CN107841478B - 一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用，属于微生物及废水治理领域。本发明菌株为芽孢杆菌HM01（Bacillus sp. HM01），其保藏编号为CCTCC NO：M 2017558。该菌株能够脱色降解多种活性染料并作为生长所需氮源，且够避免染料降解过程中硝态氮的积累所造成的氮素污染，可用于含多种活性染料的印染废水处理，pH适应范围广，具有很好的理论研究价值和生产应用前景。

Description

一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及废水治理领域，具体涉及一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术
人工合成的染料品种繁多、结构复杂、化学稳定性好，生物可降解性差，是纺织工业和染料生产废水中的主要污染物，所造成的环境污染治理一直是工业废水治理的难点。自从1956年活性染料问世以来，经过近60年的迅速发展已逐步取代硫化染料、还原染料、直接染料和冰染染料，成为纤维素纤维(包括棉、亚麻、人造丝等)印染的主要原料。然而在利用活性染料染色过程中，有约30％的活性染料不能有效利用而进入废水中，因此，对活性染料废水的脱色逐渐成为人们关注的热点话题。目前对印染废水处理的方法主要有物理法、化学法和生物法。其中物理化学法使用方便、见效快，但处理成本高、产生大量难处理污泥、容易引起二次污染。生物脱色降解法主要利用环境微生物对染料在脱色、降解方面的巨大潜能，通过驯化、分离筛选高效脱色降解功能菌株，具有成本低、效率高、环境友好、无二次污染等特点，在废水处理中具有明显的优势，并成为研究的热点。但从印染废水污染等极端环境中分离得到高效脱色降解功能菌株并开展应用研究一直是研究的热点。
发明内容
本发明的目的在于解决目前普遍使用活性染料所造成的印染废水有机物含量高、成分复杂、降解菌株功能单一、降解不彻底等问题，提供一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株，为芽孢杆菌HM01(Bacillussp.HM01)。该菌株于2017年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017558。
所述HM01菌株能够脱色降解多种活性染料，这些活性染料包括活性黑、活性翠兰、活性艳兰、活性藏青、活性红、活性橙、活性嫩黄。因此，HM01菌株可用于活性染料的脱色降解以及印染废水的治理中。HM01菌株在降解染料过程中伴随着高效脱氮反硝化过程，能够避免染料降解过程中硝态氮的积累所造成的氮素污染，具有很好的生产应用价值。
所述HM01菌株对活性染料的最佳脱色降解条件为35-40℃、pH 7.0。
在实际应用中，HM01菌株在LBD合成培养基扩大培养获得种子液，可按种子液:印染废水＝1:5000(V/V)的比例将种子液投放到印染废水中进行治理。LBD合成培养基的组成为：1L LB培养基+10mL浓度为30mg/L的活性染料(优选为活性藏青)，以诱导HM01菌株胞外酶的合成，保持高效广谱降解能力。
本发明具有如下优点和有益效果：
(1)HM01菌株24h能完全降解20mg/L的活性藏青染料。浓度低于100mg/L时，HM01菌株对活性藏青的降解率均超过90％。
(2)HM01菌株降解活性藏青染料pH在5.0-8.0范围内，HM01菌株24h对60mg/L的活性藏青脱色降解率均超过50％；pH在6.0-8.0区间，脱色率均超过80％；pH接近中性时脱色率达到92％，脱色效果最好。HM01菌株在实际应用过程中具有较好的pH值范围，可减少pH调节步骤，降低废水处理成本。
(3)HM01菌株能降解多种活性染料并作为生长所需氮源，可用于含多种活性染料的印染废水处理，且不会造成氮素污染，具有很好的理论研究价值和生产应用前景。
附图说明
图1是HM01菌株的SEM形态观察图。
图2是HM01菌株16S rDNA系统进化分析图。
图3是HM01菌株降解活性藏青的UV-Vis光谱扫描分析图。
图4是活性藏青染料降解液中硝态氮浓度的变化图。
图5是温度对HM01菌株降解活性藏青染料的影响结果图。
图6是pH对HM01菌株降解活性藏青染料的影响结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1HM01菌株的分离、筛选与鉴定
(1)培养基的配制
无机盐培养基：KH2PO4 0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，NaCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，1L培养基中添加微量元素溶液1.5mL(郑永良,钟玉林,徐红,等.染料脱色菌株的筛选及其特性研究[J].华中师范大学学报：自然科学版,2008,03期(3):444-447)。其中，微量元素溶液的组成为：CuSO4·5H2O 4.0g/L，FeSO4·7H2O 0.7g/L，FeCl3·6H2O 7.0g/L，CoCl3·6H2O 0.2g/L，NaMO4·2H2O 3.4g/L，CaCl2·2H2O 2.0g/L。
LB培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
合成培养基：在无机盐培养基中添加50g/L的葡萄糖作为碳源，以不同浓度的染料作为氮源。
培养基调pH值为7.0左右；固体培养基加琼脂15.0g/L；所有培养基于121℃、1.05kg/cm2蒸汽压下灭菌，备用。
(2)脱色菌的分离与筛选
从黄冈市某印染厂生化处理池中取活性污泥10g，加100mL无菌水搅匀，取上清液10mL加入含合成培养基的三角瓶(250mL)中，再加入活性藏青染料使其终浓度为20mg/L，并加入2％的LB培养基以促进菌体生长，定容至100mL。于30℃、150rpm揺床条件下驯化培养3d后按10％的接种量接种于合成培养基中再富集3次，每次5d，染料浓度逐步提高为40、80、120mg/L。取最后一次富集培养液，经梯度稀释后，涂布于含120mg/L活性藏青染料的合成培养基固体平板，37℃培养3d，取菌株周围染料被完全脱色的单菌落于LB液体培养基中活化，并经数次纯化后得到脱色菌，将其命名为HM01。
(3)HM01菌株的鉴定
HM01菌株形态特征及生理生化鉴定依据文献(东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京，科学出版社。2001.95-96)进行。HM01菌株在LB固体培养基上菌落呈圆形，淡黄色，菌落平均直径约1cm，革兰氏染色呈阳性，为需氧或兼性厌氧菌。通过扫描电镜观察，该菌株呈椭球状或球状，无鞭毛，无芽胞(图1)。生理生化鉴定试验结果表明，HM01菌株能利用果糖、乳糖等多种糖类，但不能利用蜜二糖和阿拉伯糖，V-P反应为阳性，精氨酸双水解酶阴性，水解尿素(表1)。
表1HM01菌株生理生化鉴定结果
Figure BDA0001513252540000031
提取HM01菌株基因组DNA，以基因组DNA为模板通过PCR扩增16S rDNA基因，测序(序列见SEQ ID NO.1)后用BLAST软件在线检索分析，利用MEGA5.1软件构建系统进化树(图2)。结果表明，HM01菌株与芽孢杆菌Bacillus subtilis L7菌株的同源性为100.0％，结合形态观察和生理生化试验，HM01菌株鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)，命名为芽孢杆菌HM01(Bacillus sp.HM01)。
HM01菌株于2017年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：M 2017558。
实施例2HM01菌株脱色、脱氮的研究
(1)脱色、脱氮能力的测定
将HM01菌株接种于LB培养基中30℃、150rpm揺床条件下过夜培养，4000rpm离心后去上清，并以等体积磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后得种子液，按10％接种量接种于含20mg/L活性藏青染料的合成培养基中，于35℃条件下静置培养，定时取样于4℃保存待测。
1)取10mL待测样品于离心管中，4000rpm离心10min并收集上层离心液，离心管中菌体再以等体积无菌水重悬后，以600nm处的光吸收值计算菌体生长量。上层离心液采用紫外-可见分光光度法(UV-Vis)进行全波段光谱扫描分析(Varian cary 100,USA)，确定染料的最大吸收峰波长λmax以及降解过程是否生成有吸收峰的中间产物。根据公式(1)计算脱色率，以脱色率η表征HM01菌株对染料的脱色降解能力。
η＝(A0-At)/A0×100％(1)
HM01菌株在含20mg/L活性藏青染料的合成培养基中，35℃条件下静置培养，24h内对20mg/L的活性藏青完全脱色。动态扫描结果显示，活性藏青在596nm有较强吸收峰，随着HM01菌株对染料的脱色降解，吸收峰逐渐降低，24h吸收峰完全消失，并且没有其它吸收峰产生(图3)，表明HM01菌株对活性藏青有较强的脱色降解效能，是一株有很好的研究价值和应用前景的染料脱色功能菌株。
2)取待测样品，以硝态氮(硝酸根NO3 -和亚硝酸根NO2 -)的去除率计算脱氮能力。
磺酸Brucine法检测硝酸根(APHA.Standard methods for the examination ofwater and wastewater.Washington[M],DC,USA:American Public Health Association,1995.)：取1.5mL待测样品，8000rpm室温离心5min；取上清50μL，加入50μL 4％的二甲氧基马钱子碱(用氯仿溶V:M)，振荡混匀，室温放置5min；加入500μL 80％的H2SO4，振荡混匀，避光反应10min；加水定容至4mL，用724型分光光度计检测OD410值。
甲基橙褪色光度法检测亚硝酸根(匡云飞,邓培红,冯泳兰，等.甲基橙褪色光度法测定亚硝酸根的研究[J].化学世界,2004,4:181-182.)：取1.5mL待测样品，8000rpm室温离心5min；取上清500uL，加入300μL甲基橙(2.5×10-4mol/L)和250μL 1mol/L H2SO4；加水定容至4mL，室温反应10min，用724型分光光度计测OD506值。
结果显示，HM01菌株在降解活性藏青染料过程中能产生一定浓度的硝态氮，主要包括NO2 -和NO3 -。从图4可以看出，降解开始NO3 -浓度较高，随着反硝化的进行，NO3 -浓度逐渐降低，3h后，NO2 -逐渐升高，9h后NO3 -浓度有一定的升高，但在12h，染料降解液中NO2 -和NO3 -被完全利用，硝态氮去除率达到99％以上。表明HM01菌株在降解染料过程中伴随着高效脱氮反硝化过程，表现出很好的脱氮效能，避免了染料降解过程中硝态氮的积累所造成的氮素污染，具有很好的生产应用价值。
实施例3HM01菌株脱色最佳条件的研究
(1)温度对HM01菌株脱色降解的影响
在其它反应条件一定的情况下，以温度为单因素变量，分别设定温度条件为25、30、35、40、45和50℃。
菌株HM01接种于LB培养基中30℃、150rpm揺床条件下过夜培养，4000rpm离心后取上清，并以等体积磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后得种子液，按10％接种量接种于含60mg/L活性藏青染料的合成培养基中，在不同温度下静置培养24h，测定HM01菌株对染料的脱色降解情况。结果见图5，HM01菌株降解染料的适宜温度为35-40℃，在此温度区间，24h染料的平均降解率达到90％以上，最适温度为40℃。
(2)pH对HM01菌株脱色降解的影响
在其它反应条件一定的情况下，以pH为单因素变量，分别调节培养基的pH为4、5、6、7、8、9。
菌株HM01接种于LB培养基中30℃、150rpm揺床条件下过夜培养，4000rpm离心后取上清，并以等体积磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后得种子液，按10％接种量接种于含60mg/L活性藏青染料不同pH的合成培养基中，在35℃下静置培养24h，测定HM01菌株对染料的脱色降解情况。结果见图6，pH对HM01菌株降解活性藏青染料的影响较大，pH在5.0-8.0范围内，静置培养24h对60mg/L的活性藏青脱色降解率均超过50％；而pH在6.0-8.0区间，脱色率均超过80％；pH接近中性时脱色率达到92％，脱色效果最好。表明HM01菌株在实际应用过程中具有较好的pH值范围，可减少pH调节步骤，降低废水处理成本。
实施例4HM01菌株对染料脱色的广谱性研究
为了研究HM01菌株对染料脱色的广谱性，选取了以活性黑、活性翠兰、活性艳兰、活性藏青、活性红、活性橙、活性嫩黄等7种染料进行降解实验以确定菌株的广谱降解能力。
将HM01菌株接种于LB培养基中30℃、150rpm揺床条件下过夜培养，4000rpm离心后取上清，并以等体积磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后得种子液，按10％接种量接种于含30mg/L不同活性染料的合成培养基中，于35℃条件下静置培养24h后取样，并继续培养6d后再取样，通过分光光度法测定HM01菌株对不同染料的降解情况及降解率。
结果显示，24h后，HM01菌株对活性翠兰、活性艳兰和活性嫩黄降解率低于50％，而对活性藏青、活性红、活性黑、活性橙四种染料的降解率超过70％以上(表2)。6d后，HM01菌株对活性藏青、活性红、活性黑、活性橙、活性艳兰等染料降解率达到90％以上，对活性翠兰和活性嫩黄的降解也超过60％。其中，HM01菌株对活性艳兰的降解表现出底物适应和降解酶的诱导过程，降解率先慢后快，6d后达到92.1％。这些结果表明HM01菌株是一株活性染料高效广谱降解功能菌，可用于多种染料组成的印染废水处理。
表2HM01菌株对多种活性染料的降解能力
Figure BDA0001513252540000061
Figure BDA0001513252540000071
实施例5HM01菌株与枯草芽孢杆菌降解活性染料的比较
为了对比研究HM01菌株与芽孢杆菌属中代表性菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，常规教学菌种，购自武汉大学中国典型培养物保藏中心CCTCC)对染料脱色降解的能力，选取活性藏青、活性橙、活性嫩黄等3种染料进行降解能力比较研究。
将HM01菌株和枯草芽孢杆菌分别接种于LB培养基中35℃、150rpm揺床培养过夜，4000rpm离心后取上清，并以等体积磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后得种子液，按10％接种量接种于含30mg/L上述3种不同活性染料的合成液体培养基中，于35℃、150rpm摇床培养24h后取样，通过分光光度法测定菌株的生长情况(OD600)及对不同染料的降解率。结果如下表3。
表3HM01菌株与枯草芽孢杆菌株对活性染料降解能力的比较
Figure BDA0001513252540000072
结果显示，HM01菌株比枯草芽孢杆菌有更强的活性染料降解能力，菌体降解3种受试活性染料，并以其作为生长需要的氮源，染料降解率越高，菌体生长越好。枯草芽孢杆菌仅对活性橙有一定的降解作用(降解率54.2％)，对其它2种染料基本不降解，且菌体生长较差。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 黄冈师范学院
<120> 一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1391
<212> DNA
<213> Bacillus sp. HM01
<400> 1
gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 60
gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt 120
ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 180
ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 240
agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 300
tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 360
ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa tagggcggca 420
ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 480
gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa 540
gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 600
tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 660
caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 720
agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 780
ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 840
tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900
ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag 960
ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1020
cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt 1080
cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140
aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc 1200
agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 1260
caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1320
acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1380
cggtgaggta a 1391

Claims (6)

1.一种活性染料高效广谱脱色降解的芽孢杆菌（Bacillus sp.）菌株HM01，其特征在于：所述菌株HM01的保藏编号为CCTCC NO：M 2017558。
2.权利要求1所述的菌株HM01在活性染料脱色降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的活性染料包括活性黑、活性翠兰、活性艳兰、活性藏青、活性红、活性橙和/或活性嫩黄。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述菌株HM01对活性染料脱色降解条件为35-40℃、pH 7.0。
5.权利要求1所述的菌株HM01在印染废水治理中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：菌株 HM01在LBD合成培养基扩大培养获得种子液，按种子液:印染废水=1:5000体积比将种子液投放到印染废水中进行治理；其中LBD合成培养基的组成为：1L LB培养基+10mL浓度为30mg/L的活性染料；所述的活性染料包括活性黑、活性翠兰、活性艳兰、活性藏青、活性红、活性橙和/或活性嫩黄。
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