CN112608986A - 一种筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，本发明提供了一种筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法。本发明分别在堆肥的第一天、第二天，高温期的前一天和高温期的第一天对堆肥发酵的畜禽粪便进行取样，并利用高通量测序技术对样品测序，得到有效数据；基于有效数据进行数据分析，找到优势微生物。本发明利用高通量测序技术，通过对取样时间进行控制，在不同堆肥时期检测粪肥中细菌的16S rRNA和真菌的rDNA ITS，分析堆肥过程中细菌和真菌的多样性与丰度变化，探索堆肥过程中微生物群落组成变化规律，为筛选堆肥优势微生物、提高堆肥效果，并进一步提供发酵效果更好的发酵菌剂奠定基础。

Description

一种筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法

技术领域

本发明属于微生物领域，尤其涉及一种筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法。

背景技术

近年来，我国畜牧业正向着规模化、集约化、标准化和现代化方向发展，而集约化养殖过程中产生的大量粪尿正成为环境污染的源头和畜牧业可持续性发展的制约性因素。世界各国对于如何处理畜禽粪污提出了多种方案，我国也制定并出台了一系列标准和规范。对于畜禽粪便最常用的处理处置方式就是堆肥处理，它是实现畜禽粪便减量化、无害化、资源化的良好途径，它将畜禽粪便中不稳定的有机物转化为稳定的且具有农业肥效的经济产品，一举多得，但堆肥处理技术仍存在许多缺点，如生产周期长、堆肥腐熟化程度低、产品质量差等，其关键受制于堆肥微生物的种类及作用不清，堆肥时微生物的多样性变化不清，堆肥菌剂所用细菌、真菌搭配不合理。针对这一瓶颈问题，前人对堆肥过程中细菌和真菌种群的变化进行了研究，但受实验设备和技术的限制，大多采用实验室培养、分离、鉴定等方法，仅对粪肥中有限的细菌和真菌类别进行了分析。

高通量测序是指分析特定环境中微生物群体基因组成及功能、微生物群体的多样性与丰度，进而分析微生物与环境、微生物与宿主之间的关系。高通量测序无需分离纯培养微生物，较大地扩展了微生物资源的利用，为环境微生物群落的研究提供了有效工具；可以揭示或估计环境中真实的物种多样性和遗传多样性，挖掘具有应用价值的基因资源，应用于开发新的微生物活性物质。

发明内容

本发明的目的在于揭示畜禽粪便不同堆肥时期细菌和真菌多样性变化规律，筛选堆肥不同发酵时期的优势微生物，为研制能缩短堆肥时间、提高堆肥效果的发酵菌剂奠定基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法，包括如下步骤：

(1)分别在堆肥的第一天、第二天，高温期的前一天和高温期的第一天对堆肥发酵的畜禽粪便进行取样，得到各组样品；

(2)分别提取各组样品DNA进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行构建文库和测序，得到原始数据，对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据；

(3)基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析；

(4)基于OTUs聚类和物种分类分析结果进行Alpha多样性指数分析、样品间菌群丰度差异分析，找出各组样品的优势微生物。

优选的，所述高温期是指堆肥发酵温度达到55℃～65℃的时期。

优选的，所述畜禽粪便为牛粪。

优选的，所述Alpha多样性指数分析包括Shannon指数、Chao1指数、ACE指数和Coverage指数。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法，不依赖于微生物的分离培养，克服了传统的纯培养方法的技术限制，为研究和开发利用占微生物种类99％以上的未可培养的微生物提供了一种新的途径和良好的策略，通过克隆、异源表达来筛选有用基因及其产物，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其规律；可以得到环境中丰度较低的，甚至是痕量微生物的信息，为研究低丰度微生物提供了途径，对环境中微生物菌群的多样性、功能活性等宏观特征进行研究，可以更准确地反应出微生物生存的真实状态。

(2)本发明利用高通量测序技术，通过对取样时间进行控制，在不同堆肥时期检测粪肥中细菌的16S rRNA和真菌的rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer)，分析堆肥过程中细菌和真菌的多样性与丰度变化，探索堆肥过程中微生物群落组成变化规律，为筛选堆肥优势微生物、提高堆肥效果，并进一步提供发酵效果更好的发酵菌剂奠定基础。

附图说明

图1为实施例1发酵牛粪不同时期细菌和真菌的有效序列数量；

图2为实施例1发酵牛粪不同时期细菌和真菌的OTU丰度；

图3为实施例1牛粪发酵不同时期Chao指数稀释曲线；

图4为实施例1牛粪发酵不同时期shannon指数稀释曲线；

图5为实施例1细菌在门水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图6为实施例1真菌在门水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图7为实施例1细菌在目水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图8为实施例1真菌在目水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图9为实施例1细菌在科水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图10为实施例1真菌在科水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图11为实施例1细菌在属水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图12为实施例1真菌在属水平样品聚类树与柱状图组合分析图；

图13为实施例1在门水平93S和96GWS样品细菌差异比较误差线图；

图14为实施例1在门水平93S和96GWS样品真菌差异比较误差线图；

图15为实施例1在属水平93S和96GWS样品细菌差异比较误差线图；

图16为实施例1在属水平93S和96GWS样品真菌差异比较误差线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

本实施例以发酵牛粪为例。

(1)发酵牛粪取样：本实施例所用新鲜牛粪采于河北农业大学实验养牛场，干湿分离后，取干粪装到塑料箱(规格：长宽高为850mm×650mm×600mm)中，干粪的含水量为60％，在室内堆肥自然发酵，控制室内温度为20℃，每天测量堆温，在堆肥发酵的第4天正式进入高温期，总发酵时间为22天。本实施例在堆肥的第一天(93S)、第二天(94S)、高温期前一天(95S)和高温期第一天(96GWS)分别从同一堆体的4个部位取样，第一个取样点从堆肥的表面开始取，每向下15cm取一个样，取满4个样为止。将所取4个部位的样品混合均匀，得到4组样品，分别放置于无菌袋内，-80℃保存，备用。

(2)样品DNA的提取与检测：使用E.Z.N.A^TM Mag-Bind Soil DNAKit试剂盒(美国OMEGA生产)提取各组牛粪样品中细菌和真菌的DNA，然后用

3.0荧光计(Invitrogen)和琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的浓度和纯度。

PCR扩增：细菌扩增的目标区域是16S rRNA基因V3-V4区，通用引物341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC；真菌扩增的目标区域是ITS1-ITS2区域，引物：ITS1F：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS2：GCTGCGTTCTTCATCGATGC。根据生工生物(上海)有限公司提供参考barcode，选择使用带barcode的特异引物，通过barcode区分样品序列。

DNA纯化回收：细菌使用MagicPure Size Selection DNA Beads完成DNA纯化，利用

3.0DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量。真菌使用HieffNGSTM DNASelectionBeads完成DNA纯化，利用

3.0DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量。

文库制备和上机测序委托生工生物(上海)有限公司完成。获得测序原始数据。

(3)数据分析

OTUs聚类和物种分类分析

首先对测序得到的原始数据进行质控、拼接、去除barcode序列等处理，得到有效数据，如图1所示。最终获得539177条有效序列，其中牛粪堆肥不同时期细菌有206963条，真菌有332214条。基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类和物种分类分析，对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息和基于物种信息的丰度分布情况。选择丰度最高的(97％)序列作为代表序列，利用Usearch统计获得OTUs的数量，通过Mothur软件进行物种注释分析，结果如图2所示。根据97％相似性水平进行OTU聚类分析，牛粪堆肥不同时期(93S、94S、95S、96GWS)细菌最终获得11448个OTU，真菌最终获得1492个OTU。细菌中特有的OTU数明显多于真菌，说明不同发酵阶段细菌丰度大于真菌。

以4组样品中OTU数据量最少的为标准，对各样品的数据进行均一化处理，以便进行后续的Alpha多样性分析，获得样品内物种多样性(Shannon指数)、丰富度和均匀度(ChaoI指数和ACE)及覆盖度(Coverage)。

Alpha多样性指数分析

为了验证本实施例的测序量是否足够大、能够反映原始微生物群落的多样性，根据97％相似性水平下OTU的丰度信息，通过单样品α多样性指数分析可以反映样品内微生物群落丰富度和影响。本实施例使用ChaoI指数、Shannon指数、ACE和Coverage对牛粪不同堆肥时期细菌和真菌的多样性进行评估。

Chao指数稀释曲线如图3所示，shannon指数稀释曲线如图4所示，从两个Alpha指数稀释曲线中可以看出：随着测序数据量的不断増大，各样品的曲线基本都有要达到平台期的趋势，说明该试验的测序量基本达到饱和，表明此次测序量可基本反映本试验中牛粪不同堆肥时期菌群的多样性组成。

牛粪不同堆肥时期菌群的多样性组成统计结果见表1。ChaoI指数和ACE指数显示出达到一定的测序深度，牛粪样品的细菌随着温度升高丰度增加，95S时细菌丰度最高，高温期丰度开始下降；真菌变化规律与细菌相一致，真菌丰度95S时最高，高于其余三个样品；表明高温明显改变微生物群落丰度。Shannon指数显示，牛粪不同堆肥时期中细菌多样性由高到低依次是95S、96GWS、94S、93S，说明细菌多样性随着温度升高多样性逐渐增多，达到高温阶段细菌多样性开始下降，呈现升高再降低趋势；牛粪不同堆肥时期中真菌多样性由高到低依次是95S、94S、96GWS、93S，说明真菌多样性随着温度变化呈升高再下降趋势，95S是拐点。

表1各个样品的细菌和真菌群落α多样性统计表

注：Shannon指数：用来计算群落多样性，Shannon指数越大，群落多样性越高；ACE指数：评估样本中物种组成的丰富度和均匀度，数值越大表示该环境的物种越丰富，各物种分配越均匀；ChaoI：丰富度估计量，用来计算群落丰度，ChaoI越大，代表物种总数越高；Coverage：各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低，最高值为1。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。

样本间丰度差异分析

将基于各样本物种丰度通过Bray-Curtis算法在不同水平(门、目、科、属)上构建的样本聚类树与物种丰度柱状图结合起来，能够更加直观的看出样本间的关系及物种构成，本实施例构建的样本聚类树与物种丰度柱状图如图5～12所示。由图5～12可以看出，细菌及真菌均在94S和95S时群落组成很接近，93S、94S和95S的群落组成较为接近，96GWS的群落组成差异最大，说明在堆肥过程中随着温度的改变，牛粪中的细菌和真菌多样性也随之改变，尤其是高温阶段变化最为明显。试验表明温度显著改变了堆肥过程中的微生物群落结构。

门水平上93S和96GWS样品中的物种组成见图5和图6，其样品检测出细菌29门，真菌15门。细菌中变形菌门(Proteobacteria)的丰度最高，分别是59.48％和61.81％，均为93S和96GWS两个样本中的优势菌群，无显著差异；其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)，丰度是16.89％和29.26％，同样是两个样本的优势微生物，但是96GWS占比稍高，菌群的丰度有差异；厚壁菌门(Firmicutes)丰度分别是17.14％和2.24％，在96GWS中是优势微生物；放线菌门(Actinobacteria)丰度分别是5.33％和2.05％，虽然占比不高，但也是93S的优势微生物。93S和96GWS样品真菌未分类菌(unclassified)丰度分别是37.18％和44.66％，都是优势微生物；担子菌门(Basidiomycota)丰度分别是55.97％和0.42％，是93S中优势微生物；子囊菌门(Ascomycota)丰度分别是5.76％和54.9％，是96GWS中优势微生物。

目水平上如图7和图8所示，细菌中的优势微生物；黄单胞菌目(Xanthomonadales)丰度分别是2.34％和9.2％，占比不高依然是96GWS样品中优势微生物；黄杆菌目(Flavobacteriales)丰度分别是14.56％和5.72％，是93S样品中优势微生物；放线菌目(Actinomycetales)丰度分别是4.86％和1.66％，数量虽少但一直存在，是93S优势微生物；鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)丰度分别是1.07％和4.29％，占比少依然是96GWS优势微生物。真菌中93S和96GWS样品中丝孢酵母目(Trichosporonales)丰度分别是55.84％和0.33％，是93S优势微生物；小囊菌目(Microascales)丰度分别是0.2％和51.59％，是96GWS优势微生物。

科水平上如图9和图10所示，细菌中93S和96GWS样品莫拉菌科(Moraxellaceae)丰度分别是50.16％和0.33％，是93S中的优势微生物；黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)丰度分别是2.15％和8.91％，是96GWS中的优势微生物；假单胞菌科(Pseudomonadaceae)丰度分别是0.54％和28.84％，是96GWS中的优势微生物；黄杆菌科(Flavobacteriaceae)丰度分别是14.52％和4.37％，是93S中的优势微生物；鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)丰度分别是0.82％和3.27％，虽然数量少但一直存在，是96GWS中的优势微生物。真菌中93S和96GWS样品毛孢菌科(Trichosporonaceae)分度分别为55.48％和0.33％，是93S中的优势微生物；小囊菌科(Microascaceae)丰度分别是0.2％和51.59％，是96GWS中的优势微生物。

属水平上如图11和图12所示，细菌中，93S和96GWS样品放线菌属(Acinetobacter)在93S中占比49.72％，为优势菌群，在94S、95S和96GWS中数量减少分别占比17.14％、2.21％和0.32％；黄杆菌属(Flavobacterium)在93S中为优势菌群占比12.86％，96GWS中数量很少占比1.28％；棒杆菌(Corynebacterium)在93S、94S和95S三个样品中没有太大变化，占比分别为3.09％、5.89％和3.61％，96GWS中明显减少，占比为0.12％，表明这些细菌随着温度逐渐升高菌群数量一直下降，说明他们在高温阶段不易存活。固氮单胞菌属(Azomonas)在93S中占比很小为0.05％，随着温度逐渐升高在96GWS中成为优势菌群占比15.41％，纤维弧菌属(Cellvibrio)在96GWS样品中占比较高为8.57％，其他三个样品中均为0.08％、0.09％和0.08％，是高温阶段的优势菌群。真菌中酵母菌属(Cutaneotrichosporon)是93S样品中的优势菌群占比52.48％，随着堆肥温度逐渐升高菌类数量逐渐减少，在94S、95S和96GWS中分别占比2.69％、1.49％和0.31％，证明酵母菌属(Cutaneotrichosporon)不易在高温阶段下存活。未分类子囊菌属(unclassified_Ascomycota)在93S中数量少占比2.8％，96GWS中占比0.04％，是93S中的优势微生物。未分类小囊菌属(unclassified_Microascaceae)在93S、94S和95S中占比分别为0.2％、0.49％和1.94％，96GWS中占比51.59％为优势菌群。

多样品比较分析表明，96GWS的微生物群落分为一支，93S、94S和95S被聚为一大支，尤其94S和95S的群落组成最相近。这可能是因为93S、94S和95S三个样品取自堆肥初期及升温期，这一阶段主要是嗜温菌发挥主要作用，最适生长温度为30～45℃，而96GWS样品取自堆肥高温阶段，嗜温菌处于休眠或死亡状态，嗜热菌开始发挥重要作用，它最佳生长温度为55～65℃。细菌中最主要优势微生物包括放线菌属、固氮单胞菌属和纤维弧菌属三类菌，其中放线菌在门纲目科属水平下，一直存在且都为93S样品中优势微生物，但在96GWS中数量下降，这可能因为放线菌(Acinetobacter)具有菌丝，菌丝对温度、通气量等条件的变化较细菌敏感，初期尚有嗜温放线菌存在，数量较高；随着堆肥温度的升高，进入高温期后数量减少，并在高温期内基本维持稳定，它们对堆肥高温期分解木质纤维素有很大作用，放线菌是堆肥高温期分解木质纤维素的优势菌群，放线菌的数量决定了高温期纤维素等难降解有机物的降解速度和程度，放线菌产生的纤维素酶活性较高，并且部分放线菌纤维素酶由于具有耐高温、碱性环境而受到越来越多的关注。且放线菌为单细胞结构，便于遗传分析。

固氮单胞菌属(Azomonas)96GWS中成为优势菌群占比15.41％，纤维弧菌属(Cellvibrio)在96GWS样品中占比较高为8.57％，是高温阶段的优势菌群，两者都属于变形菌门假单胞菌科，且一直存在于堆肥发酵过程。生物固氮是最便宜、最干净、效率最高的施肥过程，固氮菌肥料是最理想的、最有发展前途的肥料，固氮单胞菌属(Azomonas)可以制作成肥料：如固氮菌肥料，是农作物非常需要的一种菌肥，将该菌属加入到发酵的牛粪中制成有机肥可以有效的提高作物产量；在堆肥中加入固氮菌和纤维素分解菌来提高堆肥的含氮量，从而提高堆肥的肥效，同时堆肥中含有大量的有生物活性的固氮菌和纤维素分解菌，所以是一种优良的生物活性肥料，施于土壤中有利于有机质的分解，又可以减少化肥的施用，有利于环境保护。纤维弧菌属(Cellvibrio)可以通过产生纤维素酶分解纤维素，在好氧条件尤其是高温阶段对纤维素的降解有重要意义；厌氧条件下纤维素的分解，主要依靠一些厌氧性的芽孢梭菌属(Clostridium)细菌，此次试验还发现芽孢梭菌属(Clostridium)细菌属在93S中占比0.7％，96GWS中占比0.1％，数量虽然不多，但在纤维素分解中发挥着重要的作用。有研究表明，梭菌属细菌具有强烈地分解蛋白质、纤维素、复杂多糖和水溶性有机物的能力。

对纤维素降解作用较强的是真菌。真菌中酵母菌属(Cutaneotrichosporon)是93S样品中的优势菌群占比52.48％；未分类小囊菌属(unclassified_Microascaceae)在96GWS中占比51.59％为优势菌群，它能产生接触酶，降解蛋白质，在发酵过程中起重要作用。

两样品粪便中优势细菌和真菌的比较

由于96GWS群落组成和93S、94S、95S差异较大，且93S、94S、95S群落组成较为接近，因此，采用fisher exact test仅分别分析了门水平和属水平上96GWS和93S中细菌和真菌的差异物种，结果见图13～16。样本间差异物种分析表明，细菌中两个样本中优势微生物都是变形菌门(Proteobacteria)，96GWS中拟杆菌门(Bacteroidetes)差异显著93S(P＜0.05)，93S中厚壁菌门(Firmicutes)差异显著96GWS(P＜0.05)，其他菌相差不大(图13)；真菌中门水平96GWS子囊菌门(Ascomycota)差异显著93S(P＜0.05)，93S担子菌门(Basidiomycota)差异显著96GWS(P＜0.05)，其他菌相差不大(图14)；真菌中属水平96GWS未分类微藻菌(unclassified_Microascaceae)差异显著93S(P＜0.05)，96GWS枝顶孢霉属(Acremonium)差异显著93S(P＜0.05)，93S酵母菌属(Cutaneotrichosporon)差异显著96GWS(P＜0.05)(图16)。(图13～16中，图中左边部分所示为不同物种分类在两个样品中的丰度比例，中间所示为95％置信度区间内，物种分类丰度的差异比例，最右边部分的值为p值，p值＜0.05，表示差异显著，物种分类用红色标识)。细菌和真菌多样性变化规律与多样品比较分析结果一样，说明两种分析方法都有效的分析了牛粪微生物多样性。

由以上实施例可知，通过高通量测序技术分析发酵牛粪细菌和真菌多样性变化规律发现，牛粪堆肥不同阶段，随温度变化其细菌和真菌的多样性随之改变，细菌多样性呈先升高后下降的趋势，95S是转折点；真菌呈相同趋势；并在各阶段出现有利于牛粪快速发酵的优势微生物，主要包括放线菌属、固氮单胞菌属、纤维弧菌属、酵母菌属和小囊菌属，为筛选能缩短堆肥时间、提高堆肥效果的发酵菌剂奠定了基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)分别在堆肥的第一天、第二天，高温期的前一天和高温期的第一天对堆肥发酵的畜禽粪便进行取样，得到各组样品；

(2)分别提取各组样品DNA进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行构建文库和测序，得到原始数据，对原始数据进行拼接、过滤，得到有效数据；

(3)基于有效数据进行OTUs聚类和物种分类分析；

(4)基于OTUs聚类和物种分类分析结果进行Alpha多样性指数分析、样品间菌群丰度差异分析，找出各组样品的优势微生物。

2.如权利要求1所述的筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法，其特征在于，所述高温期是指堆肥发酵温度达到55℃～65℃的时期。

3.如权利要求1所述的筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法，其特征在于，所述畜禽粪便为牛粪。

4.如权利要求1所述的筛选畜禽粪便发酵过程中优势微生物的方法，其特征在于，所述Alpha多样性指数分析包括Shannon指数、Chao1指数、ACE指数和Coverage指数。

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