CN110904124A

CN110904124A - 稻瘟病菌无毒基因AvrPit及其应用

Info

Publication number: CN110904124A
Application number: CN201911024985.0A
Authority: CN
Inventors: 潘庆华; 李彤辉; 文健强; 汪金燕; 王兴; 王玲
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2020-03-24
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN110904124B

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病菌无毒基因AvrPit及其应用，属于农业生物技术领域。本发明从稻瘟病菌株CHL357中分离克隆得到一个稻瘟病菌(Magnaportheorzae)新无毒基因AvrPit，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1‑3所示。本发明还涉及了根据该基因的序列及结构设计开发基因特异性分子标记及其在监测田间稻瘟病菌群体的小种分布及其动态变化情况的应用，以及选择合适的品种在合理布局抗病品种中的应用。

Description

稻瘟病菌无毒基因AvrPit及其应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域。更具体地，涉及稻瘟病菌无毒基因AvrPit及其应用。

背景技术

稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)是寄主范围广泛的子囊真菌，它可侵染包括水稻、小麦、大麦、小米等50余种禾本科植物(Gladieux et al.2018,mBio,9:e01219-17)。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的病害之一。水稻-稻瘟病菌互作系统是一个典型的‘基因对基因’(gene-for-gene)模式系统。其中，只有抗病基因(resistancegene，R)与其所对应的无毒基因(avirulence gene，Avr)之间发生互作时，才会引发植株的抗病反应，而后者的毒性突变将导致含有特定抗病基因的品种感病化(Valent.1990,Phytopathology,1990,80:33-36；Jia et al.2000,The EMBO Journal,19:4004-4014；Zhang et al.2015,Scientific Reports,5:11642)。因此，无毒基因的克隆及其序列、结构、产物的分析，是了解病原菌致病专化性以及寄主品种抗病专化性的基础，对于植物病害的监测、预防及控制，以及抗病育种具有重要的指导意义。

迄今为止，已鉴定了约40个稻瘟病菌无毒基因(Liu et al.2010,MolecularPlant Pathology 11:419-427)，却只有10个稻瘟病菌无毒基因被克隆。AvrPita(Orbachetal.2000,The Plant Cell 18:167-187),ACE1(

et al.2004,The Plant Cell 16:2499-2513),AvrPiz-t(Li et al.2009,Molecular Plant-Microbe Interactions 22:411-420),AvrPia,AvrPii,AvrPik/km/kp(Yoshida et al.2009,The Plant Cell 21:1573-1591),AvrPiCO39(Ribot et al.2013,The Plant Journal,74:1-12),AvrPi9(Wu etal.2015,New Phytologist,206:1463-1475),AvrPib(Zhang et al.2015,ScientificReports 5:11642)以及AvrPi54(Ray et al.2016,Frontiers in Plant Science 7:1140)。有趣的是，所有已经克隆的无毒基因(包括其他病原菌)都不具有序列及结构的保守性，而且各个稻作区的群体遗传结构及其变异机制也是不同的(Wu et al.2014,MolecularPlant-Microbe Interactions,27:759-769；Wu et al.2015,New Phytologist,206:1463-1475；Zhang et al.2015,Scientific Reports 5:11642；Ray et al.2016,Frontiers inPlant Science 7:1140)。下面仅举2个实例来说明。

Wu等(2014,Molecular Plant-Microbe Interactions,27:759-769)对采集自广东、湖南、辽宁及黑龙江稻作区各60个稻瘟病菌株进行了AvrPik等位基因的群体遗传结构分析，结果表明，AvrPik等位基因的遗传多样性按照广东、湖南、辽宁及黑龙江的顺序逐步增大。进一步从4个群体中选择60个代表菌株进行了重测序分析，结果表明，AvrPik等位基因所受的人为选择压力也是按照上述顺序逐步增大的。同时，AvrPik等位基因在编码区内存在18个单核苷酸多态性变异(single nucleotide polymorphism,SNP)，其中7个是同义SNP，11个是非同义SNP，包括4个主要的SNP。以上结果说明，AvrPik等位基因受到了寄主植物强烈的正向选择，编码区内的SNP是其主要的变异机制。

Zhang等(2015,Scientific Reports 5:11642)对采集自广东、湖南、辽宁、吉林及黑龙江稻作区各60个稻瘟病菌菌株进行了AvrPib等位基因的群体遗传结构分析，结果表明，AvrPib等位基因的遗传多样性按照广东、湖南、辽宁、吉林及黑龙江的顺序逐步减少。进一步从6个群体中随机选择108个代表菌株进行了重测序分析，结果发现，在AvrPib等位基因由无毒性向毒性的变异机制中，转座子插入占绝大多数(81.7％)，其后分别为编码区的部分缺失(11.1％)，编码区的完全缺失(6.7％)，以及编码区的SNP变异(0.6％)。

综上所述，只有分离、克隆更多稻瘟病菌的无毒基因并对其进行深入的功能分析，才能更加全面、准确地把握其群体遗传结构及其动态变化规律。由此，才能为各个稻作区稻瘟病的监测、预防及控制，以及抗病育种提供具有可操作性的信息。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺点与不足，首要目的是提供一种新型的水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPit。

本发明的第二个目的是提供上述基因所编码的蛋白质。

本发明的第三个目的是提供上述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供含上述基因载体而获得的重组体。

本发明的第五个目的是提供上述基因检测的方法及其在稻瘟病监测中的应用。

本发明的第六个目的是提供利用上述精准的稻瘟病监测信息进行抗病品种合理的布局及轮换方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明涉及分离及应用一种包含AvrPit基因的DNA片段，该片段赋予稻瘟病菌对水稻产生特异性(专化性)的非致病性反应。其中，AvrPit基因的基因组DNA和cDNA序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。AvrPit基因组DNA长度为6376bp，其全长cDNA为3079bp，含有一个2022bp的编码序列(coding sequence,CDS)，5’和3’非翻译区分别为505bp和552bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放阅读框只有1个外显子而没有内含子(图4a)。该基因编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。该基因编码的蛋白质N末端含有19个氨基酸组成的信号肽。

根据本发明提供的AvrPit基因序列信息(SEQ ID NO.1)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与AvrPit等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以AvrPit基因片段为探针筛选稻瘟病菌或其它病原菌的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据AvrPit基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从稻瘟病菌或其它病原菌的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在AvrPit基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

本发明还提供一种含有所述基因的载体。

本发明能够进一步提供利用上述载体获得所述基因的转基因近等基因系(菌株)。也可以利用有性杂交的方式将本发明的基因转入其它菌株中。

本发明根据AvrPit基因序列信息(SEQ ID NO.1)与已公开的AvrPit等位基因的序列信息比对情况，设计、开发了能够准确地鉴定出AvrPit不同单元型(haplotype)的基因特异性分子标记，该标记由3组引物对组成(AvrPit-CDS-F/R:SEQ ID NO.4/SEQ ID NO.5；AvrPit-A-F/R:SEQ ID NO.6/SEQ ID NO.7；AvrPit-V-F/R:SEQ ID NO.8/SEQ ID NO.9)，其中，SEQ ID NO.7与SEQ ID NO.9相同。

应当指出，AvrPit的基因特异性分子标记包括根据本发明提供的序列而开发的其他标记。

本发明提供的稻瘟病菌无毒基因AvrPit具有重要的应用价值：

应用之一是根据所述基因序列信息开发上述基因特异性分子标记，以精准地监测各个稻作区稻瘟病菌群体的生理小种组成及其群体遗传结构的动态变化情况。具体方法可为：根据无毒性与毒性稻瘟病菌株在AvrPit的基因组序列及结构的差异，设计特异性分子标记，对田间稻瘟病菌株进行表现型及基因型分析；为从基因水平上监测田间稻瘟病群体小种变异及其动态变化规律，进而进行抗病品种的合理布局提供具有可操作性的技术方案。采用本发明方法可以对任何来源的菌株(包括稻瘟病菌，但不限于稻瘟病菌)进行基因型鉴定，建立其分子检测体系。

应用之二是根据上述监测的各个稻作区田间稻瘟病菌群体生理小种及其遗传结构的动态变化情况，选择合适的抗病品种进行合理的布局及轮换，以更有效地控制稻瘟病的发生、危害。

应用之三是将所述无毒基因AvrPit序列连接到转化载体，用转化方法将无毒基因AvrPit和相应的抗病基因Pit共同导入水稻或其他植物细胞，即将无毒基因置于病原菌侵入诱导表达的启动子下，而将相应的抗病基因置于组成型表达的启动子下，一起导入寄主植物中，当寄主受到病原菌侵染时，无毒基因便被诱导表达无毒蛋白，然后无毒蛋白作为激发子，激发其特异的抗病基因表达，产生对应的受体蛋白，它们之间相互识别，导致寄主产生过敏性反应，以阻止入侵病原菌的定殖和扩展。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供了一个稻瘟病菌新型无毒基因AvrPit，其DNA序列SEQ ID NO.1及cDNA序列SEQ ID NO.2，以及氨基酸多肽序列SEQ ID NO.3。本发明还涉及了根据该基因的序列及结构设计开发基因特异性分子标记在监测田间稻瘟病菌群体的小种分布及其动态变化情况的应用；选择合适的品种在合理布局抗病品种中的应用；以及利用遗传工程手段将无毒基因AvrPit与抗病基因Pit共价表达于水稻体内而产生诱导性抗性的应用。

优选地，上述植物可以是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦。

附图说明

图1.稻瘟病菌无毒基因AvrPit的克隆、功能验证及应用研究的技术路线图。

图2.稻瘟病菌无毒基因AvrPit的图位克隆；

图2a-2b：AvrPit位点物理图谱的构建。其中，1个大片段染色体插入(标记SM1-15与L1-10之间)，2个未知长度的片段倒位(标记SM1-9与SM1-22，以及SM2-24与SM2-20)，发生于亲本菌株CHL42与CHL357的杂交组合中；横线上面括号内数字为各个标记检测到的重组体数；横线下面数字为标记之间的物理距离(kb)；图2c-2e：目标区域候选基因图谱的构建。其中，1个片段倒位(标记CAG2-6与M2-26之间；蓝色)，以及1个片段易位(标记M2-26与M2-64之间；红色)发生于亲本菌株CHL42与CHL357的杂交组合中。图谱中的假定分泌蛋白加粗显示。进一步地，将其中2个候选基因(At13,At14)作为目的基因最有力的候选基因(图2e)；

图2f：候选基因的克隆示意图。

图3.稻瘟病菌无毒基因AvrPit的遗传转化及功能验证；

图3a：2个遗传杂交亲本菌株(CHL357,CHL42)，受体菌株(CHL995)，以及2个候选基因(At13,At14)的转化子菌株在水稻品种K59(含有目的基因对应的抗病基因Pit)的表现型。供体菌株及无毒性的杂交亲本菌株CHL357含有功能型AvrPit；毒性的杂交亲本菌株CHL42不含，以及毒性的受体菌株Guy11不含有功能性的AvrPit；A，avirulent(无毒性)；V，virulent(毒性)；

图3b：基于转化载体之潮霉素基因选择标记(hygromycin-phosphotransferasegene,Hpt)对上述菌株的基因型分析。M：DNA ladder(2000bp)。

图4.稻瘟病菌无毒基因AvrPit的基因结构及氨基酸序列；

图4a：基于基因组DNA序列的基因结构示意图，包括编码区(CDS；黑色框)以及5’及3’调控及非编码区域(浅灰色框)，其中白色框表示信号肽。基因克隆转化载体引物At13F/R(AvrPit-GT-F/R)标示其中；

图4b：基于cDNA序列的基因结构示意图，包括编码区(CDS；黑色)以及5’及3’调控及非编码区域(线条框)，其中白色框表示信号肽；

图4c：AvrPit的氨基酸序列，下划线部分为信号肽；

图4d：AvrPit等位基因的基因结构比较。其中，4个无毒性菌株的基因型完全一致且结构完整；3个毒性菌株在该基因的启动子区域均存在1个大小不一的MINE转座子插入以及5’非编码区域的缺失。CDS及PolyA由GENSCAN预测，启动子及TSS由BDGP:Neural NetworkPromoter Prediction预测，信号肽区域由SignalP-v3.0预测。A，avirulent(无毒性)；V，virulent(毒性)。

图5.稻瘟病菌无毒基因AvrPit突变体的功能验证；

图5a:AvrPit基因关键SNP及结构元件的突变体示意图。其中，括号内为各个突变体的基因型；Del(deletion),缺失；Ins(insertion),插入；A507G，#507位点的核苷酸由A突变为G；用于表现型鉴定的品种为K59(含有目的基因对应的抗病基因Pit)；另外2个品种IRBLZ5-CA(Pi2)及IRBLb-B(Pib)分别作为受体菌株的毒性及无毒性对照品种；A(avirulence)，无毒；V(virulence)，毒性。该图未按照比例绘制；突变体Mat1与野生型的序列(SEQ ID NO.1)的差异仅仅在于#502位点的缺失；突变体Mat2与野生型的序列差异仅仅在于#507位点的A突变为G；突变体Mat5与野生型的序列差异在于#269位点插入了转座子Mg-SINE，其序列如SEQ ID NO.10所示；

图5b:上述突变体转化子菌株的典型表现型；

图5c：基于转化载体之潮霉素基因选择标记(Hpt)对上述菌株的基因型分析。M：DNA ladder(2000bp)。

图6.稻瘟病菌无毒基因AvrPit特异性分子标记的设计及验证；

图6a:AvrPit基因结构及其特异性分子标记设计示意图。其中，第一对引物(AvrPit-CDS-F/R)用于PCR扩增目的基因的编码区；另外2对引物(AvrPit-A-F/R,AvrPit-V-F/R)则根据无毒性(A)及毒性(V)基因在上游区域的序列差异而设计，用于PCR扩增目的基因的全长；引物的基因组位置标注于图中；

图6b:上述3对引物对7个代表菌株的PCR扩增产物电泳图。其中，基因型：1，有扩增产物；0，无扩增产物；表现型：A，无毒性；V，毒性；各个菌株的表现型/基因型如下：a,EHL0431(A/110)；b,CHL2412(A/101)；c,CHL2452(V/101)；d,EHL0524(V/000)；e,CHL678(V/001)；f,EHL0592(V/110)；g,EHL0625(V/100)；M,DNA ladder(2000bp)。由此可以看出，只有一组3个标记才能鉴别7个菌株的所有基因型/表现型组合。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步的描述，但是，本发明的实施方式包括但不限于下述的实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，在实施例中所用的技术手段皆为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明的实施例部分，阐述了AvrPit基因的分离克隆、功能特征、分子鉴定以及应用；分离的AvrPit基因能够与适当的载体连接，转入菌株中，使该菌株对含有特异性互作的抗病基因Pit的植物产生无毒性(抗病性)。本发明采用的技术路线如图1所示。

实施例中所用的菌株：70-15,KJ201为稻瘟病菌测序的参考品种，已在NCBI等网站公开；Guy11,CHL42,CHL43,CHL346,CHL357(Zeng et al.2009,Plant Disease,93:238-242；Hua et al.2012,Theoretical and Applied Genetics,125:1047-1055；Li etal.2018,BMC Microbiology 18:47)；CHL381,CHL678,CHL2412,CHL2452,EHL0524,EHL0592,EHL0625(Text and Table S2 in Zhang et al.2015,Scientific Reports,5:11642；附件图表可在杂志网站获得，下同)；所用的水稻品种：IRBLz5-CA,IRBLb-B(TableS3 inZhai et al.2011,New Phytologist,189:321-334)，以及K59(Table 4 in Zhang etal.2017,Rice,10:46)；所用的遗传转化载体pBHT2-AscI(Zhang et al.2015,ScientificReports,5:11642)皆为本研究领域常用且已在上述文献中公开。

实施例1：稻瘟病菌无毒基因AvrPit的图位克隆(图2)

(1)AvrPit位点物理图谱的构建(图2a-2b)

为了发掘和鉴定稻瘟病菌无毒基因AvrPit，利用由稻瘟病菌株CHL357(交配型MAT1-1；对含有Pit的水稻品种K59表现无毒性)和CHL42(交配型MAT1-2；对K59表现有毒性)杂交得到的220个后代子囊孢子菌株接种水稻品种K59。结果表明，在这个作图群体中无毒性(非致病性)菌株与有毒性(致病性)菌株分别为108和112株，其分离比符合1:1。由此推断，CHL357对水稻品种K59的无毒性是由一对显性基因控制的。

为了快速地确定无毒基因的染色体位置，利用参考菌株75-10的参考序列(reference sequence)，开发并构建了由134个微卫星标记(SSR,simple rsequencerepeat)组成的遗传图谱(Feng et al.2007,Chinese Science Bulletin 52:3346-3354；Li et al.2018,BMC Microbiology 18:47)。然后，通过混合群体分离分析法(bulked-segregant analysis,BSA)，筛选了全部134个SSR标记，得到了6个与目的基因连锁的SSR标记(SM1-9，SM1-11，SM1-12，SM1-15，SM1-19，SM1-22)(图2a)。

当对目的基因作进一步的定位时，申请人发现在标记SM1-15与新标记L-10之间，存在1个大片段的染色体插入。亦即，在CHL42与CHL357的杂交组合中，发生了第一染色体与第二染色体之间的大片段插入。因此，申请人在第二染色体标记SM2-1与M2-20之间开发一系列的标记对目的基因进行了精细定位。最终将目的基因定位于标记M2-53与M2-64之间约12kb区段中(图2b)。特别地，在标记SM1-9与SM1-22，SM2-24与SM2-20之间发生了染色体片段的倒位。

(2)目标区域候选基因图谱的构建(图2c-2e)

为了更大范围地确定AvrPit的候选基因，在标记CAG2-6与CAG2-1之间，利用菌株70-15的参考序列，通过2个基因注释系统Broad Magnaporthegrisea Database(http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/magnaporthe_grisea/Regions.html)和Softberry FGENESH 2.6(http://www.softberry.com/berry.phtml)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析。结果表明，其间存在16个候选基因，其中4个编码分泌蛋白的基因。进一步利用其中10个标记的连锁分析发现，在毒性(70-15，CHL42)与无毒性菌株(CHL357)之间同时发生了染色体片段的倒位(CAG2-6与M2-26之间)及易位(标记M2-26与M2-64之间)。因此，二者的候选基因图谱分别如图2c及图2d所示。进一步地，将其中2个候选基因(At13,At14)作为目的基因最有力的候选基因(图2e)。用于精细定位的3个锚定标记M-53，M2-26，M2-64的序列如下：

SEQ ID NO.11(M2-53F；5’-3’):tgcagtgggcagacacatgg

SEQ ID NO.12(M2-53R；5’-3’):catcttttgccccttcctgc

SEQ ID NO.13(M2-26F；5’-3’):ttgtaaattttgtattaaagcgga(BsrI酶切)

SEQ ID NO.14(M2-26R；5’-3’):ataattttctagagttgcgggtaa

SEQ ID NO.15(M2-64F；5’-3’):agcgtatggttttgctggtgttt

SEQ ID NO.16(M2-64R；5’-3’):cgtgcaataatattccaccgtca

(3)AvrPit候选基因的克隆及其遗传转化(图2f)

为了更慎重地确定候选基因，将检测到1个重组体的候选基因At14与没有检测到重组体的候选基因At13分别进行了基因全长的克隆。根据对供体菌株CHL357的候选基因进行重测序的结果，设计了2个候选基因的PCR引物：

SEQ ID NO.17(At13F；5’-3’):attggcgcgccgtggcttttgatggtgtgctggat

SEQ ID NO.18(At13R；5’-3’):attggcgcgccgggacggaaagatccactcag

SEQ ID NO.19(At14F；5’-3’):attggcgcgccgtaaatgctggttctagttatcac

SEQ ID NO.20(At14R；5’-3’):attggcgcgccccaccatctgcttcttgacc

下划线为用于连接双元转化载体pBHt2-AscI的限制性内切酶Asc I的作用序列。

然后，利用高保真(high fidelity,HF)PCR技术从供体菌株CHL357基因组DNA中扩增了2个候选基因的片段。

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增条件为：预变性98℃30sec，变性98℃10sec，退火64℃15sec，延伸72℃(At13：7min；At14：5min)，扩增35个循环，最后72℃延伸5min，10℃产物保存备用。

然后，将2个候选基因通过常规方法分别克隆至双元转化载体pBHt2-AscI上，委托测序公司进行测序确认，选择插入正确且序列完整的载体进入下一步的实验(Zhang etal.2015,Scientific Reports,5:11642)。

实施例2：稻瘟病菌无毒基因AvrPit的遗传转化及功能验证(图3)

通过常规的方法，将上述转化载体分别导入农杆菌菌株C58C1中(Mullins etal.2001,Phytopathology 91:173-180；Khang et al.2007,Methods in MolecularBiology 344:403-420；Zhang et al.2015,Scientific Reports,5:11642)。利用候选基因各自的特异性标记以及载体特异性标记对导入农杆菌中的载体再次进行鉴定，选择插入正确且序列完整的载体，通过常规的农杆菌介导的稻瘟病菌遗传转化法，分别将2个候选基因导入毒性的受体菌株Guy11中，进行基于遗传互补的基因功能验证(Zhang et al.2015,Scientific Reports,5:11642)。

获得的转化子菌株通过常规的稻瘟病鉴定技术，对含有其对应的抗病基因Pit的水稻品种K59，以及2个品种IRBLZ5-CA(Pi2)及IRBLb-B(Pib)分别作为受体菌株的阳性及阴性对照进行了致病性鉴定(Pan et al.1996,Phytopathology 86:1071-1075)。A，无毒性；V，有毒性。结果表明，候选基因At13由来的转化菌株在毒性受体菌株Guy11的遗传背景下因外源基因的表达而恢复了无毒性。相反地，候选基因At14由来的转化菌株则没有因为外源基因的表达而恢复无毒性(图3)。由此说明，候选基因At13就是无毒基因AvrPit。

实施例3：稻瘟病菌无毒基因AvrPit的基因结构及氨基酸序列(图4)

(1)AvrPit基因结构的推定：根据上述的测序结果，利用GENSCAN及BDGP:NeuralNetwork Promoter Prediction等开放性基因预测软件，对AvrPit的基因结构进行了预测。其中，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别是AvrPit的基因组DNA和cDNA序列。AvrPit基因组DNA长度为6376bp，其全长cDNA为3079bp，含有一个2022bp的开放阅读框，5’和3’调控及非翻译区分别为505bp和552bp。通过比较基因组DNA和cDNA，发现该基因的开放读码框只有1个外显子而没有内含子(图4a,4b)。

(2)AvrPit蛋白质序列的推定：利用GENSCAN等软件对AvrPit基因编码的蛋白序列进行了预测，结果如SEQ ID NO：3所示。AvrPit编码1个由673个氨基酸残基组成的蛋白多肽。运用SignalP-v3.0等开放性基因预测软件对该基因编码的蛋白进行结构分析，结果表明该基因编码的蛋白具有分泌蛋白的特征，其N末端1-19个氨基酸区域是信号肽区域(下划线；图4c)。

(3)AvrPit基因结构的比较：采用相同的技术手段对本实验室保存的4个基本菌株(CHL42,CHL43,CHL346,CHL381)的AvrPit基因进行了全长克隆、测序。加上CHL357，以及2个开放性的参考菌株(70-15及KJ201)，利用开放性的多序列比对软件进行了基因结构的比较分析。结果表明，4个无毒性菌株的基因型完全一致且结构完整；3个毒性菌株在该基因的启动子区域均存在1个大小不一的MINE转座子插入以及5’调控及非编码区域的缺失(图4d)。此外，还存在2个主要的SNP单元型(下述)。

实施例4：稻瘟病菌无毒基因AvrPit突变体的功能验证(图5)

为了进一步验证AvrPit的基因结构及功能，对2个主要的SNP以及结构特征，构建了3个突变体以进一步验证其功能。其中，突变体Mat1(AvrPit^502Del)和突变体Mat2(AvrPit^A507G)通过

Ultra One Step Cloning Kit试剂盒单点突变方法构建；突变体Mat5(AvrPit^269Ins；SEQ ID NO.10)则通过

Ultra One Step CloningKit试剂盒单片段同源重组方法构建(图5a)。所用的技术手段皆为本领域技术人员所熟知的常规手段(Zhang et al.2015,Scientific Reports,5:11642)。突变体构建所用的引物序列(下划线为SNP或目标)如下：

SEQ ID NO.21(Mat1-F；5’-3’):ggttaaagccgtataaaaaaatatggaagtccaatcaatgtt

SEQ ID NO.22(Mat1-R；5’-3’):ttttatacggctttaaccaacttgtaggcaggt

SEQ ID NO.23(Mat2-F；5’-3’):aaagaatatggaagtccaatcaatgtttagga

SEQ ID NO.24(Mat2-R；5’-3’):ggacttccatattctttttatacggctttaaccaacttg

SEQ ID NO.25(Mat5-1F；5’-3’):gcggataacagtgtatttggtgat

SEQ ID NO.26(Mat5-1R；5’-3’):tatccgtacgcaccggttatgtc

SEQ ID NO.27(Mat5-2F；5’-3’):aaccggtgcgtacggatacaact

SEQ ID NO.28(Mat5-2R；5’-3’):ccaaatacactgttatccgctt

PCR扩增的体系如下：

PCR扩增条件为：98℃预变性3sec，随后进行35个循环的PCR扩增(98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸，时间按2kb/1min调整)，最后72℃延伸2min，10℃产物保存备用。

上述突变体经过测序确认正确、完整后，通过常规的遗传转化技术导入受体菌株Guy11中并对各个突变体的转化子菌株进行致病性鉴定。结果表明，Mat1(AvrPit^502Del)及Mat5(AvrPit^269Ins)由来的转化菌株在毒性受体菌株Guy11的遗传背景下并没有因为外源目的基因的表达而恢复其无毒性，由此说明此2种类型的突变体丧失了其无毒性的功能。相反地，Mat2(AvrPit^A507G)由来的转化菌株在毒性受体菌株Guy11的遗传背景下因为外源基因的表达而恢复其无毒性，由此说明此类型的突变体并没有丧失其无毒性的功能。这些突变体对2个对照品种的反应型完全与受体菌株的完全相同，由此说明突变体的功能改变仅仅针对与其对应的抗病基因Pit(图5b,5c)。由此进一步说明，At13就是无毒基因AvrPit；而改变其中的SNP并非一定导致其功能的丧失，但是，单一SNP缺失、转座子的插入等突变都将导致其无毒性功能的丧失。

实施例5：稻瘟病菌无毒基因AvrPit特异性分子标记的设计及验证(图6)

(1)AvrPit特异性分子标记的设计：根据上述无毒性与毒性菌株在AvrPit的基因组序列及结构的差异，分别设计了3个标记，分别用于CDS、无毒性AvrPit全长以及毒性AvrPit全长的PCR扩增(图6a)。引物序列如下：

SEQ ID NO.4(AvrPit-CDS-F；5’-3’):gcggataacagtgtatttggtgat

SEQ ID NO.5(AvrPit-CDS-R；5’-3’):gaccctaaagattgttctatcatgct

SEQ ID NO.6(AvrPit-A-F；5’-3’):agttgcggagcccttgaggcattgaat

SEQ ID NO.7(AvrPit-A-R；5’-3’):acctaccggtcgatctctggct

SEQ ID NO.8(AvrPit-V-F；5’-3’):gaaatccagacaaatgcatcggt

SEQ ID NO.9(AvrPit-V-R；5’-3’):acctaccggtcgatctctggct

(2)AvrPit特异性分子标记在田间稻瘟病菌群体监测中的应用：利用上述引物对田间稻瘟病菌株进行表现型及基因型分析。

AvrPit-CDS-F/R和AvrPit-A-F/R的PCR扩增体系如下：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)：2.0μL

dNTP Mixture(2.5mM each)：1.6μL

正向引物(10μM)：1.0μL

反向引物(10μM)：1.0μL

TaKaRaTaq(5U/μL)：0.1μL

DNA模板(30ng/μL)：1.0μL

ddH₂O：13.3μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30sec，58℃/62℃退火30sec，72℃延伸3/4.5min)，最后72℃延伸5min，10℃产物保存备用。

AvrPit-V-F/R的PCR扩增体系如下：

PCR扩增条件为：94℃预变性3min，随后进行35个循环的PCR扩增(94℃变性30sec，65℃退火30sec，65℃延伸6min)，最后65℃延伸10min，10℃产物保存备用。

部分菌株的基因型如图6b所示，由3个标记组成的一组标记可以全面、准确地鉴定出AvrPit在田间菌株中存在的各种各样的基因型及表现型。

采用本发明方法可以对任何来源的菌株(包括稻瘟病菌，但不限于稻瘟病菌)进行基因型鉴定，建立其分子检测体系。本发明可为基于无毒基因特异性标记的稻瘟病菌群体遗传学研究提供重要的技术基础；为从基因水平上监测田间稻瘟病群体小种变异及其动态变化规律，进而进行抗病品种的合理布局提供具有可操作性的技术方案。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 稻瘟病菌无毒基因AvrPit及其应用

<130>

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6376

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌无毒基因AvrPit DNA序列

<400> 1

tggcttttga tggtgtgctg gatccatgct cgcttggcca tttgttgaaa gtggcagtga 60

cgtgatcgtc gtgctggtgg agggagacga gttctatagg ttggctcctt gcatattaac 120

acgatgcgct gttaaaaata gcgagattgc ccgatgagaa tgacagaccc aaaccacgaa 180

gaatatcaat gccggcatcc ctgcaggctt cttccaacat ggcctccaac tctggctggc 240

agaaaccgga tgctctattc aagccgctag ctgtaggttt ttcccactcg agatccacaa 300

tctggaggcc agagtcagca aaaaaaaaaa aaaaagacag accatgacac catgtctagt 360

tgcagttcta ggatagttct agttttagga tagttctagt tctagaacta aacccccatg 420

ccaactgaac aagagctggc ctgggaacat cctgttggac tcacaatctc cccatctgca 480

tccttccagg caaaattagt cccgggtggg ccgatgatgt cctcgagcag cggcgtcagt 540

tttggcccca gaccagccga gcggaggatg cgctgtccct cgtggtcgag acacacggca 600

cgaggcagtg gatatcgcgc cggctgtctg tccaccacgg tgaccctggg ggtggtggcc 660

ttggtggggt cgacgccgga gctgccgctt ttcttggtca acagtgccag caggagccca 720

accgggcctg cacccacgca cagcacatct ctcaggtttt cgccgcttaa ttctgggtct 780

gcgtcaatgg ctgccaccat tgttgtgagc tcgaaaaaaa tgttccgcca aaagaaagtc 840

tccatgtgtg tgtcaaggct tgtggaatcg ccgagaaagt tggatgtaat taattgcgcg 900

accgggtgca catgacgtca cgcgattcag gtagcgcact atctcgtccg tatttttctg 960

ccgaggatgg aagccaaaag atatacatat tactagaact agaactagac cagactaggg 1020

aatatagtgg cactgtgccg agaagttgcg gagcccttga ggcattgaat gaactatttt 1080

tggctcatct ttcatcaaaa cctcggagaa ataatagagt aagtaatctt acaggtggct 1140

gggttccact gcccaaggca agttgggcag gtagacatgt tggtaatcga tgctcctgct 1200

atatggcagc acgttgggat ccgggggttc cacgcataat tccaacttgt atttataaaa 1260

ttccgctttc gaccagctat gcaaacagtg agatttataa ggtattcgct catctttgtg 1320

cacagtacat ttcttgaatg cggtacttat tttaacctcg tcaatcacac tatcatcatt 1380

tactcctttt tttcaatgaa taatttccgg tggatctttt aatgagaacg aacacaaaac 1440

caaggcagcc agccatgcgg aacataataa ttgtaaattt tgtattaaag cggataacag 1500

tgtatttggt gataactaga accagcattt acccgcaact ctagaaaatt atatatacta 1560

cttgtgttca actccttttg atttcctgga tgaagctagt tgaatagcac agtctaattt 1620

gcttctgctt tttgtacttt cgttttggct tttacagctg tttgttgtgc ttttcttttc 1680

actctctacc agctgttcag ctttatcagt cttttacaaa ctgtccagct ttgccagtct 1740

tttccggcat tcttttttta gaagaaaaaa taaaataaaa aagattgttc acatgcacac 1800

ctctaccttt ttggcagcca ttttggcagc cgcctcggcc gtcgaggcgg cccaaggatc 1860

tttccgggtc ccggatatca taaccccgga ttggatactc caccaagctc gcaacaatag 1920

tctcttcacc agatggagac cgcgttctca ctttctcgcc ccggccggtt ggatgaatga 1980

tccatccggt gccttttacg atcctgccac cgatttgtat catttgcaat accaatggca 2040

tcccaatcac gctaattggg gcaatgtttc atggggccat gccgtctcca aagatttatt 2100

ccattggaag gatattagag actggcggga cgattcgtcg gcatctttac cttctgggcg 2160

gttcgaaaac gggccacttt cgttcttttc cggatcttcg tatcctgtca atctcaacgg 2220

caaacaggac ggcaccttgt tgacctttgt gacaaggctg agtgacctgc ctacaagttg 2280

gttaaagccg tataaaaaaa atatggaagt ccaatcaatg tttaggagca aggatgccgg 2340

tcaaacctgg caagaacttg gccccattat cgaaagtcca ccaaagggct ggaacgtcac 2400

tgggtttcgc gacccgtatg tgtttcccaa cccagccctt gatgccatcc gtggcgtggg 2460

ccctcattac tatatcacct tgggttcggg catcaaaggg ccaaacgtcc cggccacatt 2520

tcacggcgca gcccgtccag gatttctcgg tcctcgcatg ccgctctatg ctgctccggc 2580

ttcggacttg aggaagtgga ctttcctcgg ctcgctgtgg gagtccaagc ccaacgcgag 2640

tctcggccac cccgacataa ccggtgcgta cggatacaac tttgagacca gcggggtgtt 2700

tagcctaccc atcgacaaga atgccggcaa cagcctccgc aacaccgcgt ggtttgccct 2760

catgggaacc gagggcggca acaccacact gcacccgcat gagcattggg ccgtgtggtc 2820

ccgtggtcac atggcgccga cccgtggcgg cggtgtcaag atgacgccca cgtccagcgg 2880

tgcggcggac tggggcatca cgtatgccca cacctcgttt gaggatgcgc gcaggggcaa 2940

cggcaatagg agggtcatgt ggggctgggc caacgaggat gtcaacgagg cgccgcgtcc 3000

tggaggaaca tggatgtacc acgtcctcaa ggcctttggc tacgcgggcg ccatgaacct 3060

gcccattgag ctcttcgtca agaccactca tgggctgcag aggcacacct acgttgacgg 3120

aaacgaatgg atccccgaca cgaggagtgg atatactgcc cagaccttgg gcatgcggcc 3180

tctgcctgac gttatgaagc tgctcacagc gggggcgacg caagagacct tcaacgtggg 3240

gactctgcag gccggccacg cacccaaaaa gatctccaac cacgtgggtg actcctgggt 3300

catgaccgtc acgcttggcg ccacccaggg ccccgccgga atcatcatcg cacaaagccc 3360

caacaacgcc gagtacacaa agatcatcta cgaccctcac gccaagaaga tcgtggtgcg 3420

gcgggagcac agcaccctgt tgaagggcgt gttcaacacc cacacgctga cgggccattt 3480

tgccccctac aagtacgccc acggtgccgt ggaggacatt aagttcacca tcgtgtttga 3540

caagtcgctg ctggaaatat tcgtcaacga ccggttcgcc ctcaccacgc ggctctaccc 3600

cgttcgccgc gacagcaccg ggataagttt ctttgccgga gaagcaggcg cgaatggccg 3660

gggcggcagg gcaagcgccg cgccctggaa gcaggcggtc atctggaagg ggttgaacaa 3720

ggcttggccc ggtcgacccg aggattcgag ctcgaggctg atctgggacc cgccctcggt 3780

caccaacggt ggcctttact gggagggatg gtaaaacgtt gggaaacaag atgcagtccc 3840

actggccttt tgtcttgtgg agttggcaaa aagatgttgc atctgctgcc tttttgatgc 3900

agtttgcacg gtttgctcaa gtgtttacct agaaattaga atccttgttt ataaaagttg 3960

gaagcatgat agaacaatct ttagggtcaa aattgtgcag tgtgcggttg tcgatctgtc 4020

tggttacttg tctactgcgt tggaaagtat ccacatgctt ggtctcgccg aggcaactga 4080

gcagagaaat gtcgtggtga gagacgactg ccgtggtagt ttctaaccag atacaagggc 4140

tgctttcgtc acttggtctc aactaaagtt gacaagactg tcaagatttg tgactttggc 4200

ctcggtcgaa attttctaga actagttcaa cattgaagaa atggctcttg cgggtgcttc 4260

atttcaacca gtcatcttgg gcggcagtgc aaccccgtcg ctgctttcaa aagtgcccaa 4320

ctcggccgaa tcatccccag attgagccag agataaaaca aataaaatcg gaccagcgag 4380

tgagatctat atgtccgtgg ggctcagatc gtggctgcgc aggctgtagc atggattgcc 4440

agcgcgcgtt ggacccgggt atctagacta aatcttcagg agctttgtcg acctcccatg 4500

caagggtcgc cctagaaggt gtcttgcagc gatagacggg agctttggcg tcctgttgca 4560

tctttcgggc ttggggttgt tgtactggat gtttgggagt tgttctggat atttgggatt 4620

actttgtggc cgaggtcctg catctccccc ttattcaaga ccaacttgtc agtcgggctg 4680

cctttttgtt ccaagagttt tgacgtgtgt ctgtcaatcg tttgctccac tgttgaacga 4740

atgctacaag ttcattgcga caagtctcgc aaaaatgtcc ttggacatcc atcacccacc 4800

ttgctctgct gccgtggttc atatacataa agtgaaggtg aaactcaaaa atgttgcgtt 4860

tcatgctcgg agagatgcca aagcatcaac tcagatcgac cagtcggata cttggctgtt 4920

tggacagtgg catgactgag cttctcgaac ccagcctgtg tgtgtctaat agaatatttg 4980

gaatcgcgca gccagagatc gaccggtagg tcaaggaccc catcgacggc aaatcccagg 5040

agaccgatct acccgtaacc ttggcttagt caggacgaaa gaagaaaaaa aaaagatgag 5100

ccaaacgggg agccggcact ggcagaatcg aaagtcgttt cgggcgcagt tattacgtac 5160

gtggtggtgt ggactgtgtg tggactgagt tgtgcgcaag cgccattccg ccccatgacc 5220

cttgcatcct gctgtatatg gggtcgcagg cattccttga tggaacaaaa aaggcgcctt 5280

tgagaaatca ggctcacgtc tcaaggtcga tcactgtccc tgtcccccac actccgaaaa 5340

tcttgtcgag gtctatcgcg tcgggggatt tgtagcttgc cttgggactt ttgcgaaagg 5400

ataagccaag gtgtcctggc tggcagcaaa tcgtttgggg gggaacaagc tcgaccatga 5460

aatggtgtgt aggtattgtt tgggagaccg agaaaccaaa ctgaaaaaag ctagcagatt 5520

cttggttaag cttgttgtca aaagcttatt gctactgatc aactttgcgt ccaccacgtg 5580

tcaagtatga ctgtaccacg tataaacata tcacgaggat tcaatggaga cgtaacgagg 5640

acggaggatt atcatcggat ctcgagaagc cggaggctta ataggtaata ctggcgtggt 5700

taagaatctc aaaaaaagaa acaaagctcc ccacggcatt cgcagatgat agcacacaac 5760

gcccagcctc tgcgggcaac tgctatcaag ctgcagcacc aagctattat tattgggctg 5820

cgttgcagtg ggcagacaca tggttttttt ttcagggacc tgggctccag ccggcaggaa 5880

ggggcaaaag atgggagaaa aaatcccggc ttagcatgac caactattat tccgtttgct 5940

tcagacagag tccagcttgg cgggcggttg gttaaaacgc atggctggca gcgacgagaa 6000

taaaaccccc catgggccct gtcccccccg gggtttaagt ggtttcgatt gccgtcaaaa 6060

cgtaatccct ttttttgtgg agtgttgcat tgtcggggcg atggccggtt ggagaccttg 6120

agacgagccg agacaaggac gggcgcgagt cagcagccct aacagctacg gtttggggac 6180

gagcttattt tggtgttgtg catgggctgg gtggtgaatc cgggaaaaag gagaaaaaaa 6240

aagggaaaac aaagaaacag aggagccaga gaaacagaga caaaaagaaa gtctgcgatg 6300

tagcacggca gtgccaaagt ttaatcaaca gtgaatgcaa cgtgagagtg tgaacctgag 6360

tggatctttc cgtccc 6376

<210> 2

<211> 3079

<212> DNA

<213> 稻瘟病菌无毒基因AvrPit cDNA序列

<400> 2

gtgagattta taaggtattc gctcatcttt gtgcacagta catttcttga atgcggtact 60

tattttaacc tcgtcaatca cactatcatc atttactcct ttttttcaat gaataatttc 120

cggtggatct tttaatgaga acgaacacaa aaccaaggca gccagccatg cggaacataa 180

taattgtaaa ttttgtatta aagcggataa cagtgtattt ggtgataact agaaccagca 240

tttacccgca actctagaaa attatatata ctacttgtgt tcaactcctt ttgatttcct 300

ggatgaagct agttgaatag cacagtctaa tttgcttctg ctttttgtac tttcgttttg 360

gcttttacag ctgtttgttg tgcttttctt ttcactctct accagctgtt cagctttatc 420

agtcttttac aaactgtcca gctttgccag tcttttccgg cattcttttt ttagaagaaa 480

aaataaaata aaaaagattg ttcacatgca cacctctacc tttttggcag ccattttggc 540

agccgcctcg gccgtcgagg cggcccaagg atctttccgg gtcccggata tcataacccc 600

ggattggata ctccaccaag ctcgcaacaa tagtctcttc accagatgga gaccgcgttc 660

tcactttctc gccccggccg gttggatgaa tgatccatcc ggtgcctttt acgatcctgc 720

caccgatttg tatcatttgc aataccaatg gcatcccaat cacgctaatt ggggcaatgt 780

ttcatggggc catgccgtct ccaaagattt attccattgg aaggatatta gagactggcg 840

ggacgattcg tcggcatctt taccttctgg gcggttcgaa aacgggccac tttcgttctt 900

ttccggatct tcgtatcctg tcaatctcaa cggcaaacag gacggcacct tgttgacctt 960

tgtgacaagg ctgagtgacc tgcctacaag ttggttaaag ccgtataaaa aaaatatgga 1020

agtccaatca atgtttagga gcaaggatgc cggtcaaacc tggcaagaac ttggccccat 1080

tatcgaaagt ccaccaaagg gctggaacgt cactgggttt cgcgacccgt atgtgtttcc 1140

caacccagcc cttgatgcca tccgtggcgt gggccctcat tactatatca ccttgggttc 1200

gggcatcaaa gggccaaacg tcccggccac atttcacggc gcagcccgtc caggatttct 1260

cggtcctcgc atgccgctct atgctgctcc ggcttcggac ttgaggaagt ggactttcct 1320

cggctcgctg tgggagtcca agcccaacgc gagtctcggc caccccgaca taaccggtgc 1380

gtacggatac aactttgaga ccagcggggt gtttagccta cccatcgaca agaatgccgg 1440

caacagcctc cgcaacaccg cgtggtttgc cctcatggga accgagggcg gcaacaccac 1500

actgcacccg catgagcatt gggccgtgtg gtcccgtggt cacatggcgc cgacccgtgg 1560

cggcggtgtc aagatgacgc ccacgtccag cggtgcggcg gactggggca tcacgtatgc 1620

ccacacctcg tttgaggatg cgcgcagggg caacggcaat aggagggtca tgtggggctg 1680

ggccaacgag gatgtcaacg aggcgccgcg tcctggagga acatggatgt accacgtcct 1740

caaggccttt ggctacgcgg gcgccatgaa cctgcccatt gagctcttcg tcaagaccac 1800

tcatgggctg cagaggcaca cctacgttga cggaaacgaa tggatccccg acacgaggag 1860

tggatatact gcccagacct tgggcatgcg gcctctgcct gacgttatga agctgctcac 1920

agcgggggcg acgcaagaga ccttcaacgt ggggactctg caggccggcc acgcacccaa 1980

aaagatctcc aaccacgtgg gtgactcctg ggtcatgacc gtcacgcttg gcgccaccca 2040

gggccccgcc ggaatcatca tcgcacaaag ccccaacaac gccgagtaca caaagatcat 2100

ctacgaccct cacgccaaga agatcgtggt gcggcgggag cacagcaccc tgttgaaggg 2160

cgtgttcaac acccacacgc tgacgggcca ttttgccccc tacaagtacg cccacggtgc 2220

cgtggaggac attaagttca ccatcgtgtt tgacaagtcg ctgctggaaa tattcgtcaa 2280

cgaccggttc gccctcacca cgcggctcta ccccgttcgc cgcgacagca ccgggataag 2340

tttctttgcc ggagaagcag gcgcgaatgg ccggggcggc agggcaagcg ccgcgccctg 2400

gaagcaggcg gtcatctgga aggggttgaa caaggcttgg cccggtcgac ccgaggattc 2460

gagctcgagg ctgatctggg acccgccctc ggtcaccaac ggtggccttt actgggaggg 2520

atggtaaaac gttgggaaac aagatgcagt cccactggcc ttttgtcttg tggagttggc 2580

aaaaagatgt tgcatctgct gcctttttga tgcagtttgc acggtttgct caagtgttta 2640

cctagaaatt agaatccttg tttataaaag ttggaagcat gatagaacaa tctttagggt 2700

caaaattgtg cagtgtgcgg ttgtcgatct gtctggttac ttgtctactg cgttggaaag 2760

tatccacatg cttggtctcg ccgaggcaac tgagcagaga aatgtcgtgg tgagagacga 2820

ctgccgtggt agtttctaac cagatacaag ggctgctttc gtcacttggt ctcaactaaa 2880

gttgacaaga ctgtcaagat ttgtgacttt ggcctcggtc gaaattttct agaactagtt 2940

caacattgaa gaaatggctc ttgcgggtgc ttcatttcaa ccagtcatct tgggcggcag 3000

tgcaaccccg tcgctgcttt caaaagtgcc caactcggcc gaatcatccc cagattgagc 3060

cagagataaa acaaataaa 3079

<210> 3

<211> 673

<212> PRT

<213> 稻瘟病菌无毒基因AvrPit 编码氨基酸序列

<400> 3

Met His Thr Ser Thr Phe Leu Ala Ala Ile Leu Ala Ala Ala Ser Ala

1 5 10 15

Val Glu Ala Ala Gln Gly Ser Phe Arg Val Pro Asp Ile Ile Thr Pro

20 25 30

Asp Trp Ile Leu His Gln Ala Arg Asn Asn Ser Leu Phe Thr Arg Trp

35 40 45

Arg Pro Arg Ser His Phe Leu Ala Pro Ala Gly Trp Met Asn Asp Pro

50 55 60

Ser Gly Ala Phe Tyr Asp Pro Ala Thr Asp Leu Tyr His Leu Gln Tyr

65 70 75 80

Gln Trp His Pro Asn His Ala Asn Trp Gly Asn Val Ser Trp Gly His

85 90 95

Ala Val Ser Lys Asp Leu Phe His Trp Lys Asp Ile Arg Asp Trp Arg

100 105 110

Asp Asp Ser Ser Ala Ser Leu Pro Ser Gly Arg Phe Glu Asn Gly Pro

115 120 125

Leu Ser Phe Phe Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Val Asn Leu Asn Gly Lys

130 135 140

Gln Asp Gly Thr Leu Leu Thr Phe Val Thr Arg Leu Ser Asp Leu Pro

145 150 155 160

Thr Ser Trp Leu Lys Pro Tyr Lys Lys Asn Met Glu Val Gln Ser Met

165 170 175

Phe Arg Ser Lys Asp Ala Gly Gln Thr Trp Gln Glu Leu Gly Pro Ile

180 185 190

Ile Glu Ser Pro Pro Lys Gly Trp Asn Val Thr Gly Phe Arg Asp Pro

195 200 205

Tyr Val Phe Pro Asn Pro Ala Leu Asp Ala Ile Arg Gly Val Gly Pro

210 215 220

His Tyr Tyr Ile Thr Leu Gly Ser Gly Ile Lys Gly Pro Asn Val Pro

225 230 235 240

Ala Thr Phe His Gly Ala Ala Arg Pro Gly Phe Leu Gly Pro Arg Met

245 250 255

Pro Leu Tyr Ala Ala Pro Ala Ser Asp Leu Arg Lys Trp Thr Phe Leu

260 265 270

Gly Ser Leu Trp Glu Ser Lys Pro Asn Ala Ser Leu Gly His Pro Asp

275 280 285

Ile Thr Gly Ala Tyr Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Ser Gly Val Phe Ser

290 295 300

Leu Pro Ile Asp Lys Asn Ala Gly Asn Ser Leu Arg Asn Thr Ala Trp

305 310 315 320

Phe Ala Leu Met Gly Thr Glu Gly Gly Asn Thr Thr Leu His Pro His

325 330 335

Glu His Trp Ala Val Trp Ser Arg Gly His Met Ala Pro Thr Arg Gly

340 345 350

Gly Gly Val Lys Met Thr Pro Thr Ser Ser Gly Ala Ala Asp Trp Gly

355 360 365

Ile Thr Tyr Ala His Thr Ser Phe Glu Asp Ala Arg Arg Gly Asn Gly

370 375 380

Asn Arg Arg Val Met Trp Gly Trp Ala Asn Glu Asp Val Asn Glu Ala

385 390 395 400

Pro Arg Pro Gly Gly Thr Trp Met Tyr His Val Leu Lys Ala Phe Gly

405 410 415

Tyr Ala Gly Ala Met Asn Leu Pro Ile Glu Leu Phe Val Lys Thr Thr

420 425 430

His Gly Leu Gln Arg His Thr Tyr Val Asp Gly Asn Glu Trp Ile Pro

435 440 445

Asp Thr Arg Ser Gly Tyr Thr Ala Gln Thr Leu Gly Met Arg Pro Leu

450 455 460

Pro Asp Val Met Lys Leu Leu Thr Ala Gly Ala Thr Gln Glu Thr Phe

465 470 475 480

Asn Val Gly Thr Leu Gln Ala Gly His Ala Pro Lys Lys Ile Ser Asn

485 490 495

His Val Gly Asp Ser Trp Val Met Thr Val Thr Leu Gly Ala Thr Gln

500 505 510

Gly Pro Ala Gly Ile Ile Ile Ala Gln Ser Pro Asn Asn Ala Glu Tyr

515 520 525

Thr Lys Ile Ile Tyr Asp Pro His Ala Lys Lys Ile Val Val Arg Arg

530 535 540

Glu His Ser Thr Leu Leu Lys Gly Val Phe Asn Thr His Thr Leu Thr

545 550 555 560

Gly His Phe Ala Pro Tyr Lys Tyr Ala His Gly Ala Val Glu Asp Ile

565 570 575

Lys Phe Thr Ile Val Phe Asp Lys Ser Leu Leu Glu Ile Phe Val Asn

580 585 590

Asp Arg Phe Ala Leu Thr Thr Arg Leu Tyr Pro Val Arg Arg Asp Ser

595 600 605

Thr Gly Ile Ser Phe Phe Ala Gly Glu Ala Gly Ala Asn Gly Arg Gly

610 615 620

Gly Arg Ala Ser Ala Ala Pro Trp Lys Gln Ala Val Ile Trp Lys Gly

625 630 635 640

Leu Asn Lys Ala Trp Pro Gly Arg Pro Glu Asp Ser Ser Ser Arg Leu

645 650 655

Ile Trp Asp Pro Pro Ser Val Thr Asn Gly Gly Leu Tyr Trp Glu Gly

660 665 670

Trp

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物AvrPit-CDS-F

<400> 4

gcggataaca gtgtatttgg tgat 24

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物AvrPit-CDS-R

<400> 5

gaccctaaag attgttctat catgct 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物AvrPit-A-F

<400> 6

agttgcggag cccttgaggc attgaat 27

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物AvrPit-A-R

<400> 7

acctaccggt cgatctctgg ct 22

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物AvrPit-V-F

<400> 8

gaaatccaga caaatgcatc ggt 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物AvrPit-V-R

<400> 9

acctaccggt cgatctctgg ct 22

<210> 10

<211> 6866

<212> DNA

<213> 突变体Mat5

<400> 10

tggcttttga tggtgtgctg gatccatgct cgcttggcca tttgttgaaa gtggcagtga 60

cgtgatcgtc gtgctggtgg agggagacga gttctatagg ttggctcctt gcatattaac 120

acgatgcgct gttaaaaata gcgagattgc ccgatgagaa tgacagaccc aaaccacgaa 180

gaatatcaat gccggcatcc ctgcaggctt cttccaacat ggcctccaac tctggctggc 240

agaaaccgga tgctctattc aagccgctag ctgtaggttt ttcccactcg agatccacaa 300

tctggaggcc agagtcagca aaaaaaaaaa aaaaagacag accatgacac catgtctagt 360

tgcagttcta ggatagttct agttttagga tagttctagt tctagaacta aacccccatg 420

ccaactgaac aagagctggc ctgggaacat cctgttggac tcacaatctc cccatctgca 480

tccttccagg caaaattagt cccgggtggg ccgatgatgt cctcgagcag cggcgtcagt 540

tttggcccca gaccagccga gcggaggatg cgctgtccct cgtggtcgag acacacggca 600

cgaggcagtg gatatcgcgc cggctgtctg tccaccacgg tgaccctggg ggtggtggcc 660

ttggtggggt cgacgccgga gctgccgctt ttcttggtca acagtgccag caggagccca 720

accgggcctg cacccacgca cagcacatct ctcaggtttt cgccgcttaa ttctgggtct 780

gcgtcaatgg ctgccaccat tgttgtgagc tcgaaaaaaa tgttccgcca aaagaaagtc 840

tccatgtgtg tgtcaaggct tgtggaatcg ccgagaaagt tggatgtaat taattgcgcg 900

accgggtgca catgacgtca cgcgattcag gtagcgcact atctcgtccg tatttttctg 960

ccgaggatgg aagccaaaag atatacatat tactagaact agaactagac cagactaggg 1020

aatatagtgg cactgtgccg agaagttgcg gagcccttga ggcattgaat gaactatttt 1080

tggctcatct ttcatcaaaa cctcggagaa ataatagagt aagtaatctt acaggtggct 1140

gggttccact gcccaaggca agttgggcag gtagacatgt tggtaatcga tgctcctgct 1200

atatggcagc acgttgggat ccgggggttc cacgcataat tccaacttgt atttataaaa 1260

ttccgctttc gaccagctat gcaaacagtg agatttataa ggtattcgct catctttgtg 1320

cacagtacat ttcttgaatg cggtacttat tttaacctcg tcaatcacac tatcatcatt 1380

tactcctttt tttcaatgaa taatttccgg tggatctttt aatgagaacg aacacaaaac 1440

caaggcagcc agccatgcgg aacataataa ttgtaaattt tgtattaaag cggataacag 1500

tgtatttggt gataactaga accagcattt acccgcaact ctagaaaatt atatatacta 1560

cttgtgttca actccttttg atttcctgga tgaagctagt tgaatagcac agtctaattt 1620

gcttctgctt tttgtacttt cgttttggct tttacagctg tttgttgtgc ttttcttttc 1680

actctctacc agctgttcag ctttatcagt cttttacaaa ctgtccagct ttgccagtct 1740

tttccggcat tcttttttta gaagaaaaaa taaaataaaa aagattgttc acatgcacac 1800

ctctaccttt ttggcagcca ttttggcagc cgcctcggcc gtcgaggcgg cccaaggatc 1860

tttccgggtc ccggatatca taaccccgga ttggatactc caccaagctc gcaacaatag 1920

tctcttcacc agatggagac cgcgttctca ctttctcgcc ccggccggtt ggatgaatga 1980

tccatccggt gccttttacg atcctgccac cgatttgtat catttgcaat accaatggca 2040

tcccaatcac gctaattggg gggaatggcg cagtggttaa gcgccatggc tgttacttga 2100

gtaacgtagg ttcgaatcct gctccctcca cctcctcccc gcttaccgtg gcaaggataa 2160

cccggctggc tatcgacaac aaccacccgc ctgtgccgtc gagcccacac ttgttgggaa 2220

cttcgtctcc atggctacaa acgaccgaca gctccgctgt ttggacacag gcccctctcg 2280

atgaagagcc gtcaactgcc gtcagacgaa tcctccgtgc gcctgaaggc acggggtcgc 2340

gtcagtgaac aaacctgtaa gcagggccgg gcacgaaccc ggtcaggctc gattcgcttc 2400

tatgcccttg ttttccgctg tgtaaataga gaaaatagaa agcgcgccga gatacccctc 2460

gggaggttgc taacggccgg ctaatgagcc gggccgagcc cggcgttaaa taatactact 2520

actactacta ctacaatcac gctaattggg gcaatgtttc atggggccat gccgtctcca 2580

aagatttatt ccattggaag gatattagag actggcggga cgattcgtcg gcatctttac 2640

cttctgggcg gttcgaaaac gggccacttt cgttcttttc cggatcttcg tatcctgtca 2700

atctcaacgg caaacaggac ggcaccttgt tgacctttgt gacaaggctg agtgacctgc 2760

ctacaagttg gttaaagccg tataaaaaaa atatggaagt ccaatcaatg tttaggagca 2820

aggatgccgg tcaaacctgg caagaacttg gccccattat cgaaagtcca ccaaagggct 2880

ggaacgtcac tgggtttcgc gacccgtatg tgtttcccaa cccagccctt gatgccatcc 2940

gtggcgtggg ccctcattac tatatcacct tgggttcggg catcaaaggg ccaaacgtcc 3000

cggccacatt tcacggcgca gcccgtccag gatttctcgg tcctcgcatg ccgctctatg 3060

ctgctccggc ttcggacttg aggaagtgga ctttcctcgg ctcgctgtgg gagtccaagc 3120

ccaacgcgag tctcggccac cccgacataa ccggtgcgta cggatacaac tttgagacca 3180

gcggggtgtt tagcctaccc atcgacaaga atgccggcaa cagcctccgc aacaccgcgt 3240

ggtttgccct catgggaacc gagggcggca acaccacact gcacccgcat gagcattggg 3300

ccgtgtggtc ccgtggtcac atggcgccga cccgtggcgg cggtgtcaag atgacgccca 3360

cgtccagcgg tgcggcggac tggggcatca cgtatgccca cacctcgttt gaggatgcgc 3420

gcaggggcaa cggcaatagg agggtcatgt ggggctgggc caacgaggat gtcaacgagg 3480

cgccgcgtcc tggaggaaca tggatgtacc acgtcctcaa ggcctttggc tacgcgggcg 3540

ccatgaacct gcccattgag ctcttcgtca agaccactca tgggctgcag aggcacacct 3600

acgttgacgg aaacgaatgg atccccgaca cgaggagtgg atatactgcc cagaccttgg 3660

gcatgcggcc tctgcctgac gttatgaagc tgctcacagc gggggcgacg caagagacct 3720

tcaacgtggg gactctgcag gccggccacg cacccaaaaa gatctccaac cacgtgggtg 3780

actcctgggt catgaccgtc acgcttggcg ccacccaggg ccccgccgga atcatcatcg 3840

cacaaagccc caacaacgcc gagtacacaa agatcatcta cgaccctcac gccaagaaga 3900

tcgtggtgcg gcgggagcac agcaccctgt tgaagggcgt gttcaacacc cacacgctga 3960

cgggccattt tgccccctac aagtacgccc acggtgccgt ggaggacatt aagttcacca 4020

tcgtgtttga caagtcgctg ctggaaatat tcgtcaacga ccggttcgcc ctcaccacgc 4080

ggctctaccc cgttcgccgc gacagcaccg ggataagttt ctttgccgga gaagcaggcg 4140

cgaatggccg gggcggcagg gcaagcgccg cgccctggaa gcaggcggtc atctggaagg 4200

ggttgaacaa ggcttggccc ggtcgacccg aggattcgag ctcgaggctg atctgggacc 4260

cgccctcggt caccaacggt ggcctttact gggagggatg gtaaaacgtt gggaaacaag 4320

atgcagtccc actggccttt tgtcttgtgg agttggcaaa aagatgttgc atctgctgcc 4380

tttttgatgc agtttgcacg gtttgctcaa gtgtttacct agaaattaga atccttgttt 4440

ataaaagttg gaagcatgat agaacaatct ttagggtcaa aattgtgcag tgtgcggttg 4500

tcgatctgtc tggttacttg tctactgcgt tggaaagtat ccacatgctt ggtctcgccg 4560

aggcaactga gcagagaaat gtcgtggtga gagacgactg ccgtggtagt ttctaaccag 4620

atacaagggc tgctttcgtc acttggtctc aactaaagtt gacaagactg tcaagatttg 4680

tgactttggc ctcggtcgaa attttctaga actagttcaa cattgaagaa atggctcttg 4740

cgggtgcttc atttcaacca gtcatcttgg gcggcagtgc aaccccgtcg ctgctttcaa 4800

aagtgcccaa ctcggccgaa tcatccccag attgagccag agataaaaca aataaaatcg 4860

gaccagcgag tgagatctat atgtccgtgg ggctcagatc gtggctgcgc aggctgtagc 4920

atggattgcc agcgcgcgtt ggacccgggt atctagacta aatcttcagg agctttgtcg 4980

acctcccatg caagggtcgc cctagaaggt gtcttgcagc gatagacggg agctttggcg 5040

tcctgttgca tctttcgggc ttggggttgt tgtactggat gtttgggagt tgttctggat 5100

atttgggatt actttgtggc cgaggtcctg catctccccc ttattcaaga ccaacttgtc 5160

agtcgggctg cctttttgtt ccaagagttt tgacgtgtgt ctgtcaatcg tttgctccac 5220

tgttgaacga atgctacaag ttcattgcga caagtctcgc aaaaatgtcc ttggacatcc 5280

atcacccacc ttgctctgct gccgtggttc atatacataa agtgaaggtg aaactcaaaa 5340

atgttgcgtt tcatgctcgg agagatgcca aagcatcaac tcagatcgac cagtcggata 5400

cttggctgtt tggacagtgg catgactgag cttctcgaac ccagcctgtg tgtgtctaat 5460

agaatatttg gaatcgcgca gccagagatc gaccggtagg tcaaggaccc catcgacggc 5520

aaatcccagg agaccgatct acccgtaacc ttggcttagt caggacgaaa gaagaaaaaa 5580

aaaagatgag ccaaacgggg agccggcact ggcagaatcg aaagtcgttt cgggcgcagt 5640

tattacgtac gtggtggtgt ggactgtgtg tggactgagt tgtgcgcaag cgccattccg 5700

ccccatgacc cttgcatcct gctgtatatg gggtcgcagg cattccttga tggaacaaaa 5760

aaggcgcctt tgagaaatca ggctcacgtc tcaaggtcga tcactgtccc tgtcccccac 5820

actccgaaaa tcttgtcgag gtctatcgcg tcgggggatt tgtagcttgc cttgggactt 5880

ttgcgaaagg ataagccaag gtgtcctggc tggcagcaaa tcgtttgggg gggaacaagc 5940

tcgaccatga aatggtgtgt aggtattgtt tgggagaccg agaaaccaaa ctgaaaaaag 6000

ctagcagatt cttggttaag cttgttgtca aaagcttatt gctactgatc aactttgcgt 6060

ccaccacgtg tcaagtatga ctgtaccacg tataaacata tcacgaggat tcaatggaga 6120

cgtaacgagg acggaggatt atcatcggat ctcgagaagc cggaggctta ataggtaata 6180

ctggcgtggt taagaatctc aaaaaaagaa acaaagctcc ccacggcatt cgcagatgat 6240

agcacacaac gcccagcctc tgcgggcaac tgctatcaag ctgcagcacc aagctattat 6300

tattgggctg cgttgcagtg ggcagacaca tggttttttt ttcagggacc tgggctccag 6360

ccggcaggaa ggggcaaaag atgggagaaa aaatcccggc ttagcatgac caactattat 6420

tccgtttgct tcagacagag tccagcttgg cgggcggttg gttaaaacgc atggctggca 6480

gcgacgagaa taaaaccccc catgggccct gtcccccccg gggtttaagt ggtttcgatt 6540

gccgtcaaaa cgtaatccct ttttttgtgg agtgttgcat tgtcggggcg atggccggtt 6600

ggagaccttg agacgagccg agacaaggac gggcgcgagt cagcagccct aacagctacg 6660

gtttggggac gagcttattt tggtgttgtg catgggctgg gtggtgaatc cgggaaaaag 6720

gagaaaaaaa aagggaaaac aaagaaacag aggagccaga gaaacagaga caaaaagaaa 6780

gtctgcgatg tagcacggca gtgccaaagt ttaatcaaca gtgaatgcaa cgtgagagtg 6840

tgaacctgag tggatctttc cgtccc 6866

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物M2-53F

<400> 11

tgcagtgggc agacacatgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物M2-53R

<400> 12

catcttttgc cccttcctgc 20

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物M2-26F

<400> 13

ttgtaaattt tgtattaaag cgga 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物M2-26R

<400> 14

ataattttct agagttgcgg gtaa 24

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物M2-64F

<400> 15

agcgtatggt tttgctggtg ttt 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物M2-64R

<400> 16

cgtgcaataa tattccaccg tca 23

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物At13F

<400> 17

attggcgcgc cgtggctttt gatggtgtgc tggat 35

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物At13R

<400> 18

attggcgcgc cgggacggaa agatccactc ag 32

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物At14F

<400> 19

attggcgcgc cgtaaatgct ggttctagtt atcac 35

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物At14R

<400> 20

attggcgcgc cccaccatct gcttcttgac c 31

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物Mat1-F

<400> 21

ggttaaagcc gtataaaaaa atatggaagt ccaatcaatg tt 42

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 引物Mat1-R

<400> 22

ttttatacgg ctttaaccaa cttgtaggca ggt 33

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 引物Mat2-F

<400> 23

aaagaatatg gaagtccaat caatgtttag ga 32

<210> 24

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物Mat2-R

<400> 24

ggacttccat attcttttta tacggcttta accaacttg 39

<210> 25

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物Mat5-1F

<400> 25

gcggataaca gtgtatttgg tgat 24

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物Mat5-1R

<400> 26

tatccgtacg caccggttat gtc 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物Mat5-2F

<400> 27

aaccggtgcg tacggataca act 23

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物Mat5-2R

<400> 28

ccaaatacac tgttatccgc tt 22

Claims

1.一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPit，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种水稻稻瘟病菌无毒基因AvrPit，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

3.由权利要求1或权利要求2所述基因AvrPit编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或该序列替换、缺失、或添加一个或几个氨基酸残基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。

4.一种重组突变体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.含有权利要求1所述无毒基因AvrPit的载体。

6.含有权利要求5所述载体的重组体菌株。

7.权利要求1所述无毒基因AvrPit在设计特异性分子标记中的应用。

8.一种稻瘟病菌无毒基因AvrPit的特异性分子标记，其特征在于：该特异性分子标记包括但不限于由如下3个标记的任一或任几个组成；所述3个标记分别通过SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对AvrPit-CDS-F/R、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对AvrPit-A-F/R、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对AvrPit-V-F/R扩增得到。

9.权利要求1所述无毒基因AvrPit、权利要求5所述载体、权利要求6所述重组体菌株、权利要求8所述的特异性分子标记的应用，其特征在于，是在监测稻作区稻瘟病菌群体的生理小种组成及其群体遗传结构的动态变化情况，进行抗病品种合理的布局及轮换方面的应用。