CN101463384A - 一种真菌的筛选方法以及采用该菌种生产纤维素酶的方法 - Google Patents

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王靖
安明泉
刘洁丽
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Abstract

本发明涉及一种真菌的筛选方法以及采用该菌种生产纤维素酶的方法。菌种培养方法：将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20－30℃培养40－60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上20－40℃培养48－72小时并保存于4℃冰箱；将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，20－40℃培养48－72小时，并保存于4℃冰箱。本发明还公开一种采用该菌种生产纤维素酶的方法。

Description

一种真菌的筛选方法以及采用该菌种生产纤维素酶的方法
技术领域
本发明涉及一种真菌及应用该菌种生产纤维素酶(包括CMC酶、滤纸酶等)的方法。
背景技术
纤维素酶是一组能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸等工业领域有广泛的应用价值。自从1906年Seilliere从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，人们对纤维素酶做了大量的研究，特别是20世纪80年代以来，由于分子生物学的发展及生物工程技术的兴起，纤维素酶的研究出现了新的前景。大量的纤维素酶产生菌种被发现，包括真菌和细菌等。
Botryosphaeria dothidea是一种植物致病菌，能够导致苹果等许多水果的腐烂，也用于印染行业的污水处理，未见有生产纤维素酶的报道。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是公开一种真菌的筛选培养方法。
本发明用于生产纤维素酶(包括CMC酶、滤纸酶等)的微生物是一种真菌Botryosphaeria dothidea，并按照菌种筛选分离的顺序命名为Botryosphaeriadothidea M12，该真菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。
本发明需要解决的技术问题之二是公开一种以真菌Botryosphaeriadothidea M12生产纤维素酶(包括CMC酶、滤纸酶等)的方法。
1.该菌种具有如下的性质：
形态生理生化特征：
形态特征：丝状真菌，菌落呈白色，圆柱形菌丝体，不透明。
生理生化特征：产纤维素酶。
2.本发明提供了一种真菌的筛选培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20-30℃培养40-60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上20-40℃培养48-72小时并保存于4℃冰箱；
斜面保存培养基组成为：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO40.01；蔗糖30；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，20-40℃培养48-72小时，并保存于4℃冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为：NaNO3.2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纤维素钠10；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
对该真菌提取总DNA后，使用FTGENE5D型PCR仪在ITS4-ITS5区域PCR扩增，进行测序后得到如下序列：
CTTCAGTTTGGTTCCTACTGATCCGAGGTCACCTTAGAAAAATAAAGTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCGGGAGAGGGGGACGGGGGCCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTACGATAATCAACTCAGACTGCATACTTTCAGAACAGCGTTCATGTTGGGGTCTTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGGCGCAAGGCCTCCCCGGCGGCCGTCGAAACGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACTTTTTACTTCCC
测序所得序列经NCBI上BLAST(http://www.ncbi.nim.nih.gov)同源性检索和分析，得到GeneBank中与之亲缘关系最近的菌种Botryosphaeriadothidea，同源性达99％；
可确定该真菌为Botryosphaeria dothidea，并按照菌种筛选分离的顺序命名为Botryosphaeria dothidea M12，该真菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。
3.本发明利用Botryosphaeria dothidea M12制备纤维素酶的方法，其步骤顺序如下：
(1)斜面培养：将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，20-40℃条件下，摇床振荡培养48-72小时，制得种子液。其中液体富集培养基包括：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；蔗糖30；以上均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
(2)摇瓶培养：将种子液接种于液体产酶培养基中，20-40℃有氧条件下，摇床振荡培养48-120小时，制得发酵液；其中液体产酶培养基组成为：玉米皮纤维粉20；小麦麸皮浸出液5；蛋白胨1；碳酸钙5；吐温-802，以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
(3)粗酶液制备：取步骤(2)溶于Mandels无机营养盐液后的发酵液以5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶液；
其中Mandels无机营养盐液的组成为：KH2PO4 3.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；MnSO4·H2O 0.0025g/L；CaCl2 0.5g/L；CoCl2 0.003g/L；FeSO4·7H2O 0.0075g/L；尿素0.5g/L；MgSO4·5H2O 0.5g/L；ZnSO4·7H2O 0.002g/L；其余为去离子水。
4.酶活的测定方法
(1)纤维素酶活(CMC酶活)测定：取0.5mL稀释10倍的酶液，加入1.5mL0.625％CMC溶液，于50℃保温30min，加入2mL 10％的氢氧化钠溶液终止反应，再加入3mL DNS试剂，于沸水中煮15min，使用UV-2000型紫外可见分光光度计在550nm处比色。以酶液每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位IU。
(2)滤纸酶活力(FPA)的测定方法：取1mL稀释10倍的酶液，加入1mg滤纸条，再加入1mL柠檬酸缓冲溶液于55℃保温60min再加入3mL DNS试剂，于沸水中煮15min，使用UV-2000型紫外可见分光光度计在550nm处比色。以每分钟酶液产生1μmol还原糖所需的酶量为1个酶活单位IU。
(3)在上述方法中，DNS试剂的配制：取200g酒石酸钾钠溶于一定量的水中加热溶解后添加10.0g 3，5-二硝基水杨酸，10.0g氢氧化钠溶解后加入2.0g苯酚，0.5g无水亚硫酸钠，加热溶解后冷却至室温，定容至1000mL。用之前一周配制。
(4)葡萄糖标准曲线的绘制：用电子天平准确称取0.2750g葡萄糖，用蒸馏水溶解定容至250mL制成1.0mg/mL的葡萄糖标准溶液，取葡萄糖标准溶液5、10、15、20、25mL于50mL容量瓶中，稀释定容。取2mL配制好的溶液以蒸馏水作空白参比，分别加入1.5mLDNS试剂在100℃水浴锅中加热15min显色后，使用UV-2000型紫外可见分光光度计在554nm处测定吸光值，以吸光值为纵坐标，糖浓度为横坐标得到标准曲线或计算回归方程。葡萄糖标准曲线是所有的实施例所共用的，数据和曲线相同，见图1。
(5)酶活的结果计算：分别按照(1)、(2)的方法进行纤维素酶活和滤纸酶活的测定，在550nm处测得比色值，根据曲线拟合方程y＝0.7692x得到测定样品中的葡萄糖含量，由纤维素酶活和滤纸酶活的定义可得到最终的酶活数值。
附图说明
图1葡萄糖标准曲线的绘制
具体实施方式
实施例1：
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20℃培养40天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上，在THZ-C恒温振荡器中20℃培养72小时并保存于4℃冰箱；
斜面保存培养基组成为：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO40.01；蔗糖30；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，在THZ-C恒温振荡器中20℃培养72小时，并保存于4℃冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为：NaNO3 0.2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纤维素钠10；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
筛选后的菌株经分子生物学鉴定为Botryosphaeria dothidea；
斜面培养：将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，20℃条件下，在THZ-C恒温振荡器中振荡培养72小时，制得种子液。其中液体富集培养基包括：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；蔗糖30；以上均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
摇瓶培养：将种子液接种于液体产酶培养基中，20℃有氧条件下，在THZ-C恒温振荡器中振荡培养120小时，制得发酵液。其中液体产酶培养基组成为：玉米皮纤维粉20；小麦麸皮浸出液5；蛋白胨1；碳酸钙5；吐温-802，以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
粗酶液制备：取上步摇瓶培养的发酵液溶于Mandels无机营养盐液使用ALC PK121R型冷冻离心机以5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶液；
酶活测定结果：在该条件下获得的酶液其纤维素酶活(CMC酶活)为2.215IU/mL，滤纸酶活(FPA)为2.263IU/mL。
实施例2：
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，在THZ-C恒温振荡器中于25℃培养50天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上25℃培养56小时并保存于4℃冰箱；
斜面保存培养基组成为：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO40.01；蔗糖30；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，在THZ-C恒温振荡器中25℃培养56小时，并保存于4℃冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为：NaNO3 0.2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纤维素钠10；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
筛选后的菌株经分子生物学鉴定为Botryosphaeria dothidea，并命名为Botryosphaeria dothidea M12；
斜面培养：将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，在THZ-C恒温振荡器中25℃条件下振荡培养56小时，制得种子液。其中液体富集培养基包括：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；蔗糖30；以上均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
摇瓶培养：将种子液接种于液体产酶培养基中，在THZ-C恒温振荡器中25℃有氧条件下振荡培养72小时，制得发酵液。其中液体产酶培养基组成为：玉米皮纤维粉20；小麦麸皮浸出液5；蛋白胨1；碳酸钙5；吐温-802，以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
粗酶液制备：取上步摇瓶培养的发酵液溶于Mandels无机营养盐液，使用ALC PK121R型冷冻离心机5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶液；
酶活测定结果：在该条件下获得的酶液其纤维素酶活(CMC酶活)为3.407IU/mL，滤纸酶活(FPA)为4.039IU/mL。
实施例3：
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，在THZ-C恒温振荡器中40℃培养60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上40℃培养48小时并保存于4℃冰箱；
斜面保存培养基组成为：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO40.01；蔗糖30；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，在THZ-C恒温振荡器中20℃培养72小时，并保存于4℃冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为：NaNO3 0.2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纤维素钠10；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
筛选后的菌株经分子生物学鉴定为Botryosphaeria dothidea，并命名为Botryosphaeria dothidea M12；
斜面培养：将上述菌株于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，在THZ-C恒温振荡器中20℃条件下振荡培养72小时，制得种子液。其中液体富集培养基包括：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；蔗糖30；以上均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
摇瓶培养：将种子液接种于液体产酶培养基中，在THZ-C恒温振荡器中40℃有氧条件下，振荡培养48小时，制得发酵液。其中液体产酶培养基组成为：玉米皮纤维粉20；小麦麸皮浸出液5；蛋白胨1；碳酸钙5；吐温-802，以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
粗酶液制备：取上步摇瓶培养的发酵液溶于Mandels无机营养盐液，使用ALC PK121R型冷冻离心机5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶液；
酶活测定结果：在该条件下获得的酶液其纤维素酶活(CMC酶活)为3.166IU/mL，滤纸酶活(FPA)为3.058IU/mL。

Claims (2)

1.一种真菌Botryosphaeria dothidea M12的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
将没有完全腐烂的苹果切成小块置于密封容器中，于20-30℃培养40-60天，生成白色绒毛状菌体，挑取单菌落保存在斜面保存培养基上20-40℃培养48-72小时并保存于4℃冰箱；
斜面保存培养基组成为：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；蔗糖30；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
将冰箱保存的菌株无菌条件下用接种环接于纤维素降解菌固体筛选培养基，20-40℃培养48-72小时，并保存于4℃冰箱；
纤维素降解菌固体筛选培养基组成为：NaNO3 0.2；K2HPO41；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纤维素钠10；琼脂15-20；其余为去离子水，以上数据单位均为质量/体积比g/L，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
筛选后的菌株经分子生物学鉴定为Botryosphaeria dothidea，并命名为Botryosphaeria dothidea M12。
2.一种以Botryosphaeria dothidea M12菌为菌种生产纤维素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将筛选后的菌株Botryosphaeria dothidea M12于无菌条件下用接种环接于液体富集培养基中，20-40℃条件下，摇床振荡培养48-72小时，制得种子液；
其中液体富集培养基包括：NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；蔗糖30；以上数据均为质量/体积比g/L，溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
(2)摇瓶培养：以上述种子液和液体产酶培养基体积比为5％的接种量将种子液接种于液体产酶培养基中，20-40℃有氧条件下，摇床振荡培养48-120小时，制得发酵液；
其中液体产酶培养基组成为：玉米皮纤维粉20；小麦麸皮浸出液5；蛋白胨1；碳酸钙5；吐温-802，以上数据单位均为质量/体积比g/L，将发酵液溶于Mandels无机营养盐液，用盐酸调节pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃灭菌30分钟；
(3)粗酶液制备：取上述溶于Mandels无机营养盐液后的发酵液以5000-10000转/分钟离心3-5分钟收集上清液，得到粗酶液。
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