CN113957002A - 一株木质素降解芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株木质素降解芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株木质素降解芽孢杆菌及其应用。利用富集培养法，从腐木、土壤中分离出具有木质素降解能力的菌株TR‑03，经过生理生化和16SrDNA鉴定，该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌，该菌株可以以木质素为唯一碳源生长，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TR‑03，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20889。该菌株产木质素降解酶能力强，具有良好的木质素降解效果。

Description

一株木质素降解芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一株木质素降解芽孢杆菌及其应用。
背景技术
木质纤维素是地球上最丰富、最廉价易得的可再生能源之一，基于糖平台的生物炼制技术是木质纤维素原料资源化利用的有效途径，主要包括木质纤维素的预处理、酶解、发酵3 个步骤。其中木质纤维素本身的抗生物降解能力是其生物利用过程的最大瓶颈，借助合适的预处理方法破坏其复杂、致密的结构是实现高值化利用的关键，决定了其他步骤的可操作性，其效能也决定了整个过程的经济性。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，其中木质素复杂的三维空间结构及其性质使得天然木质纤维素对微生物酶水解作用具有很强的抗逆性，因此探索木质素的高效降解机制、破解木质素对木质纤维素酶水解的物理化学屏障，对开发木质纤维原料的生物炼制技术具有重要的意义。
从20世纪八十年代起，国内外针对木质素的高效降解进行了大量的研究，木质素可通过物理、化学、物理-化学等方法降解，但大多数方法都需要严苛的操作条件、高耗能、高成本且在降解过程中产生抑制物，不利于后续的酶解、发酵过程。生物预处理由于具有低能耗、无化学药品添加以及对环境友好的优势而被认为是一种极具潜力的生物质预处理方法。其中对以白腐菌为代表的真菌木质素降解研究最为广泛和深入，在降解酶系组成及调控、降解酶基因工程以及降解机理等方面取得了一定的进展，但由于白腐菌存在预处理周期长、降解木质素的同时也降解纤维素和半纤维素、对环境适应性差、以及易于被孢子污染等问题，以真菌为主要模式菌株开展的木质素生物降解研究长期未能取得突破，需要探索更好的生物降解木质素途径。
迄今为止，国内外学者从白蚁肠道、牛胃、土壤和堆肥等材料中分离筛选出多种能够降解木质素的细菌，主要为红球菌属(Rhodococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等，其中包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。B.subtilis是一类产芽孢杆状革兰氏阳性细菌，广泛存在于土壤、湖泊、海洋和动植物的体表。作为一种安全的重要模式菌株，B.subtilis广泛应用于酶制剂、抗生素、外源蛋白等内源生化产品的生产，已经成为医药、饲料、食品等工业化生产中重要的生物技术工具。与其它木质素降解细菌相比，B.subtilis具有安全无害、可改造性强、鲁棒性强等优点，同时还可在不良环境下形成休眠体芽孢，在工业化生产中可制成芽孢菌粉，从而可在降解木质素的实际应用中高效稳定的持续发挥降解作用。
发明内容
本研究旨在从环境中分离、筛选出木质素高效降解枯草芽孢杆菌，验证其应用效果。
为实现上述发明的目的，采用的技术方案是：一株木质素降解芽孢杆菌，该菌为枯草芽孢杆菌，菌株编号TR-03，菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020.10.14，保藏编号为CGMCC No.20889，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
所述的一株木质素降解芽孢杆菌的筛选方法，包括以下步骤：
(1)将腐木和土壤样品，加入LB培养基，培养富集菌种；
(2)将步骤(1)所得菌种原液稀释，水浴加热；
(3)将步骤(2)中所有样品混合梯度稀释，分别涂布愈创木酚、苯胺蓝显色平板，以及木质素唯一碳源平板，然后培养；
(4)从步骤(3)中的选择性培养基上挑选目的菌落进行划线纯化，至菌落性状稳定转接至LB试管斜面培养基中，筛选得到一株菌TR-03，其菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，经革兰氏染色确认为革兰氏阳性菌，16SrDNA鉴定为枯草芽孢杆菌。
步骤(1)中所述LB培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.2；步骤(3)中所述愈创木酚显色平板为LB培养基中添加0.5～1.0％的愈创木酚、苯胺蓝显色平板为LB培养基中添加0.1～0.2％的苯胺蓝，木质素唯一碳源平板培养基 (g/L)：(NH4)2SO41～2，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，KH2PO41～2，FeSO4·7H2O 0.03～0.05， ZnSO4·7H2O 0.001～0.003，CaCl2·2H2O 0.1～0.2，K2HPO41.0～2.0，MnSO4·H2O0.01～0.02， CuSO4.5H2O 0.001～0.003，碱木质素1.0～4.0，琼脂15g/L，pH 6.5～7.0。
步骤(1)中是将腐木、土壤样品1～5g，加入6～30mL LB培养基，30～37℃培养20～30h。
步骤(2)是将所得菌种原液稀释10倍，放置于75-80℃水浴锅加热15-20min。
步骤(3)是将所有样品混合经梯度稀释10-4～10-5，分别涂布愈创木酚、苯胺蓝显色平板，以及木质素唯一碳源平板，30～37℃培养。
所述的一株木质素降解芽孢杆菌在降解木质素中的应用。
所述木质素降解芽孢杆菌降解木质素所用降解酶包括木质素过氧化物酶和漆酶。
所述木质素降解芽孢杆菌降解木质素时将枯草芽孢杆菌TR-03接种于以碱木质素为唯一碳源的液体培养基中。
将枯草芽孢杆菌TR-03接种于LB培养基中，摇瓶培养24～36h；然后以2％～4％接种量接种到木质素唯一碳源液体培养基降解木质素。
有益效果
本发明的菌株Bacillus subtilis TR-03具有降解木质素的能力，本发明扩充木质素降解菌株的菌种库，有利于进一步提高细菌在木质素降解领域的深入应用。
附图说明
图1为本发明TR-03菌株的16S rDNA的系统发育树。
图2为本发明菌株B.subtilisTR-03的木质素降解酶活曲线。
图3为本发明菌株的木质素降解扫描电镜图。
具体实施方式
一株木质素降解芽孢杆菌，其特征在于，所述菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株保藏日期为2020.10.14，保藏编号为CGMCC No.20889，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TR-03筛选自南京紫金山的腐木、土壤。
所述一株木质素降解枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TR-03的筛选方法包括以下步骤：
1)将腐木、土壤样品1～5g，加入6～30mL LB培养基，30～37℃培养20～30h，富集菌种；
2)将所得菌种原液稀释10倍，放置于75-80℃水浴锅加热15-20min；
3)将所有样品混合经梯度稀释10-4～10-5，分别涂布愈创木酚、苯胺蓝显色平板，以及木质素唯一碳源平板，30～37℃培养；
4)挑选目的菌落进行划线纯化3～4次，至菌落性状稳定转接至LB试管斜面培养基中，筛选得到一株菌TR-03，其菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，经革兰氏染色确认为革兰氏阳性菌。
对所述菌株TR-03进行16S rRNA鉴定，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。并于NCBI中进行BLAST比对构建系统发育树。
所述枯草芽孢杆菌TR-03降解木质素所用降解酶包括木质素过氧化物酶和漆酶。
本发明中所述Bacillus subtilisTR-03的木质素降解酶活，漆酶酶活测定以ABTS为底物，与粗酶液在420nm处测定反应体系的吸光值变化；木质素过氧化物酶以藜芦醇为底物，与粗酶液在310nm处测定反应体系的吸光值变化；锰过氧化物酶以2,6-二甲氧基苯酚为底物，与粗酶液在468nm处测定反应体系的吸光值变化。
实施例1：Bacillus subtilis TR-03的分离筛选与鉴定
本实施例从采集自南京紫金山腐木、土壤样品中富集芽孢杆菌，具体如下：
(1)分别将1g腐木和土壤样品，加入6mL LB培养基，37℃培养20h，富集菌种；
(2)将步骤(1)所得菌种原液稀释10倍，放置于75℃水浴锅加热20min；
(3)将步骤(2)中所有样品混合经梯度稀释10-4，分别涂布愈创木酚、苯胺蓝显色平板，以及木质素唯一碳源平板，30～37℃培养；
LB培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.2；愈创木酚显色平板为LB培养基中添加1.0％的愈创木酚、苯胺蓝显色平板为LB培养基中添加0.1％的苯胺蓝，木质素唯一碳源固体平板培养基(g/L)：(NH4)2SO41，MgSO4·7H2O 0.01，KH2PO41.0， FeSO4·7H2O 0.05，ZnSO4·7H2O 0.001，CaCl2·2H2O 0.1，K2HPO41.0，MnSO4·H2O 0.01， CuSO4.5H2O 0.001，碱木质素1.0，琼脂15g/L，pH 6.5-7.0；
(4)从步骤(3)中的选择性培养基上挑选目的菌落进行划线纯化3～4次，至菌落性状稳定转接至LB试管斜面培养基中，筛选得到一株菌TR-03，其菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，经革兰氏染色确认为革兰氏阳性菌；
(5)提取该菌的基因组DNA并以此为模板采用通用27F，1514R引物扩增16S rDNA片段，将该菌的16S rDNA序列上传到NCBI数据库进行序列比对，然后用CLUSTALW2软件进行同源性分析，再用MEGA5软件构建该菌的系统发育树，参见图1。
实施例2：菌株木质素降解酶活测定
刮取斜面菌种接种至LB培养基中，培养36h测定木质素降解酶活，酶活测定方法如下：
漆酶活力测定：以ABTS为底物测定漆酶活力，反应体系为3mL，检测波长为420nm。反应体系含有50mMNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液，1mMABTS以及100μL粗酶液，使用紫外分光光度计测定一分钟内反应体系吸光度增加值。
木质素过氧化物酶活力测定：以藜芦醇为底物测定木质素过氧化物酶活力，反应体系为3 mL，检测波长为310nm。反应体系含有50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，1mM藜芦醇，100μL粗酶液，加入0.1mM H2O2启动反应，使用紫外分光光度计测定一分钟内反应体系吸光度增加值。
锰过氧化物酶活力测定：以2,6-二甲氧基苯酚为底物测定锰过氧化物酶活力，反应体系为3mL，检测波长为468nm。反应体系含有50mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，1mM 2,6- 二甲氧基苯酚，1mM MnSO4以及100μL粗酶液，加入0.1mM H2O2启动反应，使用紫外分光光度计测定一分钟内反应体系的吸光度增加值。
酶活定义：将每分钟使1μM底物转化为产物所需的酶量定义为一个国际制酶活单位(U)，所有试验重复3次，结果取平均值，结果参见图2。该菌具有漆酶、木质素过氧化物酶(Lip)酶活，未检测到锰过氧化物酶，并且两种酶均在培养第4天达到最高酶活，随后缓慢降低。
实施例3：菌株木质素降解应用
刮取斜面菌种接种至30mLLB培养基，180rpm，37℃培养过夜，以2％接种量接种到木质素唯一碳源培养基中，配方为(NH4)2SO41，MgSO4·7H2O 0.01，KH2PO41.0，FeSO4·7H2O0.05， ZnSO4·7H2O 0.001，CaCl2·2H2O 0.1，K2HPO41.0，MnSO4·H2O 0.01，CuSO4.5H2O0.001，碱木质素1.0，pH 6.5-7.0，180rpm，37℃培养3d，从未接菌和接菌样品中取50mL发酵液， 10000g离心8min，取上清置于真空冷冻干燥机冷冻干燥至恒重，将干燥后的样品进行扫描电镜分析，结果见图3。经菌株处理后，完整的木质素颗粒被分解成微小碎片，说明该菌株能够降解木质素。

Claims (10)

1.一株木质素降解芽孢杆菌，其特征在于，该菌为枯草芽孢杆菌，菌株编号TR-03，菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2020.10.14，保藏编号为CGMCC No.20889，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的一株木质素降解芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将腐木和土壤样品，加入LB培养基，培养富集菌种；
(2)将步骤(1)所得菌种原液稀释，水浴加热；
(3)将步骤(2)中所有样品混合梯度稀释，分别涂布愈创木酚、苯胺蓝显色平板，以及木质素唯一碳源平板，然后培养；
(4)从步骤(3)中的选择性培养基上挑选目的菌落进行划线纯化，至菌落性状稳定转接至LB试管斜面培养基中，筛选得到一株菌TR-03，其菌落呈乳白色，不透明，边缘不整齐，经革兰氏染色确认为革兰氏阳性菌，16SrDNA鉴定为枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求2所述木质素降解芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中所述LB培养基的配方为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH7.0～7.2；步骤(3)中所述愈创木酚显色平板为LB培养基中添加0.5～1.0％的愈创木酚、苯胺蓝显色平板为LB培养基中添加0.1～0.2％的苯胺蓝，木质素唯一碳源平板培养基(g/L)：(NH4)2SO4 1～2，MgSO4·7H2O 0.01～0.02，KH2PO4 1～2，FeSO4·7H2O 0.03～0.05，ZnSO4·7H2O 0.001～0.003，CaCl2·2H2O 0.1～0.2，K2HPO4 1.0～2.0，MnSO4·H2O 0.01～0.02，CuSO4.5H2O0.001～0.003，碱木质素1.0～4.0，琼脂15g/L，pH 6.5～7.0。
4.根据权利要求2所述木质素降解芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中是将腐木、土壤样品1～5g，加入6～30mL LB培养基，30～37℃培养20～30h。
5.根据权利要求2所述木质素降解芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，步骤(2)是将所得菌种原液稀释10倍，放置于75-80℃水浴锅加热15-20min。
6.根据权利要求2所述木质素降解芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，步骤(3)是将所有样品混合经梯度稀释10-4～10-5，分别涂布愈创木酚、苯胺蓝显色平板，以及木质素唯一碳源平板，30～37℃培养。
7.权利要求1所述的一株木质素降解芽孢杆菌在降解木质素中的应用。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述木质素降解芽孢杆菌降解木质素所用降解酶包括木质素过氧化物酶和漆酶。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述木质素降解芽孢杆菌降解木质素时将枯草芽孢杆菌TR-03接种于以碱木质素为唯一碳源的液体培养基中。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将枯草芽孢杆菌TR-03接种于LB培养基中，摇瓶培养24～36h；然后以2％～4％接种量接种到木质素唯一碳源液体培养基降解木质素。
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