CN101966530A

CN101966530A - 一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法

Info

Publication number: CN101966530A
Application number: CN 201010276815
Authority: CN
Inventors: 虞云龙; 王晓; 张群
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2010-09-09
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2030-09-09
Also published as: CN101966530B

Abstract

本发明公开了一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法，包括：将侧芽孢杆菌(Bacillus Latersprorus)DSP或其携带的质粒或包含该质粒的转化子接种到残留毒死蜱的土壤中。本发明侧芽孢杆菌DSP具有降解毒死蜱的能力，经研究发现该菌株的质粒为可转移质粒，通过在土壤中接种该质粒或者含该质粒的菌株，该质粒可以转化到土壤微生物中，甚至可能与土壤微生物中基因发生重组，一方面解决了外源微生物在土壤中生存困难的问题，另一方面降解菌能最大限度的分散，尽可能地降解毒死蜱。

Description

一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法

技术领域

本发明涉及环境保护技术领域，尤其涉及一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法。

背景技术

毒死蜱是一种高效、广谱、中等毒性的有机磷杀虫、杀螨剂，广泛用于防治水稻、麦类、玉米、棉花、甘蔗、茶叶、果树、花卉和牧畜等方面的螟虫、卷叶虫、粘虫、介壳虫、蚜虫、叶蝉和害螨等百余种害虫，是我国用量最大的杀虫剂之一。毒死蜱在土壤中的半衰期则受毒死蜱浓度、土壤酸碱度、温湿度、土质、微生物活动状况等各种因素影响，在不同的条件下，其半衰期从几天到几百天不等。毒死蜱的大量使用及其持久性导致土壤的污染，已引起人们的重视。

生物修复是治理土壤有机污染、维护土壤环境健康、实现可持续利用的重要措施之一。生物修复的效率受污染物性质、土壤微生物生态结构以及土壤理化性质、环境条件等生物和非生物因子的影响，生物强化是提高生物修复效率的有效方法。现行的生物强化主要利用高效降解菌，通常采用的高效降解菌有：土著菌、外源菌以及基因工程菌。高效降解菌进入污染土壤面临两个问题：1)由于生物和非生物的胁迫作用，引入的微生物难以适应土壤环境，无法维持长期的降解活性；2)存活的降解菌在土壤中难以达到良好的广深分散，限制了土壤整体降解能力与净化功能的提高。如何从本质上增强土壤中有机物生物降解的功能多样性和持久性、增强土壤净化功能，是生物修复的关键所在，也是有机污染生物修复有待解决的技术瓶颈问题。

发明内容

本发明提供了一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法，该方法解决了传统方法微生物难以适应土壤环境以及分散困难的问题。

一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法，包括：将侧芽孢杆菌(BacillusLatersprorus)DSP或其携带的质粒或包含该质粒的转化子接种到残留毒死蜱的土壤中。

侧芽孢杆菌DSP保藏于位于武汉市珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2010年8月16日，保藏号为CCTCCAB 2010351。

上述侧芽孢杆菌DSP主要生理学特征：

在营养肉汁琼脂培养基上，菌落圆形，光滑，不透明，湿润，乳白色。菌落直径1～2mm左右。革兰氏染色阴性，24h培养细胞杆状，细胞约0.3m×2m，芽孢侧中生，孢囊膨大，鞭毛周生。

优选地，所述的土壤pH值为2～8.5，所述的土壤毒死蜱含量为0.1～2mg/kg；所述的土壤有机质含量为5～50g/kg。

本发明还提供了一种侧芽孢杆菌(Bacillus Latersprorus)DSP携带的质粒及包含该质粒的转化子。

本发明侧芽孢杆菌DSP具有降解毒死蜱的能力，经研究发现该菌株的质粒为可转移质粒，通过在土壤中接种该质粒或者含该质粒的菌株，该质粒可以转化到土壤微生物中，甚至可能与土壤微生物中基因发生重组，一方面解决了外源微生物在土壤中生存困难的问题，另一方面降解菌能最大限度的分散，尽可能地降解毒死蜱。

附图说明

图1为侧芽孢杆菌DSP电镜观察图；

图2为侧芽孢杆菌DSP和质粒pDOC处理土壤中毒死蜱的降解曲线；

图3为侧芽孢杆菌DSP和质粒pDOC处理土壤中毒死蜱降解菌数量变化曲线。

具体实施方式

侧芽孢杆菌DSP在2010年8月16日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其分离、纯化和鉴定过程同王晓等公开的侧芽孢杆菌(王晓等，毒死蜱降解菌株Bacillus latersprorus DSP的降解特性及其功能定位，土壤学报，第43卷4期，2006年07月)

培养基

LB培养基：酵母膏，5.0g；蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g；蒸馏水，1000ml；pH，7.0。高压蒸汽灭菌20min。

基础培养基：MgSO₄·7H₂O，20mg；EDTA，5mg；FeSO₄·7H₂O，2mg；ZnSO₄·7H₂O，0.1mg；MnSO₄·H₂O，0.03mg；H₃BO₃，0.3mg；CoSO₄·7H₂O，0.24mg；CuSO₄·5H₂O，0.01mg；NiSO₄·7H₂O，0.02mg；Na₂MoO₄·2H₂O，0.03mg；Ca(OH)₂，0.5mg；蒸馏水，1000ml；pH，7.0。高压蒸汽灭菌20min。

M培养基：K₂HPO₄·3H₂O，2.96g；KH₂PO₄，0.87g；(NH₄)₂SO₄，1.1g；MgSO₄，0.097g；MnSO₄·H₂O，0.025g；FeSO₄·7H₂O，0.005g；CaSO₄，0.0015g；抗坏血酸，0.005g；蒸馏水，1000ml；pH，7.0。高压蒸汽灭菌20min。

纯培养系统中毒死蜱的提取

将培养液转入分液漏斗中，用3×50ml二氯甲烷液-液分配萃取，下层有机相经过无水硫酸钠合并于250ml平底烧瓶中，在旋转蒸发器上浓缩至1-2ml，然后用氮气流吹干，用重蒸石油醚定容至5ml供GC分析。

土壤中毒死蜱的提取

取土20g，加入50ml丙酮和20ml水，150r·min^-1振荡1h，过滤，浓缩后将培养液转入分液漏斗中，用3×50mL石油醚三次振摇，液-液分配萃取，上层有机相经过无水硫酸钠合并于250mL平底烧瓶中，在旋转蒸发器上浓缩至1-2mL，用重蒸石油醚定容至10mL供GC分析。

毒死蜱的气相色谱测定

气相色谱仪：GC-9790；检测器：FPD；色谱柱：AT.RPAII农药分析专用柱，30m×0.32mm×0.25μm；进样口温度：250℃；柱温：230℃；检测器温度：250℃；载气(N₂)：50mL·min^-1；氢气：120mL·min^-1；空气：80mL·min^-1。

侧芽孢杆菌DSP质粒消除

侧芽孢杆菌DSP接种于3ml LB培养基中，30℃摇床过夜培养，然后取200μl菌液，分别接入含吖啶橙浓度为150mgL^-1、300mgL^-1的5ml LB培养基中，30℃摇床培养24h，分别稀释涂布于LB平板，42℃培养24h，再于30℃培养24h，然后取若干单个菌落分别稀释并涂布于LB平板上，30℃培养过夜，再挑取单个菌落分别点种于LB平板及M平板(含毒死蜱50mgL^-1)的对应位置，培养2～3d观察平板的生长情况。在M平板(含毒死蜱50mgL^-1)上不生长的菌落视为质粒消除菌。

质粒pDOC的提取

质粒的提取采用碱法，取1.5ml新鲜侧芽孢杆菌DSP(图1)培养液倒入1.5ml eppendorf管中，4℃下12000×g离心30s。弃上清液将菌体沉淀重悬浮于100μl溶液I，室温下放置5min。加入溶液II200μl，温和颠倒eppendorf管数次，冰浴5min。加入150μl溶液III，温和颠倒10s，冰浴10min，4℃下12000×g离心10min。上清液移入干净eppendorf管加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡混匀，4℃下12000g离心5min。将水相移入干净的eppendorf管中加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀置于-20℃冰箱中20min，然后在4℃下12000×g离心10min。弃上清液，加入1ml 70％的乙醇沉淀一次，4℃下12000×g离心5min。吸除上清液，真空干燥10min，将沉淀溶于20μl TE缓冲液(pH8.0，含20μg ml-1RNA核酸酶A)中，储于-20℃冰箱中。

质粒pDOC转化

取1μl的侧芽孢杆菌DSP质粒加入感受态E.Coli JM109，轻轻摇匀，冰浴放置30min，42℃水浴中热击90s后迅速置于冰浴冷却5min，加入1mlLB液体培养基，混匀后在37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，分别取100μl涂布M平板(含毒死蜱50mg·L^-1)，于30℃培养2～3d观察细菌生长情况，筛选获得E.Coli JM109(pDOC)。

菌株毒死蜱降解力试验

在100ml灭菌的三角瓶中加入20ml基础培养基，添加毒死蜱浓度1mg·L^-1，分别接种侧芽孢杆菌DSP(pDOC)、质粒消除后的侧芽孢杆菌DSP(pDOC^-)、质粒回复的侧芽孢杆菌DSP(pDOC)、E.Coli JM109、E.ColiJM109(pDOC)，在pH 7.0、25℃、150r·min^-1的条件下黑暗振荡培养，3d后定时取样，测定毒死蜱降解率。同时设不加菌的对照，处理与对照各为3个重复。试验结果如表1，质粒消除后，原毒死蜱降解菌失去降解能力；E.Coli JM109本身不具备对毒死蜱的降解能力，获得质粒pDOC后获得降解能力。结果证明，侧芽孢杆菌s DSP对毒死蜱的降解功能位于质粒pDOC。

表1不同试验菌株对毒死蜱的降解率

土壤中毒死蜱残留的生物修复

土壤采自浙江大学华家池校区试验田0-15cm的新鲜土样(表2)，去除杂草树根，石砾等杂质，过2mm筛，风干。取1200g风干土壤，添加毒死蜱浓度至200mg·kg^-1，分别加入侧芽孢杆菌DSP(菌浓度10⁵g^-1土)和质粒pDOC，过筛(2mm)四次，尽可能使细菌及毒死蜱与土壤混匀，调节土壤含水量为田间最大持水量的60％，置于培养盆中，覆盖锡纸(留若干小孔通气)，在25℃的条件下黑暗培养，并在22d、37d二次添加毒死蜱浓度100mg·L^-1。第一次处理后0d、7d、14d、21d、22d、29d、36d、37d、44d、51d定时取样，处理与对照各为3个重复。

表2土壤性质参数

接种侧芽孢杆菌DSP菌和质粒pDOC于供试土壤中，51d毒死蜱的连续降解曲线(图2)。对照土壤中，毒死蜱的降解较慢，21、36和51天的残留量分别为129.9、173.9和200.9mg/kg，每次加药后的试验终点残留水平逐步提高，显示一定程度的积累性。

经侧芽孢杆菌DSP和质粒pDOC处理后，土壤中残留毒死蜱的降解明显加速。第一次添加毒死蜱后，侧芽孢杆菌DSP菌处理土壤中毒死蜱21d的降解率为64.3％，质粒pDOC处理土壤21d的降解率为61.6％，两者相差无几。二次添加毒死蜱后，质粒pDOC处理土壤中毒死蜱降解速率开始超过侧芽孢杆菌DSP菌处理的土壤，降解速率达55.4％。第三次添加毒死蜱后，质粒pDOC处理土壤中毒死蜱降解已明显加速，14天内降解率达63.3％，侧芽孢杆菌DSP处理土壤中毒死蜱降解率仅为43.3％。

利用MPN法测得的土壤中毒死蜱降解菌数量的变化(如图3)。在对照土壤中，毒死蜱的降解菌数量一直处于较低水平，经侧芽孢杆菌DSP和质粒pDOC处理后，土壤中毒死蜱降解菌数量明显提高，第一次加药初期，侧芽孢杆菌DSP处理土壤中毒死蜱降解菌数量远高于质粒pDOC处理土壤，随后质粒pDOC处理土壤毒死蜱降解菌数量逐渐接近并远超侧芽孢杆菌DSP处理土壤，说明质粒pDOC可以转入土壤微生物形成毒死蜱降解菌群。

图2和图3结果表明，质粒pDOC本身或侧芽孢杆菌DSP携带的质粒pDOC可向土著微生物转移形成降解毒死蜱的菌群，从而有效增强土壤中毒死蜱生物降解效果。

Claims

1.一种毒死蜱污染土壤的生物修复方法，包括：将侧芽孢杆菌(BacillusLatersprorus)DSP或其携带的质粒或包含该质粒的转化子接种到残留毒死蜱的土壤中，所述的侧芽孢杆菌DSP的保藏号为CCTCC AB 2010351。

2.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于：所述的土壤pH值为2～8.5。

3.根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于：所述的土壤有机质含量为5～50g/kg。

4.一种权利要求1所述的侧芽孢杆菌(Bacillus Latersprorus)DSP携带的质粒。

5.一种含权利要求4所述的质粒的转化子。