CN102115715A

CN102115715A - 一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基

Info

Publication number: CN102115715A
Application number: CN 200910113659
Authority: CN
Inventors: 黄俊生; 景晓辉; 吴伦英; 吴�琳; 区小玲; 薛玉潇; 朱利林; 杨腊英
Original assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Current assignee: CATAS Environment and Plant Protection Institute
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2011-07-06

Abstract

本发明公开了一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基，该培养基为一组组合物，其特征在于每1000ml水溶液含有下列组分的培养基马铃薯180～220g，五水硫酸铜0.4～0.6g，七水硫酸镁0.5～0.7g，磷酸二氢钾0.08～0.12g，琼脂18～20g，95％酒精溶液10～15ml，75％敌克松结晶粉2.5～3.0g，硫酸链霉素0.5～0.8g。本发明的培养基原料成分合理，香蕉枯萎病病原菌生长旺盛，形成白色菌落，菌落特征明显，菌落出现率高；培养基不经高压蒸汽灭菌即可直接倒制平板，培养皿洗净晾干后亦不需高压蒸汽灭菌，接种操作时不需无菌操作；原料易得，提高功效，节约成本。

Description

一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基

所属技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基。可用于香蕉组培苗苗期病原鉴定，亦可用于土壤中分离香蕉枯萎病原菌，在农业生产上具有实际意义。

背景技术

目前，香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporumf.sp.cubense(FOC)侵染引起的一种世界性土传维管束病害，近年来在我国香蕉主产区持续暴发，造成严重损失。香蕉枯萎病菌根据鉴别寄主的不同分为4个生理小种，其中4号生理小种几乎对所有香蕉栽培种均致病，严重威胁香蕉产业的可持续健康发展。迄今为止，还没有一种理想的药剂可以有效防治该病，因此加强香蕉枯萎病的检验检疫工作，寻找有效的防治方法，控制该病的蔓延和危害迫在眉睫，而研制出一种快速检测香蕉枯萎病菌的技术方法将为检验检疫提供有力的技术支持。土壤中存在着大量的微生物，所以从土壤中特异性分离某一微生物是非常困难的。选择性培养基必须具备极强的特异性选择能力，才有实际应用价值。香蕉枯萎病是一种毁灭性病害，为了控制其扩散蔓延，有必要研制出实用的早期快速检测技术，采取有效的防治措施，避免可能造成的重大经济损失。

关于尖孢镰刀菌的选择性培养基，国内外已有一些报道。虽然国内学者韩宝坤，杜艳华等，在植物病理学报，2001，31(4)公开了在非无菌操作下分离尖孢镰刀菌的培养基，但是，用于从土壤中计数尖孢镰刀菌时极易被杂菌污染，在非无菌操作不能从土壤中分离香蕉枯萎病菌的培养基，达不到大量、快速检测病原菌的目的；国外学者除把葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物作为镰刀菌生长的基本营养物质外，并添加许多微量元素，这些培养基的制作成本普遍偏高，需经高温灭菌，而且所有操作须在无菌条件下进行，这给大量快速检测病原菌带来不便，效果往往不太理想。

发明内容

基于上述原因，为了克服以上现有技术存在的不足，本发明专利提供一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基。

本发明的目的是提供一种不仅能在非无菌操作下从感病植物组织中分离尖孢镰刀菌，而且能较好的从土壤中分离香蕉枯萎病菌的培养基，从而达到大量、快速检测病原菌的目的。

本发明是采用以下技术方案实现的：

一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基，该培养基为一组组合物，其特征在于每1000ml水溶液含有下列组分的培养基：

马铃薯 180～220g，五水硫酸铜 0.4～0.6g，

七水硫酸镁 0.5～0.7g，磷酸二氢钾 0.08～0.12g，

琼脂 18～20g， 95％酒精溶液 10～15ml，

75％敌克松结晶粉 2.5～3.0g，硫酸链霉素 0.5～0.8g，

较佳地，该培养基为一组组合物，其特征在于每1000ml水溶液含有下列组分的培养基：

马铃薯 200g，五水硫酸铜 0.5g，

七水硫酸镁 0.6g，磷酸二氢钾 0.1g，

琼脂 19g， 95％酒精溶液 10ml，

75％敌克松结晶粉 3.0g，硫酸链霉素 0.75g，

本发明的培养基与其它常见分离培养基相比具有的优点是：本发明的培养基不但不需无菌操作，成分简单、而且检测率显著、抑菌效果好、病菌在其上生长快、菌落典型，是一种较为理想的选择性培养基。

具体的实施例

制备实施例一本实施例的培养基成分原料配比组成：

马铃薯 180g；五水硫酸铜 0.4g；七水硫酸镁 0.5g；

磷酸二氢钾 0.08g；琼脂 18g； 95％酒精溶液 10ml；

75％敌克松结晶粉 2.5g；硫酸链霉素 0.5g；水溶液 1000ml。

本实施例培养基的制备方法为：

1、取去皮马铃薯180g切成小块状置入锅中，向锅中加入700ml水溶液并熬煮20分钟，取滤液备用；

2、向步骤1制得的备用滤液中加入五水硫酸铜0.4g、七水硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾0.08g、琼脂18g煮溶，凉至45℃时分别加入95％酒精溶液10ml、75％敌克松结晶粉2.5g、硫酸链霉素0.5g，然后加入水溶液补足1000ml，调pH至5.8，搅拌均匀，直接倒平板，室温放置10分钟后成品。

制备实施例二本实施例的培养基成分原料配比组成：

马铃薯 200g；五水硫酸铜 0.5g；七水硫酸镁 0.6g；

磷酸二氢钾 0.1g；琼脂 19g； 95％酒精溶液 10ml；

75％敌克松结晶粉 2.8g；硫酸链霉素 0.75g；水溶液 1000ml。

本实施例培养基的制备方法为：

1、取去皮马铃薯200g切成小块状置入锅中，向锅中加入750ml水溶液并熬煮20分钟，取滤液备用；

2、向步骤1制得的备用滤液中加入五水硫酸铜0.5g、七水硫酸镁0.6g、磷酸二氢钾0.1g、琼脂19g煮溶，凉至45℃时分别加入95％酒精溶液10ml、75％敌克松结晶粉2.8g、硫酸链霉素0.75g，然后加入水溶液补足1000ml，调pH至5.8，搅拌均匀，直接倒培养皿，室温放置15分钟后成品。

制备实施例三本实施例的培养基成分原料配比组成：

马铃薯 220g；五水硫酸铜 0.6g；七水硫酸镁 0.7g；

磷酸二氢钾 0.12g；琼脂 20g； 95％酒精溶液 15ml；

75％敌克松结晶粉 3.0g；硫酸链霉素 0.8g；水溶液 1000ml。

本实施例培养基的制备方法为：

1、取去皮马铃薯220g切成小块状置入锅中，向锅中加入800ml水溶液并熬煮20分钟，取滤液备用；

2、取滤液加五水硫酸铜0.6g、七水硫酸镁0.7g、磷酸二氢钾0.12g、琼脂20g煮溶，凉至50℃时分别加入95％酒精溶液15ml、75％敌克松结晶粉3.0g、硫酸链霉素0.8g，然后加入溶液补足1000ml，调pH至5.8，搅拌均匀，直接倒平板或培养皿，室温放置20分钟后成品。

生物实施例

一.材料：香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporumf.sp.cubense(FOC)，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所实验室分离、鉴定和保存；

二.供验培养基：本发明的一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基(以下简称为本发明培养基)；

三.试验方法：

1、土样制备：在中国热带农业科学院环境与植物保护研究所细胞楼基地，用取土器在0～20cm的耕作层内随机多点取样。土样混合后在室内自然风干，并用制样粉碎机粉碎，过筛(筛孔直径2mm)，然后装入塑料袋保存在4～5℃恒温箱中备用。

2、检测方法：采用稀释平板法，称取10g土样溶于装有90mL水的250mL锥形管中，180rpm振荡20分钟，用10倍稀释法逐步稀释样品，涂布于本发明培养基上，26℃下培养3-5d，挑取与镰刀菌形态相似的菌落，在普通光学显微镜下检查是否有小型分子孢子及大型分生孢子。

3、本发明培养基特异性试验，设计七种处理：

①半敞口状态下将本发明培养基置于空气中放置10分钟；

②涂布0.1ml水于本发明培养基中；

③涂布0.1ml土壤悬浮液于本发明培养基中；

④涂布土壤悬浮液和香蕉枯萎病病原菌混合物于本发明培养基中；

⑤涂布0.1ml水和香蕉枯萎病病原菌混合物于本发明培养基中；

⑥点接感病香蕉组织于本发明培养基中；

⑦点接常见青霉、曲霉、黑根霉等主要污染菌于本发明培养基中。

26℃暗培养4-5d，观察本发明培养基是否长出白色菌落，并统计杂菌生长状况见表1。

表1本发明培养基特异性试验结果

分析与结论；从表1可以看出，处理①、②均无任何杂菌出现；处理③、④有少量杂菌；处理⑤、⑥无任何杂菌且平板可形成白色菌落，菌落出现率达100％；处理⑦长出较多杂菌。该实验结果说明本发明培养基具有较强的选择性，即便放置空气10分钟及涂布未灭菌的水，平板依旧无任何杂菌生成。

4、土壤中香蕉枯萎病菌回收率测定

将香蕉枯萎病菌菌株接种在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)平板培养基上，黑暗条件下，置26℃培养3-5d，用10ml无菌水冲洗镰刀菌孢子，调整孢子终浓度为10⁵个/ml。取4份灭菌的土样各10g，分别放入置于有90ml水的三角瓶中，添加适量FOC孢子液(10⁵个/ml)，使土样中FOC孢子数目分别达到1000个、500个、100个，每个浓度重复3次，以清水土壤接种作为对照。采用稀释平板法，利用本发明培养基测定土壤中的香蕉枯萎病菌回收率见表2。

表2土壤中香蕉枯萎病菌回收率的测定结果

注：表中数据为三次重复平均值。

分析与结论：从表2可以看出，本发明培养基对土壤中香蕉枯萎病菌回收率的测定结果表明，该培养基在接种100、500、1000个香蕉枯萎病菌孢子时，检测回收率分别达到92％、89.2％及87.4％。平均回收率达到89.5％，说明该培养基营养成分合理，适合从土壤中分离香蕉枯萎病菌。

综上所述，本发明培养基的显著特点是：①营养成分合理，香蕉枯萎病病原菌生长旺盛，形成白色菌落，菌落特征明显，菌落出现率高；②不经高压蒸汽灭菌即可直接倒制平板，培养皿洗净晾干后亦不需高压蒸汽灭菌，接种操作时不需无菌操作；③原料易得，成本低廉。该培养基可在非无菌操作下实现香蕉枯萎病菌的快速鉴定，可用于香蕉组培苗苗期病原鉴定，亦可用于土壤中分离香蕉枯萎病原菌，在农业生产上具有实际意义。

以上实施例具体说明本发明内容，但本发明并不局限于以上实施例，依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims

1.一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基，该培养基为一组组合物，其特征在于每1000ml水溶液含有下列组分的培养基：

马铃薯 180～220g，五水硫酸铜 0.4～0.6g，

七水硫酸镁 0.5～0.7g，磷酸二氢钾 0.08～0.12g，

琼脂 18～20g，95％酒精溶液 10～15ml，

75％敌克松结晶粉 2.5～3.0g，硫酸链霉素 0.5～0.8g。

2.根据权利要求1所述的一种香蕉枯萎病菌快速分离鉴定培养基，该培养基为一组组合物，其特征在于每1000ml水溶液含有下列组分的培养基：

马铃薯 200g，五水硫酸铜 0.5g，

七水硫酸镁 0.6g，磷酸二氢钾 0.1g，

琼脂 19g， 95％酒精溶液 10ml，

75％敌克松结晶粉 3.0g，硫酸链霉素 0.75g。