CN110669698A - 用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法和应用，可以快速、简单、有效地筛选出堆肥过程中的优势菌群，尤其是固氮菌优势种群，大大降低优势菌群筛选工作量，大幅提高筛选成功率，在筛选出优势固氮菌后，对其进行分离和鉴定。本发明的筛选方法，包括步骤：(1)测定堆肥过程中的不同阶段氮素损失；(2)通过冗余分析，建立堆肥不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间的相关关系。本发明以冗余分析为指导，以堆肥过程优势种群中大量存在的固氮菌作为定向目标的筛选，解决以前固氮菌筛选受采样和缺乏目标，“大海捞针”似的筛选方法带来的工作量大，成功率保障低等方面的缺陷。

Description

用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及生物农业技术领域，尤其是涉及一种用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法和应用。

背景技术

堆肥是指在人工控制下，在一定的水分、C/N比和通风条件下通过微生物的发酵作用，将废弃有机物转变为肥料的过程。通过堆肥化过程，有机物由不稳定状态转变为稳定的腐殖质物质，其堆肥产品不含病原菌，不含杂草种子，而且无臭无蝇，可以安全处理和保存，是一种良好的土壤改良剂和有机肥料。堆肥的原料是城乡大量产生的有机固体废弃物，包括农村养殖粪便、作物秸秆、厨余垃圾、市政生活污泥、糖厂药厂废渣等。堆肥是一个生物学过程，在这一过程中，涉及的微生物数目巨大，种类繁多，不同的微生物可利用不同的碳源，每一类微生物都需要适合自身生长繁殖的环境条件，并且对某一种或某一类特定的有机物的分解起作用。堆肥过程中参与的微生物主要有：细菌、放线菌和真菌(包括霉菌和酵母菌)。堆肥化过程是一个微生物生态群落消长演替的过程，在这一过程中，随着温度、pH等环境条件的变化，微生物种群数量也会发生变化，并在不同的发酵阶段形成各异的优势菌群，从而对不同的有机物进行分解消化。不同的微生物生长繁殖过程中对需要的营养物质有其特殊的偏好，对碳氮的降解和转化产物存在显著差异，从而显著影响堆肥的质量和养分的损失。运用高通量测序技术分析样品中微生物种群的变化情况，已经成为目前微生物研究领域的热点问题之一。但目前关于堆肥中微生物多样性的研究也仅限于了解堆肥过程中的优势种群，关于如何提高堆肥质量，减少堆肥过程中养分的损失，特别是氮素的损失研究较少；特别是堆肥不同阶段的优势微生物种群和氮素损失之间的关系尚不明确。因此，如何通过调控堆肥过程中优势微生物种群减少堆肥氮素损失尚未有先例。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法和应用，可以快速、简单、有效地筛选出堆肥过程中的优势菌群，尤其是固氮菌优势种群，培养和筛选堆肥中固氮菌，在筛选出优势固氮菌后，对其进行分离和鉴定。

本发明通过大量实验发现不同原料和不同碳氮配比的堆肥材料在堆肥过程中氮素的损失和优势微生物种群具有显著差异，而通过优势种群和氮素损失的冗余分析发现，氮素损失较少的堆肥材料在堆肥过程中存在大量的固氮菌，而氮素损失较多的堆肥材料在堆肥过程中存在大量的反硝化细菌。由此，本发明提出一种用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法，所述方法包括步骤：

(1)测定堆肥过程中的不同阶段氮素损失率和累积氮素损失率；

(2)通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间的相关关系。

本发明以冗余分析为指导，以堆肥过程优势种群中大量存在的固氮菌作为定向目标的筛选，解决以前固氮菌筛选受采样(不确定样品中是否存在固氮菌)和缺乏目标(样品中存在什么样的固氮菌)，“大海捞针”似的筛选方法带来的工作量大，成功率保障低等方面的缺陷。

本发明的筛选方法，所述步骤(1)优选具体为：在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期，按照多点取样混合，样品风干后测定含氮量；按照测定的不同阶段的含氮量，计算堆肥过程中的不同阶段氮素损失率和累积氮素损失率。然后再通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间的相关关系。在此过程中，不同阶段的优势微生物种群可以通过常规技术确定，比如通过堆肥过程中的发酵产物分析、经验推断以及微生物多样性测序等，其中测序是最优选的且最准确的技术方案，包含步骤：通过高通量测序，明确不同原料、不同碳氮比堆肥中不同堆肥阶段存在的优势微生物种群。通过此步骤，可以得到优势微生物种群的准确分布，更加提高冗余分析的针对性。

本发明的筛选方法，进一步地，还包括步骤(3)：根据冗余分析指示的显著负相关的优势种群，分析其中存在的潜在的和已知的固氮菌。

本发明的筛选方法，进一步地，还包括步骤(4)：以步骤(3)得出的潜在的和已知的固氮菌为目标，按照菌株的筛选、分离和鉴定方法，筛选固氮菌株。

本发明的筛选方法，进一步地，还包括步骤(5)：对筛选的固氮菌株进行固氮能力测定，对确有固氮能力的菌株按照微生物生理生化方法和测序相结合的方法进行菌株鉴定。

本发明的筛选方法，最优选用于畜禽粪便作为堆肥的原料主料；原料辅料可以是作物秸秆或者菇渣、锯末等。

根据本发明的一种优选的实施方法，本发明的筛选方法的具体步骤为：

(1)堆肥原料准备：以畜禽粪便为主料，秸秆为辅料，配制不同原料和不同碳氮比的发酵原料；

(2)堆肥过程和样品采集：按照正常的堆肥程序和管理进行堆肥，分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期，按照多点取样混合，样品分为两份，一份风干用于测定含氮量，另一份样品于-80℃冷藏用于微生物多样性测序；

(3)分析：按照测定的不同阶段的含氮量，计算堆肥过程中的不同阶段氮素损失率和累积氮素损失率；通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间的相关关系，根据冗余分析指示的显著相关(显著负相关)的优势种群，分析其中存在的潜在的和已知的固氮菌；

(4)固氮菌筛选：以分析得出的潜在的和已知的固氮菌为目标，按照菌株的筛选、分离和鉴定方法，筛选固氮菌株；

(5)固氮菌鉴定：对筛选的固氮菌株进行固氮能力测定，对确有固氮能力的菌株按照微生物生理生化方法和测序相结合的方法进行菌株鉴定。

本发明在对堆肥过程中优势种群的分析基础上，通过冗余分析发现堆肥不同阶段的优势种群与堆肥中氮素的损失具有很强的相关性。而堆肥中氮素的损失不仅导致堆肥质量的下降，也会导致严重的环境污染。因此，本发明在基于堆肥不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间冗余分析的基础上，通过优势种群和氮素损失的相关分析指示堆肥中存在的潜在固氮菌，以这些潜在固氮菌为目标，从堆肥中分离固氮菌，通过固氮菌的添加，减少堆肥中氮素损失，提高堆肥质量，减少堆肥过程中氮素损失导致的污染物的排放，保护环境。

通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和阶段氮素损失量之间的相关关系；通过对相关关系的分析，发掘不同阶段堆肥中存在的潜在和已知的固氮微生物，以堆肥过程优势种群中大量存在的潜在和已知的固氮微生物作为定向目标的筛选，解决以前固氮菌筛选受采样(不确定样品中是否存在固氮菌)和缺乏目标(样品中存在什么样的固氮菌)的影响，“大海捞针”似的筛选方法带来的工作量大，成功率保障低等方面的缺陷。改变以前的未知目标的“大海捞针”似的筛选，建立以冗余分析为指导的、已知目标的定向筛选方法，大大改善“大海捞针”似的筛选方法带来的工作量大，成功率保障低等方面的缺陷。

附图说明

图1为不同原料堆肥的氮素损失；

图2为不同原料堆肥的优势种群和氮素损失的冗余分析(***代表在0.001的水平上显著，**代表在0.01的水平上显著，*代表在0.05的水平上显著)；

图3为不同碳氮比鸡粪堆肥的氮素损失；

图4为不同碳氮比鸡粪堆肥的优势种群和氮素损失的冗余分析(***代表在0.001的水平上显著，**代表在0.01的水平上显著，*代表在0.05的水平上显著)；

图5为不同碳氮比牛粪堆肥的氮素损失；

图6为不同碳氮比牛粪堆肥的优势种群和氮素损失的冗余分析(***代表在0.001的水平上显著，**代表在0.01的水平上显著，*代表在0.05的水平上显著)；

图7为不同碳氮比羊粪堆肥的氮素损失；

图8为不同碳氮比羊粪堆肥的优势种群和氮素损失的冗余分析(***代表在0.001的水平上显著，**代表在0.01的水平上显著，*代表在0.05的水平上显著)。

具体实施方式

下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。

实施例1

一种用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法，包括步骤：

(1)堆肥原料准备：以畜禽粪便为主料，秸秆为辅料，配制不同原料和不同碳氮比的发酵原料；

(2)堆肥过程和样品采集：按照正常的堆肥程序和管理进行堆肥，分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期，按照多点取样混合，样品分为两份，一份风干用于测定含氮量，另一份样品于-80℃冷藏用于微生物多样性测序；

(3)分析：按照测定的不同阶段的含氮量，计算堆肥过程中的不同阶段氮素损失率和累积氮素损失率；通过高通量测序，明确不同原料、不同碳氮比堆肥中不同阶存在的优势微生物种群；通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间的相关关系，根据冗余分析指示的显著负相关的优势种群，分析其中存在的潜在的和已知的固氮菌；

(4)固氮菌筛选：以分析得出的潜在的和已知的固氮菌为目标，按照菌株的筛选、分离和鉴定方法，筛选固氮菌株；

(5)固氮菌鉴定：对筛选的固氮菌株进行固氮能力测定，对确有固氮能力的菌株按照微生物生理生化常规方法和测序相结合的方法进行菌株鉴定。

实施例2

按照实施例1的方法针对不同原料的堆肥进行分析和筛选；

本实施例采用的是鸡粪、牛粪和羊粪三种原材料，以玉米秸秆为辅料，配置成碳氮比为25:1的堆肥原料。分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期采集堆肥样品，一份风干测定含氮量，一份-80℃冷藏用于微生物多样性测序。

图1给出了不同原料堆肥的氮素损失，其中JB代表鸡粪，NB代表牛粪，YB代表羊粪。如图1所示，累积氮素损失率在22.0％-34.1％之间，鸡粪堆肥的氮素损失最少。

图2给出了不同原料堆肥的优势种群和氮素损失的冗余分析；如图2所示，大量的微生物与氮素损失之间存在相关性，既有正相关，也有负相关。Alcanivorax,Cerasibacillus,Bacillus,Marinimicrobium,Moheibacter,Virgibacillus,Sinibacillus和氮素损失显著负相关，说明这些菌的存在可以显著减少氮素的损失。通过查阅文献，这些菌是已知的固氮菌，且主要存在于鸡粪堆肥中。

实施例3

按照实施例1的方法针对不同碳氮比鸡粪堆肥过程中优势种群和氮素损失之间的关系进行分析和筛选；

本实施例采用的是20：1，25：1和30：1三个碳氮比，以鸡粪为主料，以玉米秸秆为辅料。分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期采集堆肥样品，一份风干测定含氮量，一份-80℃冷藏用于微生物多样性测序。

图3给出了堆肥过程中的氮素损失，如图3所示，累积氮素损失率在13.04％-26.06％之间，碳氮比为30：1的鸡粪堆肥氮素损失最少。

图4给出了氮素损失和优势种群间的冗余分析，如图4所示，冗余分析表明，大量的微生物与氮素损失之间存在相关性，既有正相关，也有负相关。Thermoactinomyces,Planifilum，Bacillaceae,Thermoactinomyces,Planifilum,Flavobacterium,Bacillaceae,Pseudomonas,Sphingobacterium,Paenibacillus,Bacillus andThermobifida和氮素损失显著负相关，说明这些菌的存在可以显著减少氮素的损失。通过查阅文献，这些菌是已知的固氮菌，且主要存在于30：1鸡粪堆肥中。

实施例4

按照实施例1的方法针对不同碳氮比牛粪堆肥过程中优势种群和氮素损失之间的关系进行分析和筛选；

本实施例采用的是20：1，25：1，30：1和35：1四个碳氮比，以牛粪为主料，以玉米秸秆为辅料。分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期采集堆肥样品，一份风干测定含氮量，一份-80℃冷藏用于微生物多样性测序。

图5给出了堆肥过程中的氮素损失，如图5所示，累积氮素损失率在14.39％-36.06％之间，碳氮比为35：1的牛粪堆肥氮素损失最少。

图6给出了氮素损失和优势种群间的冗余分析，如图6所示，冗余分析表明，大量的微生物与氮素损失之间存在相关性，既有正相关，也有负相关。Thermopolyspora,Chelativorans,Pseudoxanthomonas，Bordetella，Nocardiopsis，Thermoactinomycetaceae_uncultured and Thermobifida和氮素损失显著负相关，说明这些菌的存在可以显著减少氮素的损失。通过查阅文献，这些菌是已知的固氮菌，且主要存在于35：1牛粪堆肥中。

实施例5

按照实施例1的方法针对不同碳氮比羊粪堆肥过程中优势种群和氮素损失之间的关系进行分析和筛选；

本实施例采用的是20：1，25：1和30：1三个碳氮比，以羊粪为主料，以玉米秸秆为辅料。分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期采集堆肥样品，一份风干测定含氮量，一份-80℃冷藏用于微生物多样性测序。

图7给出了堆肥过程中的氮素损失，如图7所示，累积氮素损失率在27.93％-42.03％之间，碳氮比为30：1的羊粪堆肥氮素损失最少。

图8给出了氮素损失和优势种群间的冗余分析，如图8所示，冗余分析表明，大量的微生物与氮素损失之间存在相关性，既有正相关，也有负相关。Thermobifida，Thermopolyspora,Pseudoxanthomonas，Bordetella，Cellvibrio and Sphingobacterium和氮素损失显著负相关，说明这些菌的存在可以显著减少氮素的损失。通过查阅文献，这些菌是已知的固氮菌，且主要存在于30：1羊粪堆肥中。

以上实施例在进行了冗余分析后，确定了各种固氮菌的种类，就可以以这些固氮菌为目标，从堆肥中分离固氮菌，通过固氮菌的添加，减少堆肥中氮素损失，提高堆肥质量，减少堆肥过程中氮素损失导致的污染物的排放，保护环境。

虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。

Claims (9)

1.用于堆肥过程中的固氮菌的筛选方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(1)测定堆肥过程中的不同阶段氮素损失率和累积氮素损失率；

(2)通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和氮素损失之间的相关关系。

2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期，按照多点取样混合，样品风干后测定含氮量；按照测定的不同阶段的含氮量，计算堆肥过程中的不同阶段氮素损失率和累积氮素损失率。

3.根据权利要求1或2所述的筛选方法，其特征在于，还包括步骤(3)：根据冗余分析指示的显著负相关的优势种群，分析其中存在的潜在的和已知的固氮菌。

4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，还包括步骤(4)：以步骤(3)得出的潜在的和已知的固氮菌为目标，按照菌株的筛选、分离和鉴定方法，筛选固氮菌株。

5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于，还包括步骤(5)：对筛选的固氮菌株进行固氮能力测定，对确有固氮能力的菌株按照微生物生理生化方法和测序相结合的方法进行菌株鉴定。

6.根据权利要求1-5任一项所述的筛选方法，其特征在于，所述堆肥的原料主料是畜禽粪便。

7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述堆肥的原料辅料是秸秆或菇渣、锯末。

8.根据权利要求1-7任一项所述的筛选方法，其特征在于，具体步骤为：

(1)堆肥原料准备：以畜禽粪便为主料，秸秆为辅料，配制不同原料和不同碳氮比的发酵原料；

(2)堆肥过程和样品采集：按照正常的堆肥程序和管理进行堆肥，分别在堆肥开始、高温期、降温期和成熟期，按照多点取样混合，样品分为两份，一份风干用于测定含氮量，另一份样品于-80℃冷藏用于微生物多样性测序；

(3)分析：按照测定的不同阶段的含氮量，计算堆肥过程中的阶段氮素损失量和累积氮素损失率；通过冗余分析，建立不同阶段优势微生物种群和阶段氮素损失量之间的相关关系，根据冗余分析指示的显著相关的优势种群，分析其中存在的潜在的和已知的固氮菌；

(4)固氮菌筛选：以分析得出的潜在的和已知的固氮菌为目标，按照菌株的筛选、分离和鉴定方法，筛选固氮菌株；

(5)固氮菌鉴定：对筛选的固氮菌株进行固氮能力测定，对确有固氮能力的菌株按照微生物生理生化方法和测序相结合的方法进行菌株鉴定。

9.权利要求1-8任一项所述的筛选方法在堆肥优势微生物种群筛选中的应用。

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