株MZS1至LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养16h。按5％(V/V)的接种量，接种菌液到含不同毒死蜱浓度(500mg/L、1000mg/L、2000mg/L、5000mg/L，每个浓度各3个平行)的LB培养基，培养45h后，菌液用无菌不加毒死蜱的培养液稀释一定倍数(5或50倍)，测定毒死蜱的降解率。

结果如下：菌株对高浓度的毒死蜱仍表现出一定的降解能力，在毒死蜱5000mg/L浓度下培养45h后，降解率达到约50％(图8)，说明了菌株极高的毒死蜱降解能力。

(5)菌株对毒死蜱的耐受极限

接种菌株MZS1至LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养16h。按5％(V/V)的接种量，接种菌液到含不同毒死蜱浓度(5000mg/L、10000mg/L、20000mg/L和50000mg/L，每个浓度各3个平行)的LB培养基，培养45h后，检测菌株的生长。

因为加入毒死蜱浓度太高，培养液很浑浊，无法读取吸光值，采用无菌操作取样，采取稀释涂布的方法，37℃培养24h后，观察生长情况并取其中一个梯度的3个平行计数。结果每个浓度梯度下菌株均能良好生长，菌株表现出了对毒死蜱极高的耐受力。通过计数检测，菌密度随毒死蜱浓度增加而降低。

实施例6水和土壤修复实验

取蔬菜地的新鲜土和池塘新鲜水，设置8个处理，每个处理3个平行。

(1)灭菌土(新鲜土121℃灭菌20min)，不接种菌株MZS1

(2)新鲜土，不接种菌株MZS1

(3)灭菌土(121℃灭菌20min)，接种菌株MZS1

(4)新鲜土，接种菌株MZS1

(5)灭菌水(池塘水121℃灭菌20min)，不接种菌株MZS1

(6)池塘水，不接种菌株MZS1

(7)灭菌水，接种菌株MZS1

(8)池塘水，接种菌株MZS1

土样和水样均装在不透明的缸中，土样中毒死蜱浓度分别为100mg/kg和500mg/kg，水样中毒死蜱浓度分别为100mg/L或500mg/L。接种菌株MZS1至LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养16h-18h。按5％(每kg土样50mL菌液，每L水样50mL菌液)的接种量，与样品均匀混和。避光条件下37℃培养15d，测定土壤中的毒死蜱残留量(图9)和降解率(图10)。

结果如下：不接菌的情况下，灭菌的土壤(水)，毒死蜱有很低的降解率，可能是由于物化因素引起，而不灭菌的土壤(水)毒死蜱的降解率比在灭菌的土壤(水)高很多(图10)，说明土壤和水体中的土著微生物在毒死蜱降解中起着一定的作用。

接菌的情况下，土壤和水条件下毒死蜱的降解率都比较高，未灭菌土壤(100mg/kg毒死蜱)毒死蜱的降解率为61.39％，未灭菌土壤(500mg/kg毒死蜱)毒死蜱的降解率为49.45％，未灭菌水(100mg/L毒死蜱)毒死蜱的降解率为65.36％，未灭菌水(500mg/L毒死蜱)毒死蜱的降解率为51.53％。不灭菌的土壤(水)条件下毒死蜱的降解稍高于灭菌的土壤(水)条件下，说明菌株对土壤和水体中的毒死蜱具有良好的降解能力，并且能与土著菌形成稳定的群落关系，协同进行毒死蜱的降解。

Claims (2)

1.一株多功能枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MZS1，其保藏号为CCTCC NO：M2014042。

2.如权利要求1所述的多功能枯草芽孢杆菌MZS1在木质素和纤维素的降解、广谱性染料脱色以及在毒死蜱降解中的应用。