KR101351539B1 - 알긴산 및 라미나린 분해능을 가지는 복합 미생물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알긴산 및 라미나린 분해능을 가지는 복합 미생물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 갈조류 가공 공정 및 추출 공정 중에 발생 되는 부산물인 알긴산 및 라미나린을 분해시키는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans), 스테노트로포모나스 테레(Stenotrophomonas terrae), 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans), 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 구성된 6종의 복합 미생물 및 복합 미생물을 이용한 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물을 분해하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 알긴산 및 라미나린의 분해능력이 뛰어난 복합 미생물의 제공이 가능하며, 복합 미생물은 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물인 알긴산 및 라미나린을 효과적으로 분해하여 글루코오스 등의 환원당을 생산할 수 있어 생리활성물질이나 바이오에탄올 생산 등의 재활용 방법에 응용될 수 있다.

Description

알긴산 및 라미나린 분해능을 가지는 복합 미생물{Mixed Microorganisms Having Degradation Activity of Alginate and Laminarin}
본 발명은 알긴산 및 라미나린 분해능을 가지는 복합 미생물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 갈조류 가공 및 추출 공정 중에 발생 되는 부산물인 알긴산 및 라미나린을 분해시키는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans), 스테노트로포모나스 테레(Stenotrophomonas terrae), 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans), 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 구성된 6종의 복합 미생물 및 복합 미생물을 이용한 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물을 분해하는 방법에 관한 것이다.
현재 세계적으로 기후변화협약과 환경규제 강화에 의해서 석유 및 석탄을 대체할 수 있는 안정적이며 환경 친화적인 에너지를 개발하기 위한 바이오, 수소 및 태양 등의 신 재생에너지의 연구가 활발히 진행되고 있다. 바이오 에너지 생산의 원료로는 주로 사탕수수 및 옥수수 등의 곡물류와 임업 및 농업 부산물인 목질계 자원들을 이용하고 있으나, 식량난 문제와 작물 종류에 따른 지배 면적 한정성 및 영양분 공급의 어려움, 그리고 셀룰로오스 이외의 헤미셀룰로오스 및 리그닌 등의 추가 전처리 공정에 의한 경제성과 같은 문제로 곡물류와 목질계 자원을 이용한 바이오 연료 생산의 한계가 드러나고 있다.
이러한 문제점들을 해결하기 위하여, 최근에는 많은 섬유질 및 다양한 다당류로 구성되어 있는 해양 조류가 새로운 바이오 에너지 원료로서 주목을 받고 있다. 해조류는 목재와 식물계 셀룰로오스보다 빠른 속도로 성장하며 광합성 반응으로 공기 중 이산화탄소를 흡수하므로 온실 가스를 줄일 수 있는 효과가 있고, 해조류 내 리그닌의 함량이 적어 전처리 공정을 간소화할 수 있어서 바이오 연료 원료로서의 많은 잠재성을 내포하고 있다. 대형 해조류는 종에 따라 구성하고 있는 다당류의 종류 및 결합 형태가 다양한데, 특히 다시마, 미역과 같은 갈조류는 녹색식물과 유사성이 많으며, 구조 다당류로 셀룰로오스가 5.7%~14.3%, 세포 사이에는 점질성 다당류인 알긴산, 퓨코이단 및 저장성 다당류인 라미나린 등으로 구성되어 있다.
갈조류 가공 공정 및 추출에서 발생 되는 부산물인 라미나린은 β-1,3-글루코오즈 결합이 주 골격이며 부분적으로 β-1,6-글루코오스 결합으로 구성되어 있고, 알긴산은 D-만뉴론산과 L-글루론산이 β-1,4 결합으로 구성되어 있으며, 호모폴리머 형태로 결합된 폴리만뉴론산(MM), 폴리글루론산(GG) 형태 또는 두 성분이 혼합된 헤테로폴리머(MG) 형태가 일정하지 않게 섞여져 구성되어 있다. 현재까지 갈조류로부터 알칼리, 산 또는 효소 처리 등의 가공 방법을 통해 해조 다당류인 알긴산, 퓨코이단을 추출하여 식품 첨가제, 건강 식량 자원으로서 산업적으로 많이 유용하게 이용되고 있으나 갈조류 자체의 분해하기 어려운 복잡한 구조로 인해 바이오 연료 생산용 기질로서 사용하기에 어려움이 있으며, 현재 이용되고 있는 물질 이외에 발생되는 부산물 및 폐기물들의 처리가 문제점으로 남아 있다.
최근 갈조류 분해효소를 생산하는 신규 미생물과 효소를 이용한 방법 등이 국내외적으로 보고가 되고 있으나(Franklin et al ., J. Bacteriol ., 186:4759, 2004; Cao et al ., J. Agric . Food Chem ., 55:5113, 2007; C. G. C. Chesters et al., Biochem . J., 86:28, 1963; 한국특허출원 2004-0021662호; 한국등록특허 10-0985841), 알긴산 및 라미나린 분해능이 우수한 복합 미생물을 이용하여 갈조류 부산물을 분해하는 방법 관한 연구는 거의 없으며, 대부분의 연구에서 갈조류의 전체 성분을 대상으로 한 것이 아니라, 특정 성분만을 대상으로 하였기 때문에 큰 실효성을 거두지 못하는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 갈조류 가공 및 추출 공정 중에 발생 되어 처리에 어려움이 있는 부산물인 알긴산 및 라미나린을 분해하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 알긴산 및 라미나린을 효과적으로 분해할 수 있는 순수 분리한 6종의 미생물이 혼합된 복합 미생물을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 알긴산 및 라미나린을 효과적으로 분해할 수 있는 6종의 미생물이 혼합된 복합 미생물 및 상기의 복합 미생물을 이용하여 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물을 분해하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 알긴산 및 라미나린 분해능을 가진 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans), 스테노트로포모나스 테레(Stenotrophomonas terrae), 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans), 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 구성된 복합 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기의 복합 미생물을 이용하여 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물을 분해하는 방법을 제공한다.
본 발명의 알긴산 및 라미나린의 분해능력이 뛰어난 복합 미생물의 제공이 가능하며, 복합 미생물은 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물인 알긴산 및 라미나린을 효과적으로 분해하여 글루코오스 등의 환원당을 생산할 수 있어 생리활성물질이나 바이오에탄올 생산 등의 재활용 방법에 응용될 수 있다.
도 1은 라미나린 액체배지에 분리한 6종의 균주의 라미나린 분해능을 나타낸 그래프에 관한 것이다 (pH (▲); Cell density (●); Total reducing sugars (□).
도 2는 분리된 6종의 각 균주와 다른 균들을 교차 도말하여 균 상호 간의 길항 작용에 관한 것이다 ((a) EJ1, (b) EJ2, (c) EJ3, (d) EJ4, (e) EJ5, (f) EJ6).
도 3은 (a) 6종 균주를 혼합한 복합미생물과 (b) EJ4 단일 균주의 라미나린 분해반응을 나타낸 그래프에 관한 것이다 (pH (▲); Cell density (●); Total reducing sugars (■); Glucose (◆)).
도 4는 알긴산 평판 배지에 분리된 6종 균주의 복합 미생물을 37℃에서 (a) 0일과 (b) 6일간 배양하였을 때, 분해에 의한 투명환(clear zone)을 형성하는 모습에 관한 것이다.
도 5는 라미나린 평판 배지에 분리된 6종 균주의 복합 미생물을 37℃에서(a) 0일과 (b) 6일간 배양하였을 때, 분해에 의한 투명환(clear zone)을 형성하는 모습에 관한 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로
이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은
본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 일관점에서, 본 발명은 알긴산 및 라미나린 분해능을 가진 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans), 스테노트로포모나스 테레(Stenotrophomonas terrae), 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans), 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 구성된 복합 미생물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 알긴산 및 라미나린은 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 토양, 갯벌 및 해산 동물의 내장으로부터 채취한 샘플에서 알긴산 및 라미나린 한천배지에서 순수 콜로니를 형성하는 6종의 균주를 확인하였고, 상기 분리된 6개 균주를 EJ1~EJ6으로 명명하였다.
상기 분리된 6종의 균주들의 알긴산 및 라미나린을 분해할 수 있는 능력을 관찰 한 결과, 라미나린 액체 배지에서 가장 높은 분해능을 보인 균주는 EJ4임을 확인할 수 있었다 (도 1). 또한, 알긴산 및 라미나린 평판 배지에서 배양된 각 균주의 콜로니 주변에 환 생성 여부를 확인한 결과, 알긴산 평판 배지에는 EJ1, EJ4 및 EJ6 균주가, 라미나린 평판 배지에서는 EJ4 균주가 다른 균주들에 비해 높은 환을 형성하였으며(표 2), 상기 분리한 종마다 알긴산 및 라미나린 분해능력이 차이가 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 있어서, 상기 복합 미생물은 KACC 91706P인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기의 복합 미생물의 동정을 수행한 결과, EJ1은 바실러스 메가테리움, EJ2는 판토아 에글로메란스, EJ3은 스테노트로포모나스 테레, EJ4는 마이크로박테리움 옥시단스, EJ5는 바실러스 바타비엔시스 및 EJ6은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스로 동정되었다.
상기와 같이 동정된 복합미생물은 2012년 2월 7일자로 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다 (기탁번호: KACC 91706P).
본 발명의 다른 관점에서, 본 발명은 복합 미생물을 이용한 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물을 분해하는 방법에 관한 것이다.
상기의 복합 미생물을 이용하여 알긴산 및 라미나린을 분해할 때, 유용한 물질을 생산하는지 확인한 결과, 복합 미생물에 의해 라미나린이 분해되어 생성된 총 환원당과 글루코오스 농도는 각각 6.14g/ℓ 및 3.39g/ℓ로, 라미나린이 분해되면 환원당으로 글루코오스 이외에 올리고당과 같은 중간대사산물이 생성될 수 있음을 알 수 있었다 (도 3b). 이에 비해, 라미나린 분해능력이 뛰어난 EJ4 단일 균주의 분해반응 결과에서는 총 환원당과 글루코오스 농도가 각각 4.23g/ℓ 및 2.23g/ℓ로 생산되었다 (도 3a). 따라서 EJ4 단일 균주보다 복합미생물을 사용하면, 총 환원당을 1.45배, 글루코오스는 1.71배 더 생산함을 확인하였으며,알긴산 및 라미나린 평판배지에서의 단일 균주에 의한 결과와 비교해 보면, 6종의 균주 상호 간의 상조작용(synergism)으로 이들이 혼합된 복합미생물이 더 뛰어난 알긴산 및 라미나린 분해 능력이 있음을 확인하였다 (도 4 및 도 5).
또한, 상기의 복합 미생물의 서로에 대한 길항 물질을 생산하는지 여부를 확인하기 위하여 알긴산 및 라미나린 평판 배지에 교차 도말하여 비교한 결과, 분리된 6종의 균주 각각은 다른 균주와 상호 간 길항물질을 생산하지 않음을 확인할 수 있었다 (도 2).
본 발명에 있어서, 상기의 복합 미생물과 알긴산 분해요소를 생산하는 것으로 알려진 Pseudomonas sp. (Lee et al ., Kor. J. Microbiol . Biotechnol., 37:350, 2009), Streptomyces sp.(Cao et al., J. Agric . Food Chem ., 55:5113, 2007), Bacillus lilicheniformis AL-577 (Uo et al ., J. Korean . Soc . Food . Sci . Nutr., 35:231, 2006) 및 Erwinia tasmaniensis (Lee et al ., Bioresour . Technol., 102:5962, 2011) 등과 같은 미생물의 알긴산 분해능력을 비교하였을 때, 기존에 알려진 미생물은 각각의 특성에 따라 알긴산 분해효소를 생산하는 최적 반응조건이 다르며, 알긴산이 분해되면서 pH 등의 반응조건이 달라져 각 미생물이 가지는 알긴산 분해능력이 약해지지만, 본 발명은 상호 간 길항작용이 없는 6종의 복합 미생물을 이용하여 알긴산 및 라미나린을 분해시키는 것으로, 알긴산 및 라미나린이 분해되면서 변화되는 반응조건에 대한 충격이 덜해 더 많은 환원당을 생산할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 알긴산 및 라미나린 분해 미생물의 순수분리
본 실시예에서는 알긴산 및 라미나린을 효과적으로 분해하는 미생물을 분리하기 위해 토양, 갯벌 및 해산 동물의 내장으로부터 채취한 샘플에서 미생물 분리를 실시하였다.
채취해온 샘플을 250㎖ 플라스크의 다시마 첨가 배지(NH4Cl 0.1g/ℓ, 다시마 조각 1㎝×1㎝ 이하, pH 6.8)에 접종하여 8일간 37℃, 180rpm에서 진탕 배양한 후, 각각 0.8% 영양 배지(Nutreient broth, pH 6.8)에 1.5% 한천을 첨가한 고체 배지에 도말하였다. 배양된 각 미생물은 순수한 콜로니로 분리될 때까지 계속하여 새로운 고체 배지에 도말하여 각 균주를 최종 순수 분리하였다. 분리된 순수 균주는 4℃에 보관하면서 2주에 한 번씩 계대배양 하였다.
상기 분리된 순수 균주들에서 유용한 미생물들을 스크리닝하기 위하여, 다음의 두 가지 한천 배지에 상기 순수 균주들을 도말하였다.
ⅰ) 라미나린 분해 미생물들의 선별을 위한 한천 배지(Laminarin 1g/ℓ, MgSO4 0.1g/ℓ, NaCl 0.1g/ℓ, CaCl2 0.1g/ℓ, (NH4)2SO4 2g/ℓ, KH2PO4 0.5g/ℓ, Mineral 0.5㎖, Vitamin 0.5㎖, pH 6.8)
ⅱ) 알긴산 분해 미생물들의 선별을 위한 한천 배지(Alginate 1g/ℓ, Yeast extract 0.5g/ℓ, Peptone 0.5g/ℓ, (Mg4)2SO4 0.5g/ℓ, K2HPO4 0.5g/ℓ, pH 6.8)
그 결과, 알긴산 및 라미나린 한천 배지에서 순수 콜로니를 형성하는 6종의 균주를 확인하였고, 상기 분리된 6개 균주를 EJ1~EJ6으로 명명하였다.
실시예 2. 알긴산 및 라미나린 분해 능력 측정
실시예 1에서 분리한 상기 6종 균주들이 갈조류의 다당류 종류인 알긴산 및 라미나린을 분해할 수 있는 능력이 있음을 확인하기 위해 상기 분리된 6종 각 균주를 15㎖ 튜브 내의 8㎖ 라미나린 액체 배지에 접종한 다음, 37℃, 180rpm에서 8일간 진탕 배양을 하면서, 균주의 성장 곡선, 총 환원당과 pH를 측정하여 라미나린 분해능을 실험하였다.
또한, 라미나린 배지(Laminarin 0.1g/ℓ, MgSO4 0.1g/ℓ, NaCl 0.1g/ℓ, CaCl2 0.1g/ℓ, (NH4)2SO4 2g/ℓ, KH2PO4 0.5g/ℓ, Mineral 0.5㎖, Vitamin 0.5㎖, pH 6.8)와 알긴산 배지(Peptone 0.5g/ℓ, Sodium alginate 0.1g/ℓ, pH 6.8)에 1.5% 한천을 첨가한 고체 평판 배지의 중앙에 1일간 알긴산 및 라미나린 액체 배지에서 배양한 EJ1~EJ6의 각 균주 배양액 10㎕을 점적(drop)하여 건조시킨 후, 37 ℃ 배양기에서 배양하였다. 배지 위에 콜로니를 형성한 후, 라미나린 평판 배지에는 0.5%(w/v) 콩고레드 용액 10㎖을 투여하여 15분간 염색하고 나서 1M NaCl로 2회 탈색을 한 다음, 콩고레드 용액으로 인해서 붉게 염색된 평판배지 상의 콜로니 주변에 노란색의 환의 형성 유무 및 시간에 따른 환의 크기 변화를 관찰 하였다(Lee, D. S., et al ., Biotechnology letters , 17:355, 1995). 알긴산 평판 배지에는 10% 세틸피리니늄 클로라이드 모노하이트레이트(CPC, cetylpyridinium chloride monohydrate)를 10㎖ 투여하여 10분간 반응시킨 다음, 액을 제거한 후 증류수로 배지 표면을 수세하여 10% CPC에 의해서 불투명한 색으로 변한 배지 상에서 콜로니 주변의 투명환 형성 유무 및 크기의 변화를 관찰하였다(Peter, G., et al ., Amerian Society of Microbiology, 56:2265, 1990).
그 결과, 라미나린 액체 배지에서 가장 높은 분해능을 보인 균주가 EJ4임을 확인하였으며(도 1), 라미나린 및 알긴산 평판 배지에서 배양된 각 균주의 콜로니 주변에 환 생성 여부를 확인한 결과, 알긴산 평판 배지에는 EJ1, EJ4 및 EJ6 균주가, 라미나린 평판 배지에서는 EJ4 균주가 다른 균주들에 비해 상대적으로 높은 환을 형성하였다. 따라서 상기 분리한 종마다 알긴산 및 라미나린을 분해능의 차이가 있음을 확인할 수 있었다 (표1).
알긴산 및 라미나린 분해능 비교
다당류 기질 균주 환의 크기(cm)


알긴산		 EJ1 2.5
EJ2 0.0
EJ3 0.0
EJ4 1.9
EJ5 1.3
EJ6 2.8


라미나린		 EJ1 0.1
EJ2 0.4
EJ3 0.4
EJ4 1.8
EJ5 0.2
EJ6 0.4
실시예 3. 알긴산 및 라미나린 분해 미생물의 동정 및 기탁
본 발명의 실시예 1에서 분리한 EJ1~EJ6 각 균주를 그람 염색(Gram staining), 카탈라제 테스트, 콜로니 형태 및 현미경 검사를 통하여 일차적으로 동정하였다. 상기 6종의 각 균주는 영양 상태에서 활발한 운동성을 가지고, 모두 카탈라제 테스트에 양성을 나타내었다(표 2).
알긴산 및 라미나린 분해 미생물의 동정
미생물 특징
셀 모양 콜로니 색 그람 염색 내성 포자 생성 여부 카탈라아제 테스트
EJ1 L: 1~2㎛, W: 1~1.5㎛ 흰색 + + +
EJ2 L: 1~2㎛, W: 0.5~1.5㎛ 옅은 노란색 - - +
EJ3 L: 2~4㎛, W: 0.4~0.7㎛ 옅은 노란색 - - +
EJ4 L: 0.1~1.5㎛, W: 0.5~1㎛ 노란색 + - +
EJ5 L: 3~5㎛, W: 1~1.5㎛ 베이지색 + + +
EJ6 L: 1~2㎛, W: 0.5~1㎛ 흰색 + + +
이차 동정은 16S rRNA(16S rRNA coding gene) 염기서열에 기초한 분자계통분류학적 방법으로 수행하였다. 각 균주의 염색체 DNA는 AccuPrep 염색체 DNA 추출 킷트(바이오니아, 한국)를 사용하여 분리하였으며, 분리된 DNA를 주형으로 하여 5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3'(서열번호 1) 및 5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'(서열번호 2)의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다.
PCR 과정 중 초기 변형은 95℃에서 5분간 실행하였고, 30 싸이클 증폭은 95℃에서 10초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 30초간 이루어졌으며, 최종 신장단계는 72℃에서 7분간 수행하였다. PCR 수행결과, 각각의 균주에서 약 1500bp 크기 단편의 16S-rRNA 유전자가 증폭되었다.
증폭된 PCR product는 (주)마크로젠에 16S-rRNA sequencing 분석을 의뢰한 후, 각 균주들의 16S-rRNA 부분 서열(서열번호 3~8)을 확인하고, BioEdit Sequence Alignment Editor(ver. 5.0.9, Hall, T., Nucleic Acids Symposium Series, 41:95, 1999)를 이용하여 GenBank의 Advanced BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 상동성 검색을 수행하였다(Altschul et al., Nucleic Acids Res ., 25:3389, 1997).
그 결과, EJ1은 바실러스 메가테리움, EJ2는 판토아 에글로메란스, EJ3은 스테노트로포모나스 테레, EJ4는 마이크로박테리움 옥시단스, EJ5는 바실러스 바타비엔시스, EJ6은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스로 동정되었다 (표 3).
알긴산 및 라미나린 분해 미생물의 동정
미생물 16S-rDNA
크기		 GenBank
Accession No.		 균주명 상동성
EJ1 1670 bp GU252120.1 Bacillus megaterium 98%
EJ2 1668 bp AM184214.1 Pantoea agglomerans 98%
EJ3 1669 bp NR_042569.1 Stenotrophomonas terrae 99%
EJ4 1429 bp HQ113206.1 Microbacterium oxydans 98%
EJ5 1671 bp NR_036766.1 Bacillus bataviensis 99%
EJ6 1461 bp GQ340479.1 Bacillus amyloliquefaciens 99%
상기의 표 2과 같이 동정 된 복합미생물은 2012년 2월 7일자로 한국농업미생물자원센터에 기탁하였다(기탁번호: KACC 91706P).
실시예 4: 분리 6종 균주 상호간의 길항작용 측정
본 발명의 실시예 1에서 분리한 6개의 순수 균주 중에서 서로에 대한 길항물질을 생산하는지 여부를 확인하기 위하여 알긴산 및 라미나린 고체 배지에 서로 교차 되도록 도말하여 37℃에서 2일 동안 배양하였다.
그 결과, 분리된 6종의 균주 각각은 다른 균주와 상호 간 길항물질을 생산하지 않음을 확인하였다 (도 2).
실시예 5. 복합미생물에 의한 알긴산 및 라미나린 분해반응 측정
본 발명의 실시예에서 분리한 상기의 6종의 균주의 복합미생물을 이용하여 알긴산 및 라미나린을 분해하여 유용물질을 생산하는 반응특성을 확인하였다.
이후의 실시예에서 사용한 6종 균주의 복합미생물은 실시예 3에서 동정된 6종의 균주를 동량으로 혼합한 것으로, 6종 균주를 각각 0.1% 라미나린 액체 배지에 배양하여 대수 증식기가 끝났을 때 원심분리로 각 균주들 수확한 후, 혼합하여 사용하였다.
40㎖ 라미나린 액체 배지가 담긴 100㎖ 플라스크를 사용하여, 상기 6종 균주를 같은 양으로 각각 1:1 비율로 총 80㎍(wet cell)을 플라스크 내로 접종하여 37℃, 180rpm에서 15일간 분해 반응을 수행하였다. 상기와 같이 생물분해 반응을 수행하는 동안 3일 간격으로 플라스크 내의 샘플을 채취하여 분해반응의 특성을 분석하였다. 분해반응 동안 배양 배지 내의 pH 변화는 pH meter (이스텍, 한국)를 이용해 측정하였으며, 미생물의 농도는 3배로 희석한 샘플을 큐벳에 담은 후, 분광광도계(한빛 나노 바이오테크, 한국)를 이용하여 특정 파장(375nm)에서 측정하였다. 분해 반응에서 생성되는 총 환원당 (Total reducing sugars) 농도는 배양액을 원심 분리(70,00rpm, 10분) 한 상등액 100㎕와 1㎖ DNS(3.5-dinitrosalicylic acid) 용액을 vortex를 이용하여 균일하게 혼합한 다음, 끓는 물에서 10분간 반응 시키고, 5분간 냉수에서 식힌 다음, 분광광도계를 이용하여 570nm 파장에서, 글루코오스(glucose)를 대조군로 한 표준곡선(standard curve)에 의하여 그 값을 측정하였다.
상기 라미나린 분해반응 결과 생성되는 글루코오스 및 다른 올리고당의 농도는 Sugar-pakTM1(Waters,6.5×300㎜) 컬럼을 사용한 HPLC/RID(Agilent Technologies 1200 series, 미국)를 통해 분석하였다. 분석용 용매는 0.8㎖/min 유속의 물을 사용하였으며, 디텍터와 오븐 온도는 각각 35℃와 80℃로 설정하여 분석하였다.
또한, 상기의 실시예 2와 같이, 분리 6종의 균주가 혼합된 복합 미생물을 6일간 배양한 후 라미나린 및 알긴산 평판 배지에서의 환 생성 여부를 확인하였다.
그 결과, 복합미생물을 이용한 라미나린의 분해 결과, 배양 초기 6.8 이었던 pH는 점점 감소하여 배양 15일의 최종 pH 값은 4.17 이였다. 라미나린이 분해되면 환원당으로 글루코오스 외에 올리고당과 같은 중간대사산물이 생성될 수 있음을 알 수 있었으며, 생성된 총 환원당과 글루코오스 농도는 각각 6.14g/ℓ 및 3.39g/ℓ이었다 (도 3b). 이에 비해, 가장 라미나린 분해능력이 뛰어난 EJ4 단일 균주의 분해반응 결과에서는 총 환원당과 글루코오스 농도가 각각 4.23g/ℓ 및 2.23g/ℓ로 생산되었다 (도 3a). 따라서 EJ4 단일 균주보다 복합미생물을 사용하면, 총 환원당은 1.45배, 글루코오스는 1.71배 더 생산함을 확인하였으며,알긴산 및 라미나린 평판배지에서의 단일 균주에 의한 결과와 비교해 보면, 6종의 균주 상호 간의 상조작용(synergism)으로 이들이 혼합된 복합미생물이 더 뛰어난 알긴산 및 라미나린 분해 능력이 있음을 확인하였다 (도 4 및 도 5).
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
농업생명공학연구원 KACC91706P 20120207
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 알긴산 및 라미나린을 분해할 수 있는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 판토아 에글로메란스(Pantoea agglomerans), 스테노트로포모나스 테레(Stenotrophomonas terrae), 마이크로박테리움 옥시단스(Microbacterium oxydans), 바실러스 바타비엔시스(Bacillus bataviensis) 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)로 구성되고, 기탁번호 KACC 91706P로 기탁된 것을 특징으로 하는 복합 미생물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 알긴산 및 라미나린은 갈조류 가공 및 추출 공정의 부산물인 것을 특징으로 하는 복합 미생물.
  4. 제1항 또는 제3항의 복합 미생물을 이용하여 갈조류 가공 및 추출공정의 부산물을 분해하는 방법.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040105523A (ko) * 2003-06-07 2004-12-16 박응렬 갈조류로 부터 생리활성물질 연속추출 및 기능성 식품제조
KR20050096450A (ko) * 2004-03-30 2005-10-06 배태진 다시마, 미역 분해능을 지닌 신규 마이크로박테리움 속 균주 와 그 효소
KR20100087959A (ko) * 2009-01-29 2010-08-06 기장물산 (주) 알긴산 분해 효소를 생산하는 신규 미생물, 바실러스 에스피 ｎ7151－ｂ

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