CN108795795B - 一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂,所述复合菌剂由6株菌株在室外温度1℃‑6℃的环境下可以使玉米秸秆腐熟天数提高2‑3天,特别适合北方地区。复合菌处理的玉米秸秆喂养奶牛后,平均产奶量与对照组相比增加了8.9kg,奶牛粪便中粗纤维含量降低了3.4%,平均日采食量提高了2.3kg,由于添加了降解木质纤维素的复合菌,以及其中包含大量的乳酸菌,使玉米秸秆的质地柔软并有酸香气,适口性明显提高,增加了家畜的食欲。同时乳酸菌能促进动物生长,调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡,从而改善胃肠道功能,提高食物消化率和生物效价,降低血清胆固醇,控制内毒素,抑制肠道内腐败菌生长,提高机体免疫力等效果,进一步使日产量增加。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物领域,具体涉及一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂及其应用。
背景技术
随着农作物单产提高,秸秆总量迅速增加,广大农民为赶农时、抢播种、图省事,多数地区就开始集中出现秸秆焚烧现象,农作物秸秆的处理问题一直是令广大农民和各级政府倍感头疼的问题,过去由于开发利用技术的缺乏、市场信息闭塞以及农民秋耕播种时间短暂等原因,绝大多数秸秆被废弃于河道、路旁腐烂或在田间被直接焚毁,不但堵塞河道和道路交通而且严重污染了环境并造成资源的巨大浪费。
近年来,随着木质纤维素生物降解研究的不断深入,生物降解过程中各种微生物间的协同关系也逐渐受到人们的重视。研究表明,木质纤维素降解复合菌系的稳定性需要靠不同种类的微生物,包括具有纤维素降解能力的菌株和不具有纤维素降解能力的菌株间的相互作用来维持,从而充分利用微生物间的协同关系。因此,直接从自然界筛选出木质纤维素降解复合菌系成为现今新的研究热点。然而,目前所报道的复合菌系大多是在高温条件下表现出木质纤维素降解能力或需要对降解原料进行化学预处理,这些处理在一定程度上
操作要求较高,耗能较多。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂,通过低温驯化得到6株菌株,按一定质量比混合而成,尤其适合北方低温天气,对腐熟玉米秸秆效果优异。
一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂,其特征在于:该复合菌剂含有6株菌株并按一定质量比混合,产纤维素酶类芽孢杆菌20%、产木聚糖酶链格孢菌15%、产漆酶疣孢漆斑菌20%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10%、乳酸菌25%,
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312;
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917;
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16;
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)
CCTCC AA 208050Laceyella;
所述乳酸菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 1.3701;
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901,是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的,其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏地址:中国武汉武汉大学,保藏日期是2017年7月5日,保藏号是CCTCCNO:M2017413。
一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂,是通过以下技术路线实现:富集培养各菌株、低温降解纤维素复合菌系的筛选及驯化、复合菌剂的混合、复合菌剂对秸秆的降解。
更具体地,将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、乳酸菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL。将菌液按照以下质量比混合:产纤维素酶类芽孢杆菌20%、产木聚糖酶链格孢菌15%、产漆酶疣孢漆斑菌20%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10%、乳酸菌25%,进行充分搅拌混合获得混合菌液。
上述复合菌在降解秸秆中的应用。
本发明获得的有益效果:
本发明的所提供的一种含乳酸菌的低温降解秸秆复合菌剂,所述复合菌剂由6株菌株在室外温度1℃-6℃的环境下可以使玉米秸秆腐熟天数提高2-3天,特别适合北方地区。同时本发明的复合菌剂也可应用于玉米秸秆饲料的添加作预发酵处理,复合菌处理的玉米秸秆喂养奶牛后,平均产奶量与对照组相比增加了8.9kg,奶牛粪便中粗纤维含量降低了3.4%,平均日采食量提高了2.3kg,由于添加了降解木质纤维素的复合菌,以及其中包含大量的乳酸菌,使玉米秸秆的质地柔软并有酸香气,适口性明显提高,增加了家畜的食欲。同时乳酸菌能促进动物生长,调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡,从而改善胃肠道功能,提高食物消化率和生物效价,降低血清胆固醇,控制内毒素,抑制肠道内腐败菌生长,提高机体免疫力等效果,进一步使日产量增加。
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤,常规方法在PDA培养基上培养,菌株菌丝起初呈现白色絮状,向外周发散生长,菌落近似不规则圆形,在平板上生长5d后有分生孢子座出现,分生孢子最初呈现墨绿色,培养8d后,分生孢子颜色继续加深,并出现胶點团;培养10d后,菌落呈同心轮纹状,分生孢子胶點团呈现黑色,菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块,接种到苯胺蓝选择培养基上,于需氧培养箱中30℃条件下培养10d,观察苯胺蓝褪色情况,挑选褪色速率快,能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株,设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基,通过单一碳源的限定,测定木质素的去除率,选择在木质素培养基中涨势良好,且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序,鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法,用疣孢漆斑菌T2901 制备孢子悬浊液。而后进行稀释,调整孢子浓度为107/mL,取10μL稀释好的菌悬液滴于 ARTP的载片上,进行诱变,用ARTP诱变育种系统4mm射距照射,最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4%加入PDA培养基中)上,于需氧培养箱中30℃条件下培养10d,观察变色圈情况,挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50%,经多次传代培养,菌株T2901可稳定遗传。
实施例2菌株的低温驯化
(1)富集培养菌株
将菌株接种到盛有150mL PDA培养基的三角瓶中,加入大小均为长度5cm,宽度2cm的滤纸片,30℃恒温震荡培养1h混匀,并将上清液做10-1-10-9稀释,各取1mL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的PDA培养基里,28℃静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的材料。PDA培养基:马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂15g/L,富集培养4代。
(2)低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化
采用滤纸崩解法,上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系,初始培养温度为28℃,在该温度下继代培养4代,选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短,pH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2℃,直至培养温度降低至4℃,通过观察滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力,传代的同时挑选出降解能力保持较好的培养物,在驯化过程中,在8℃温度条件下连续培养8代,滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。
经过初步的低温驯化,结果在4℃条件下,得到的6株菌生长较好,说明其能够在低温条件正常生长。
该6株菌株为:产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、乳酸菌,
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)CGMCC 1.15312;
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola)CGMCC 3.2917;
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM 1.16;
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis)CCTCC AA208050Laceyella;
所述乳酸菌(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC 1.3701;
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901,是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的,其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,保藏日期是2017年7月5日,保藏号是CCTCC NO:M2017413。
实施例3复合菌剂的制备
将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、乳酸菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL。
将菌液按照以下质量比混合:产纤维素酶类芽孢杆菌20%、产木聚糖酶链格孢菌15%、产漆酶疣孢漆斑菌20%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10%、乳酸菌25%,进行充分搅拌混合获得混合菌液。
实施例4秸秆的降解
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中,昼夜温度为1℃-6℃,将玉米秸秆收获后将秸秆铺于实验田中,添加本发明复合菌剂,实验田按照每亩施用1.6kg实施例1制备的菌剂,对照组则不用秸秆发酵复合菌剂,然后灌水,观察秸秆腐熟,变化情况:
表1不同处理的秸秆腐熟情况
结果表明,与未添加复合菌剂相比,复合菌剂能将秸秆降解腐熟时间提前到8-9天,即使在 1℃到6℃的低温天气也能使秸秆有效腐熟,十分适合北方天气。
实施例5复合菌发酵玉米秸秆饲料
将新鲜收获的玉米秸秆,细碎至1-3cm长,以0.5%的比例接入复合菌剂搅拌混匀,得到初级发酵饲料,复合菌剂的制备见实施例3,发酵温度为6℃,发酵天数为4天,对照组不加复合菌剂直接堆放4天。将发酵饲料用于奶牛喂养,选用体重上下相差不超过1kg,且平均日产奶量相差不超过0.1kg在同一泌乳期的奶牛。观察每组奶牛的平均日采食量、粪便中未消化物的百分含量,以及平均日产奶量,对照组以未经发酵的普通精饲料喂养,结果如表2:
表2
日采食量/kg | 粪便中未消化物的粗纤维 | 日产奶量/kg | |
复合菌组 | 12.9 | 7.80% | 39.2 |
对照组 | 10.6 | 11.20% | 31.3 |
添加复合菌处理的秸秆喂养奶牛后,平均产奶量与对照组相比增加了8.9kg,奶牛粪便中粗纤维含量降低了3.4%,平均日采食量提高了2.3kg,由于添加了降解木质纤维素的复合菌,以及其中包含大量的乳酸菌,使玉米秸秆的质地柔软并有酸香气,适口性明显提高,增加了家畜的食欲。同时乳酸菌能促进动物生长,调节胃肠道正常菌群、维持微生态平衡,从而改善胃肠道功能,提高食物消化率和生物效价,降低血清胆固醇,控制内毒素,抑制肠道内腐败菌生长,提高机体免疫力等效果,进一步使日产量增加。
Claims (2)
1.一种含乳酸菌的低温高效降解秸秆复合菌剂,其特征在于,所述复合菌剂由以下质量百分比的原料混合制备而成:产纤维素酶类芽孢杆菌20%、产木聚糖酶链格孢菌15%、产漆酶疣孢漆斑菌20%、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10%、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10%、乳酸菌25%。
2.如权利要求1所述的复合菌剂,其特征在于:
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus) CGMCC 1.15312;
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria humicola )CGMCC 3.2917;
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)GIM1.16;
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella tengchongensis )CCTCC AA 208050Laceyella;
所述乳酸菌(Saccharomyces cerevisiae) CGMCC 1.3701 ;
所述产漆酶疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)突变菌株T2901,保藏号是CCTCCNO:M2017413。
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