CN102041262B

CN102041262B - 稻瘟病抗性基因Pik-p及其应用

Info

Publication number: CN102041262B
Application number: CN 200910236466
Authority: CN
Inventors: 潘庆华; 王玲; 袁斌; 徐晓可; 林菲
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2009-10-22
Filing date: 2009-10-22
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2029-10-22
Also published as: CN102041262A

Abstract

本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。该序列包含有2个基因，都属于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成员，且皆为组成型表达的基因。本发明还涉及用该基因转化水稻或其它植物培育抗病品种以及根据该基因序列产生的分子标记在育种中的应用。

Description

稻瘟病抗性基因Pik-p及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的克隆及其应用。

背景技术

植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，抗病基因产物结构的分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于植物病害的预防和控制也具有重要的指导意义。

迄今为止，已经从单子叶植物和双子叶植物中分离了80多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC)，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蝇Toll蛋白及哺乳动物白介素-1受体(Toll andinterleukin-1 receptor，TIR)等。根据它们所编码蛋白的结构特征，可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack&Jones，1997；Dangl&Jones 2001；Iyer&McCouch2004)。

第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1个被克隆的植物抗病基因，它控制对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hm1编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小种1产生的致病因子，它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。它们编码的蛋白近N端为NBS，而近C端则由LRR组成。如RPS2(Bent et al.，1994)、RPM1(Grant et al.，1995)、I2(Simon et al.，1998)；RPP5(Parker et al.，1997)、N(Dodd et al.，2001)、L6(Lawrence et al.，1995)、Mla1(Zhou et al.，2001)、Mla6(Halterman et al.，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura et al.，1998)、Pib(Wang et al.，1999)、Pita(Bryan et al.，2000)等。第三类，PK类抗病基因。如番茄Pto基因，其产物是一种位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martin et al.，1993)。第四类，LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2(Dixon et al.，1996)、Cf-4(Thomas et al.，1997)、Cf-5(Dixon et al.，1998)、Cf-9(Jones et al.，1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基因Hs1^pro-1(Cai et al.，1997)等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song et al.，1995)为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域(Xiao et al.，2001)。第七类，以水稻的xa5基因为代表，其编码的蛋白为一个转录因子(TFIIAγ)(Iyer&McCouch，2004)。

编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers et al.，2002；Pan et al.，2000；Cannon et al.，2002；Richly et al.，2002)。TNL类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没在单子叶植物基因组中发现(Bai et al.，2002；Meyers et al.，2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的抗病基因主要编码CNL类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CNL类抗病基因，相对而言，单子叶植物中的CNL类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样(Cannon et al.，2002)。

研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack&Jones1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反应下游的信号传导(Jones et al.，1994)。最近的证据表明，亚麻的L族多样性选择也发生在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck et al.，2000)。LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones&Jones，1996；Kajava et al.，1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent，1996；Bakeret al.，1997)。Jia et al.(2000)通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita₁₇₆小种特异性的激发子，传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita₁₇₆不能与LRD结合，因而表现感病。这一结果直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe oryzae(无性态：Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的了解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应用于抗病育种计划已成为农业科研中优先解决的重要问题。

随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。目前，在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式报道的已有13个抗性基因，Pib(Wang et al.，1999)，Pita(Bryan et al.，2000)，Pi9(Qu et al.，2006)，Pid2(Chen et al.，2006)，Piz-t和Pi2(Zhou et al.，2006b)，Pi36(Liu et al.，2007a)，Pi37(Lin et al.，2007)，Pik-m(Ashikawa et al.，2008)，Pit(Hayashi et al.，2009)，Pi5(Lee et al.，2009)，Pid3(Shang et al.，2009)和pi21(Fukuoka et al.，2009)。

克隆抗病基因是对水稻抗性机理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因的修饰和改造，可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。

本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。

本发明的另一个目的是提供上述载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供上述基因在制备转基因植物中的应用。

本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。

本发明从水稻K60中分离得到Pik-p基因，包括编码两个NBS-LRR类蛋白的基因Pikp3、Pikp4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，它们分别编码SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，结构如图5a和5b所示。它们的蛋白都包含2个主要的结构域：NBS和LRR区域，其中Pikp3 NBS结构域含有保守的kinase 1a：GLPGGGKTTVAR，kinase 2：KKYLIVIDDIW，kinase3a：DLGGRIIMTTRLNSI；Pikp4 NBS结构域含有保守的kinase 1a：VLSIVGFGGVGKTTIA，kinase 2：LEQLLAEKSYILLIDDIW和kinase 3a：EQVPEEIWKICGGLPLAIVT。而Pikp3蛋白的C-末端为16个不完整的LRR重复，其亮氨酸含量为14.0％；Pikp4蛋白的C-末端为13个不完整的LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％(图5a，5b)。Pik-p基因中编码NBS或LRR的核苷酸片段可能具有独立的功能。将Pik-p基因中编码不同结构域的片段与其他核酸片段重组，可构成嵌合基因或蛋白质，使之具有新的功能。

应当理解，在不影响蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还包含对编码上述蛋白的基因序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与上述编码基因具有相同功能的核苷酸序列。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

本发明同样包括将Pik-p抗性基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒35S的启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达。同样地，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。

本发明还进一步克隆得到所述基因的启动子，包含调控该基因的启动子的DNA片段分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

根据本发明提供的Pik-p基因序列信息(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pikp等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以Pik-p基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pik-p基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在Pik-p基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

本发明提供的稻瘟病抗性基因Pik-p具有重要的应用价值，其赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应。其适用于对所有对该病原菌敏感的植物，这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。应用之一是将所述的Pik-p基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将Pik-p抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。

本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。

本发明具有明显的优点和效果。将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。

本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株。

附图说明

图1.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的图位克隆技术路线图。

图2a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之组成基因Pikp3之正向遗传互补T₀植株的抗性鉴定实物图。图中所有转化植株都表现感病，说明单一的Pikp3不具备抗性功能。

图2b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之另一组成基因Pikp4之正向遗传互补T₀植株的抗性鉴定实物图。图中所有转化植株都表现感病，说明单一的Pikp4也不具备抗性功能。

图2c.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p(由Pikp3和Pikp4组成)之正向遗传互补T₀植株的抗性鉴定实物图。图中箭头1所指的是抗病植株，箭头2所指的是感病植株，说明抗性基因Pik-p由Pikp3和Pikp4组成才能表现功能。

图2d.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的正向遗传互补的部分T₀转化体的选择标记GUS和HPT基因的PCR检测图。

图中泳道1：分子量标记DL2000；泳道2：H₂O，阴性对照；泳道3：空载体，阳性对照；泳道4-12：T₀转化体。结果表明，所有转化体都检测到了2个选择性标记的PCR扩增产物，说明正义转化构建体已经整合到了高感受体品种Q1063中。R：高抗；MR：中抗；S：感病。其中的感病个体(S)可能是由于外源基因的整合等问题，在受体品种中并没有得到充分的表达。

图3a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p反向遗传互补(RNAi)植株的抗性鉴定图。图中箭头1所指的是抗病植株，箭头2所指的是感病植株。

图3b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之组成基因Pikp3之RNAi T₀转化体基于载体特异性标记的PCR检测图。

图中泳道1：分子量标记DL2000；泳道2：H₂O，阴性对照；泳道3：空载体，阳性对照；泳道4-15：RNAi T₀转化体。其中，所有的感病个体(S)都检测到了载体特异性标记(pMCG)的PCR扩增产物，说明RNAi构建体已经整合到受体品种K60(含有Pik-p)中，由此干涉(抑制)了该基因的表达而表现感病；抗病个体(R)没有检测到载体特异性标记(pMCG)的PCR扩增产物，说明RNAi构建体没有整合到受体品种K60(含有Pik-p)中，由此该基因的表达没有受到干涉(抑制)而表现抗病。

图3c.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之另一个组成基因Pikp4之RNAi T₀转化体基于载体特异性标记的PCR检测图。

图中泳道1：分子量标记DL2000；泳道2：H₂O，阴性对照；泳道3：空载体，阳性对照；泳道4-18：RNAi T₀转化体。其中，所有的感病个体(S)都检测到了载体特异性标记(pMCG)的PCR扩增产物，说明RNAi构建体已经整合到受体品种K60(含有Pik-p)中，由此干涉(抑制)了该基因的表达而表现感病；而抗病个体(R)都没有检测到载体特异性标记(pMCG)的PCR扩增产物，说明RNAi构建体没有整合进受体品种K60(含有Pik-p)中，由此该基因的表达没有受到干涉(抑制)而表现抗病。

图3d.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之组成基因Pikp4之RNAi 2个T₁转化系基于载体特异性标记的共分离鉴定图。

上图和中图为RNAi T₁转化系KP4RNAi-28；下图为RNAi T₁转化系KP4RNAi-3。3个图中，泳道1：分子量标记DL2000；泳道2：H₂O，阴性对照；泳道3：空载体，阳性对照；其余泳道：RNAi T₁转化个体。结果表明，所有的感病后代个体(S)都检测到了载体特异性标记(GUS)的PCR扩增产物，而抗病个体(R)都没有检测到载体特异性标记的PCR扩增产物，说明2个RNAi T₁转化系后代个体的基因型与表型共分离。

图4a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之组成基因Pikp3的基因结构图。

图中浅色方框表示5’和3’-UTR；深色方框表示外显子；线条表示内含子；KP3RNAi1和KP3RNAi2表示RNAi干涉所用片段及其对应的蛋白质编码区。

图4b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之另一组成基因Pikp4的基因结构图

图中浅色方框表示5’和3’-UTR；深色方框表示外显子；线条表示内含子；KP4RNAi、KP4 RNAi1和KP3RNAi2表示RNAi干涉所用片段及其对应的蛋白质编码区。

图5a.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之组成基因Pikp3编码的氨基酸多肽序列结构图。

图中CC结构域中的黑体字表示形成CC motif的氨基酸，NBS区域的黑体字表示NBS中保守的氨基酸序列。LRR区域后面还带有一段CNL(C端非LRR区域)氨基酸序列。双下线标示的4个氨基酸序列为等位基因特异的氨基酸替换(substitution，与已被克隆的Pik-m基因相比)。

图5b.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p之组成基因Pikp4编码的氨基酸多肽序列结构图。

图中CC结构域中的带下划线的黑体字表示形成CC结构的氨基酸，NBS区域带下划线的黑体字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域。双下线标示的3个氨基酸序列为等位基因特异的氨基酸替换(substitution，与已被克隆的Pik-m基因相比)。

图6.水稻稻瘟病抗性基因Pik-p表达特性的定量RT-PCR检测图。

上图为组成基因Pikp3在不同的接种时间点(0hr，12hr，24hr，72hr)的相对表达水平，由此可以看出，该基因呈逐步上调后而下降的表达类型。上图为另一个组成基因Pikp4在不同的接种时间点(0hr，12hr，24hr，72hr)的相对表达水平，由此可以看出，该基因呈下调后上调而又下调的表达类型。2个组成基因都表现为组成型表达，因为接种之前和之后都能检测到2个基因的表达。

图7.利用水稻稻瘟病抗性基因Pik-p特异性分子标记的基因型鉴定图。图中，M：分子量标记DL2000；P1：抗性品种K60的基因型(Pikp/Pikp)；P2：感病品种AS20-1的基因型(pikp/pikp)；R1和R3：抗性个体的杂合基因型(Pikp/pikp)；S1，S2，S3，S4：感病个体的基因型(pikp/pikp)；R2：抗性个体的纯合基因型(Pikp/Pikp)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明的实施例部分，我们阐述了Pik-p基因的分离过程(图1)和该基因的特点，分离的Pik-p基因能够与适当的载体连接，转入植物体中，使该植物体带有一定的抗性。

实施例1：抗性基因Pik-p的抗性特征

首先，为了比较和明确在Pik位点上4个等位基因(Pik，Pik-p，Pik-s，Pik-m)的抗谱，利用从广东(60个菌株)，福建(40个)，湖南(40个)，贵州(60个)，云南(43个)，四川(66个)，江苏(72个)，辽宁(108个)，吉林(60个)，黑龙江(63个)，收集的总计612个菌株对上述4个等位基因所持品种(分别是Kusabue，K60，Shin 2和Tsuyuake)进行了抗谱比较分析。结果表明，Pik-p基因表达了与其他3个等位基因不同的抗性反应；该基因在广东(96.7％)、江苏(90.9％)和四川(90.9％)表现高水平的抗性，由此说明该基因至少可在上述地区使用(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)。其次，利用上述612个菌株对Pik-p基因与目前中国水稻抗稻瘟病育种计划中常用的抗源基因(Pi1，Pi2，Pi3，Pi4等)进行了抗谱比较分析。结果表明，Pik-p基因表达与这些抗源基因差异明显的抗性反应，由此说明该基因可在上述育种计划中与这些抗源基因聚合使用，以获得更广、更持久的抗性(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)。

实施例2：水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的遗传分析及初步定位

本发明对由粳稻抗病品种K60与2个籼稻感病品种AS20-1及Kasalath的杂交组合由来的F₂群体(F₂-1和F₂-2)，接种对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株M028(稻瘟病菌单一孢子分离的菌株)。结果表明，这2个F₂群体中抗病植株与感病植株的分离比都符合3∶1。由此推断，K60所表现的对接种菌株M028的抗性是由一对显性基因控制的。对这2个F₂群体对应的抗性基因进行连锁分析，结果表明它们受同一显性基因控制，因此，构建了由这2个F₂群体由来的340个体和341个体组成的一个作图群体(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)。

前期的遗传分析表明Pik-p基因与Pik-m基因是等位的，而Li et al(2007，Molecular Breeding，20：179-188)对Pik-m基因进行了精细定位。因此，申请人首先利用Li et al(2007，Molecular Breeding，20：179-188)开发的微卫星(simplesequence repeat，SSR)标记(RM254，RM456C，RM224，RM7443，RM5926)，进行分离群体分析(bulked-sgregant analysis，BSA)。结果表明，只有最靠近端粒的RM5926在2个群体中都表现连锁性多态，并分别鉴定到了28和14个重组体(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)。然后，选择Li et al(2007，Molecular Breeding，20：179-188)开发的靠近着丝粒的分子标记K37进行连锁分析，分别获得了3和2个重组体。根据上述结果推断，Pik-p基因位点被界定于RM5926——K37之间，其中鉴定到了总共47个不同的重组体。

实施例3：水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的精细定位及电子物理作图

为了缩小Pik-p位点的染色体区域，进一步在RM5926——K37区域内，从Li等(2007)开发的9个标记中获得了7个多态性标记(RM144，K25，K15-2，K22，K28，K34，K39)。这些多态性标记对上述47个不同的重组体进行连锁分析的结果表明，Pik-p基因被界定于K28——K39之间约0.67cM的区域内。为了进一步缩小Pik-p位点的染色体区域，在K28——K39区域内开发了4个多态性标记(K33，K40，K41和K42)，结果表明，这4个标记都与Pik-p位点表现完全的共分离。因此，Pik-p位点最终被界定于K28——K39之间约0.67cM的区域内，其中4个标记与之完全共分离(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)。

为了构建Pik-p位点的电子物理图，把与之连锁的标记通过生物信息学方法着陆于水稻品种Nipponbare的参考序列上，并由此构建了该基因位点的重叠群。由参考序列可以推测Pik-p位点被界定于侧翼标记K28和K39之间约126kb的范围内(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)。

实施例4：水稻稻瘟病抗性基因Pik-p候选基因的注释及序列分析

为了确定Pik-p的候选基因，申请人利用日本晴的参考序列，通过3种基因预测软件RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)、Gramene(http://143.48.220.116/resources/)和Softberry的FGENESH(http://www.softberry.com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了Pik-p的候选抗性基因为4个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(nucleotide binding site-leucine-rich repeat，NBS-LRR)的候选基因(KP1，KP2，KP3和KP4)。

对4个候选基因进行基于基因特异性标记的存在/缺失(presence/absence，P/A)分析，结果表明，在日本晴参考序列存在的2个候选基因(KP1和KP2)在K60中是不存在的。因此，将KP3和KP4通过以下的基因功能互补实验确认其功能。

实施例5：水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的正向遗传学互补实验及转化体的抗性鉴定

首先，利用高保真酶phusion结合长片段PCR(long-range PCR，LR-PCR)技术，以K60(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)的总DNA为模板，根据或参考Liu et al.(2007，Genetics，176：2541-2549)和Lin et al.(2007，Genetics，177：1871-1880)描述的实验方法和程序，分别扩增、克隆了KP3(正向引物：术，以K60(Wang et al.2009，Phytopathology，99：900-905)的总DNA为模板，根据或参考Liu et al.(2007，Genetics，176：2541-2549)和Lin et al.(2007，Genetics，177：1871-1880)描述的实验方法和程序，分别扩增、克隆了KP3(正向引物：TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA；反向引物：TTTTGGCGCGCCGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTC)和KP4(正向引物：TTTTGGCGCGCCGCAAGATCAGTACCATCACGAGTAATAGCA；反向引物：TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG)，并进行了遗传互补实验，结果表明，这个2个候选基因都没有在感病受体品种Q1063(Lin et al.，2007，Genetics，177：1871-1880)中实现功能互补(表1；图2a，2b)。此外，对KP4进行超表达(overexpression，OX)分析，也没有获得功能互补的转化体(表1)。

表1.Pik-p 2个组成基因的正、反向遗传互补实验分析

^a候选基因/构建体的缩写作：KP3，Pikp3；KP4，Pikp4；KP3+4，Pikp3+Pikp4；OX，过表达；RNAi，RNA干涉(RNA interference)。

^b正向遗传学构建体转化到高度感病的品种Q1063中；反向遗传学构建体转化到Pik-p供体品种K60中。

^c来自各个构建体的T₀植株接种对Pik-p无毒性的菌株CHL381。R，抗病；MR，中抗；MS，中感；S，感病。

^d正向遗传学构建体的功能互补成功率(％)为，R+MR/R+MR+MS+S*100；反向遗传学构建体的功能互补成功率(％)为，MS+S/R+MR+MS+S*100。

有趣的是，当将上述2个候选基因拼接为一个整体的基因进行遗传互补实验时，则获得了功能互补的转化体(表1；图2c)。利用转化载体中的GUS和潮霉素基因(HPT)标记对转化体进行了PCR检测。检测结果证明目基因片段已经导入这些转化体中。部分的阳性个体可能是由于外源基因的整合等问题，在受体品种中并没有得到充分的表达而表现感病(图2d)。

6：水稻稻瘟病抗性基因Pik-p的反向遗传学互补实验及转化体的抗性鉴定

申请人利用反向遗传学(RNAi)手段，对候选基因进行了进一步的功能验证分析。利用PCR技术扩增了一个含Pikp4 cDNA部分序列的516bp的片段(正向引物：CACCTTGAGCTGTCCGGCAAGTT，反向引物：CAGTGACGATGCCATCAACAA)并将其克隆至双元RNAi载体pANDA中(Mikiand Shimamoto，2004，Plant Cell Physiology，45：490-495；构建体命名为KP4RNAi)，导入了农杆菌菌株。同样地，利用PCR技术扩增Pikp4 cDNA其他位置745bp (正向引物：TTTACTAGTGGTACCTCAGCGGTATCCGTGGTG，连续3个T为保护碱基，下划线表示为方便载体构建添加的2个酶切位点Spe I-Kpn I，反向引物：TTTGAGCTCGGATCCGCGCCTGAGGTGAGGTTCT，下划线表示为方便载体构建添加的2个酶切位点Sac I-BamH I，下同)，586bp(正向引物：TTTACTAGTGGTACCTCACCGATGACGAGTCCC，反向引物：TTTGAGCTCGGATCCTGCCAGTGTCCACCAACC)的片段并将其克隆至另一个双元RNAi载体ds-pC1301(Yuan et al.，Planta，2007，226：953-960)上(构建体命名为KP4 RNAi1和KP4RNAi2)。运用相同的技术和方法构建了Pikp3基因的RNAi构建体750bp(正向引物：TTTACTAGTGGTACCTGGCCAGATCTCCCAATCGT，反向引物：TTTGAGCTCGGATCCTGTGCCTGTGCAGGCTCAGT)和489bp(正向引物：TTTACTAGTGGTACCTTCAATAGCTGAGAAGTGCC，反向引物：TTTGAGCTCGGATCCCCAAAGTAACCTTCTGCTTC)分别命名为构建体KP3RNAi1和KP3RNAi2)。然后，分别将上述构建体按照上述方法，对由抗病品种K60成熟种子诱导的愈伤组织进行了遗传转化，分别获得了248，261，403，411，467株的转化体，功能互补的成功率分别为47.2％，32.2％，15.1％，36.5％，22.0％(表1；图3a)。利用转化载体中的GUS基因及多位点克隆位点(pMCG)标记对转化体进行了PCR检测，结果表明，构建体已经导入这些转化体中，而且上述标记的基因型与表现型(抗、感)完全共分离(图3b，3c，3d)。也就是说，在抗病品种K60的遗传背景下，因为RNA干涉而抑制抗性基因Pik-p表达，使之表现为感病。

上述正、反遗传学的功能互补实验结果表明，抗性基因Pik-p由2个基因Pikp3和Pikp4组成才能表现其功能。

实施例6：Pik-p基因的结构

采用移步法对Pik-p的DNA序列进行了测定。利用RACE技术，获得了Pik-p的全长cDNA序列并对其进行了测序。Pik-p基因DNA长度为16.9kb(包含Pikp3和Pikp4)，其中，Pikp3的全长cDNA序列为3652bp，含有一个3429bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为60bp和163bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有2个内含子和3个外显子(图4a)。另一个组成基因Pikp4的全长cDNA为3613bp，含有一个3066bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为264bp和283bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有1个内含子和2个外显子，而在5’非翻译区内有一个内含子(图4b)。

实施例7：Pik-p抗性蛋白的结构

Pik-p基因包含的2个组成基因编码的蛋白序列如序列表中Pikp3 SEQ ID No.3和Pikp4 SEQ ID No.4所示。Pikp3基因编码1个由1142个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为126.65KD，等电点为6.12。利用COIL分析表明该蛋白多肽有CC(coil-coil)结构域。Pikp3蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase1a(GLPGGGKTTVAR)位于该多肽的第291个氨基酸残基；kinase 2(KKYLIVIDDIW)位于该多肽的第377个氨基酸残基；kinase 3a(DLGGRIIMTTRLNSI)位于该多肽的第402个氨基酸残基。而该蛋白的C-端的610-960个氨基酸残基为16个不完整LRR重复，其亮氨酸含量为14.0％，其C末端还有个非LRR结构(CNL)的氨基酸序列(图5a)。图中双下线标示的4个氨基酸序列为等位基因特异的氨基酸替换(substitution，与已被克隆的Pik-m基因相比)。

Pikp4基因编码1个由1021个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为114.57KD，等电点为8.64。利用COIL分析表明该蛋白多肽没有CC(coil-coil)结构域，但是利用更为强大的预测工具Paircoil2分析发现有CC结构域。Pikp4蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GFGGVGKTTIA)位于该多肽的第212个氨基酸残基；kinase 2(KSYILLIDDIW)位于该多肽的第330个氨基酸残基；kinase 3a(GGRIIVTTRFQAV)位于该多肽的第359个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的610-960个氨基酸残基为13个不完整LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％(图5b)。图中双下线标示的3个氨基酸序列为等位基因特异的氨基酸替换(substitution，与已被克隆的Pik-m基因相比)。

实施例8：Pik-p基因的表达特性分析

利用定量RT-PCR技术对Pik-p基因的表达模式进行了分析。在抗病品种K60接种后不同的时间点(0hr，12hr，24hr，72hr)上采集叶片并提取其总RNA，利用反转录试剂盒SuperScript^TMReverse Transcriptase II进行反转录cDNA第一条链前合成。RT-PCR的引物为，

KP3RT-F：GAAGCTCTGATCAACGGTATTCC，

KP3RT-R：TCTTTGATCATCTTCGGGATACG；

KP4RT-F：TGAACTTCCACGATTGGATCCAC，

KP4RT-R：ACATGGTTCTTGAATACATCATGTC。

实时定量RT-PCR使用CFX96 Real-time PCR检测系统和SYBR Premix Ex Taq试剂盒(宝生物公司)，操作按照试剂盒说明进行。实验结果表明，抗性品种在上述不同的接种时间点上均能扩增出特异的片段，说明Pik-p基因的2个组成基因均能在叶片组织中表达，即属于组成型表达的基因(图6)。

实施例9：转化Pki-p基因产生的抗性植株的应用

将Pik-p基因克隆到植物转化载体pCAMBIA1301，导入农杆菌菌株EHA105中，用于转化感病的水稻品种Q1063，获得了405株转化植株，其中82株表现抗性反应(表1)。这说明可以用pik-p基因转化水稻感病品种，经过自交、纯化选择等一系列育种程序之后，即可产生抗病品种而应用于生产。

实施例10：Pik-p基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用

利用本发明提供的Pik-p基因序列信息可开发基因特异性分子标记，用于鉴定Pik-p位点上的各种基因型，即Pikp/Pikp、Pikp/pikp和pikp/pikp的植株，这些信息可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用，以提高育种的目的性和效率。

本例根据Pikp3序列开发的基因特异性标记(CRG11F：GACGTCGTGAAGAAAGAAGC；CRG11R：CAATGTTTTCACTGCT CCCGT)对2个亲本及其杂交F₂后代个体基因型的鉴定。结果如图7所示，抗性个体R2与亲本P1的电泳结果相同，两者基因型相同，均为纯合基因型(Pikp/Pikp)。

序列说明

SEQ ID NO.1&2是Pikp3和Pikp4的核苷酸序列，SEQ ID NO.3&4是SEQ ID NO.1&2的编码产物，SEQ ID NO.5&6是带有启动子的Pikp3和Pikp4核苷酸序列，SEQ ID NO.7&8和SEQID NO.9&10是分别用来扩增KP3和KP4的引物对，SEQ ID NO.11&12是扩增Pikp4 cDNA序列的一个516bp片段的引物对，SEQ ID NO.13&14和SEQ ID NO.15&16分别是引物对KP3RT-F、KP3RT-R和KP4RT-F、KP4RT-R，SEQ ID NO.17&18是引物对CRG11F&CRG11R，SEQ IDNO.19～24分别是Pikp3的kinase 1a、kinase 2、kinase 3a序列以及Pikp4的kinase 1a、kinase 2、kinase 3a序列。

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序列表

<110>华南农业大学

<120>稻瘟病抗性基因Pik-p及其应用

<130>KHP09113305.2

<160>24

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>8096

<212>DNA

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(60)

<220>

<221>CDS

<222>(61)..(624)，(775)..(1342)，(4114)..(6410)

<220>

<221>3’UTR

<222>(6411)..(6573)

<400>1

gagagtagca ctcaacgcaa aaggggatcg gccgagccgc cgatcgaggc gcgagtaggg 60

atggaggcgg ctgccatggc cgtaaccgca gccacggggg ccttggcgcc cgtgctagtg 120

aagctggccg ctttgctgga cgacggggag tgcaatcttc tggaggggag ccggagcgac 180

gcagagttca tcagatccga gctggaggcc gttcattctc tcctcacccc aaatatcttg 240

gggaggatgg gggatgacga tgcggcgtgc aaggatggct tgattgcgga ggtccgggag 300

ctgtcctacg acctggatga tgccgtcgac gacttcttgg agctcaattt cgagcagcga 360

agaagcgcaa gccctttcgg tgagctcaag gcaagagttg aggagcatgt ctccaatcgc 420

ttctctgact ggaagctacc ggcggcgagc cttccgccgt cgtcggtaca ccgccgagct 480

ggcttgccgc caccagatgc agagctggtg gggatggaca aacgtatgga agagctcacc 540

aaattgctgg aacaagggag caatgatgct tcacgatggc gcaagcgaaa accgcatttc 600

ccgctcagaa aaacagggct aaaggtacgg ttggatctcg attcttcaca aatatagctt 660

cctccgatag cagtgccaat gaatttgttt acttctctct tgattcttta atttggaagt 720

actgtataac aaacatggag ggatcgtcat ttaacttaat tttttttgtt gcagcaaaaa 780

atcgtgatca aggttgccat ggagggcaat aattgccgtt caaaagcaat ggctttagtt 840

gcgagcactg gaggagtgga ctcggttgcg ctcgtaggtg atctaagaga caagatagag 900

gtggtcggtt atggcattga ccccatcaag ctgatctccg cgctccggaa gaaggtgggc 960

gatgcggagt tgctgcaggt cagccaagca aataaagatg tgaaggagac gacgccgatg 1020

cttgcgccgg tgaaatccat atgtgaattt cacaaggtca aaacagtttg catccttgga 1080

ttgccaggtg gaggcaaaac aacggttgcc agagaattat atgacgcctt gggaacgcac 1140

ttcccatgcc gggttttcgt gtcagtctct ccaagttcta gtcccagtcc caatctcaca 1200

aagactcttg cagacatttt cgctcaagca caactaggag taaccgatac acttagcaca 1260

ycatatggtg ggagtgggac cgggagagct cttcaacaac atctcatcga caacatatca 1320

gctttcctcc tcaacaaaaa gtaagcaata tcttatatct cttatctagc ttgtccttaa 1380

tccggcttcc caaattaaag tgaacaggct atatgtccat ataatgttgg gttttttttt 1440

tctgtcctcg atgaggtata tatcaagata tgccaaactt tttttaatta gcgttacttt 1500

attctaccta gtaaatagat acagaaatgg ggcaggcccc tcctttgtga caggccaatg 1560

gttttatgat gtggaaacaa ctcccttatc actgaagctc ttgctattac tcgtgatggt 1620

actgatcttg caaaggcttg cagtatttgt aaatccacag ggagtggtca tctttttttt 1680

tttaagataa tgaatagaaa tctggcctct atatagaaag ccaaaggtta cacaagtgca 1740

tacactccaa atctcaaagc tgagaaacac gaaaaacaaa cgaccaaaaa gaaaagacga 1800

taagattaag tttcaagctt ttcctccttg cttcagaaaa cagggaaatg cagagctagc 1860

ccgctcttcc cctgccatgc cctctcactg ccattgcaac taccacaaaa gctcccctgt 1920

ttcgccgtga gcgaagggag gggatggaac tagtctgctg ctttgttgtc gccaagcact 1980

ggtttcatgc tgcccaaaca acctatgccc cgctagcgat aacgagtctg ttgccgccat 2040

gctgttgtcg ctggagagca cttgtcgctg ctcagctatg tgttaagtaa gctactaaca 2100

atctctccat tctcttgtag actgcttata aaagattgta cttcaacttt ttattaatga 2160

aatagagttc ctgccttaca acaacaagaa cgagagagag agagagagcc aatatcacga 2220

gttagcactg tgaagacttc ctgactgtta tgtcttcaag aacagtataa aagcatttgc 2280

cactataaaa atatgatagc cctcaagatc attaaaaata tgtcatgttc ttttaccttc 2340

ataacaacca gtatcacaaa tatgaaaaca tttaaaggaa aatcagtatt tgccatttat 2400

gtaaagaaaa actagactag aactctgggc ttttatttta gtgcacactg tatacatgtg 2460

tgttctttga cgtatatact tgatattttt tcaaaaactt ttgggggcat atctgtaacc 2520

catgccccat gcatccaaag tagtagtgag acaactttcg tatcaatgga catgtggcat 2580

taaatttaat cccaatattt gttctctcga agtcctgaac atataattgg acaaaattat 2640

ataatttaat taggccaatt gagccatata tacacacact ataagaaact tctacaaaac 2700

aaacattcgc tccttttagg ttttgaccag tctatacatg aaccagccaa cggtgtgctg 2760

gtctgactat aaatgttttt ttagagagta aaggcacctt ccagtacctc tctcgaggac 2820

agtaaaaaca cccatgcttt aaggttatga acaacaaagc atagaacaac cacaagaaaa 2880

aaaaaaacaa ctagaacaag ttctggaact agttagggat tcgggaagcc attgcttgct 2940

ggcttgggac aagctatgcc tgccattgga ctatggtgga gactgggcat aaaggatctc 3000

aatctcttgg agattggcct atgtcctagg tggccatggc tgactgcaag gagatatatt 3060

tcttgcaacg gaaattttca ttgcaaaagc tgaaaatcgt tgcgatatgt acctattgtg 3120

acataattga atccattggg agccgtagca ataaatcccg tggtaatagg ctattgcaat 3180

gattttccga tggttgcata aaaaggtgct attacaatgg ttttgcattg ctattgcaac 3240

aacttgatat gtcataggta tttattgcaa cagtttgtac catgctgcaa taagatttcg 3300

caacacagac ctattcatta aatagcctat ttccacacat tcatttttgt ggcaataatt 3360

cagtgcgaca agcatgttct atagctataa cctgatgcaa cgggttagac ttgttgcagt 3420

aacttattag cacatttaat tttttactaa atttatattg attcaactat ttcaacatca 3480

ttcaatacag taaatactgg aaaatgcaag caatctccaa aaattcacca ataagagaaa 3540

cgaattaaat catatacaca attatttcac accgtacagt gcacttaagt gtaggaaata 3600

taatgctata tacatttcca accctcaata caggttctgt aaataatgaa aagaaacatc 3660

aatttgattt cttgaccggt ccctctgaga cacacagtgc tttcctcagc aacatcgttg 3720

ccgatctatg taacttgtaa actccttgtg cttaataaat tctggccagg gttacttcag 3780

cctgcatggc gaaaaaaaag aacttgttag ggagatcgca aacaaatgtt agctgcccca 3840

tttcttctct actgaccata aaagctctag gatcaggtca tgaaaacaat gccgtcagac 3900

cggaaatact caagattcag aacacgactc ctaggaactg caagtttaaa tttcaacaaa 3960

agcaaaatac aaccagatga caaactaata tatatcagct gactgttcat ctcaagtgga 4020

ctcacatctg tgaaattgtt agttctatgc atatatgcta atgtaatact aatatgctat 4080

tgaggcttat tactcttctc gacttttata ggtatctcat tgtaatcgat gacatttggc 4140

attgggaaga atgggaagtc atcagaaagt ccattcccaa gaatgatctg ggtggtagaa 4200

taatcatgac tactcgtctt aattcaatag ctgagaagtg ccacactgat gacaatgatg 4260

tttttgtcta cgaagttggg gatctagata ataatgatgc tttgtcgttg tcttggggga 4320

tagcaacaaa gtctggggca ggcaacagga tcggaactgg agaggataat ccatgctatg 4380

atattgtgaa catgtgttat ggtatgcctt tagcacttat ttggctgtcg tcagcattgg 4440

ttggagagat agaagaatta ggtggtgctg aagtgaaaaa atgtagggat ttgagacaca 4500

tagaggatgg tattttggac atcccatcct tacaaccatt ggcggagagt ttatgccttg 4560

gttataacca tcttcctctt tatctgagga ctttgttgtt gtactgtagt gcataccatt 4620

ggtctaacag aatcgaaagg ggtcgtctgg tcaggaggtg gattgcggaa ggatttgtgt 4680

cggaagagaa agaagcagaa ggttactttg gcgagcttat taacagagga tggattacgc 4740

agcacggaga caacaacagt tataattact atgagatcca ccccgtgatg ctggccttcc 4800

tgagatgcaa gtccaaggag tacaattttt taacatgctt gggtctggga tctgatacta 4860

gtactagtgc atcctcccca aggttgattc gccggctgtc tcttcagggg gggtatccag 4920

tggactgctt gtcaagcatg agtatggatg tgtcacacac ttgcagcctt gtcgtccttg 4980

gtgacgtggc gcgacccaag ggaatcccct tctatatgtt taagcgcttg cgagtgttgg 5040

accttgaaga taataaggat atacaggatt ctcatctgca gggcatatgt gaacagttaa 5100

gcctcagagt gaggtacctt ggtctcaagg gaacgcggat ccgaaagctc cctcaggaga 5160

tgaggaagct gaagcatttg gagattttgt atgtggggag cactcggatc agtgaacttc 5220

cgcaagagat tggagagctg aagcatctgc ggattctgga cgtgagaaac acggacatca 5280

ctgagctccc actgcagata cgggagctgc agcatctgca cactctggac gtgaggaaca 5340

ctccaatcag tgagctcccg ccgcaggttg gcaagctgca gaatctcaag attatgtgcg 5400

tgaggagcac tggggttagg gagctcccaa aggagattgg ggagctgaat catctacaga 5460

ctctggacgt gagaaacacg agggtgagag agctgccatg gcaagctggc cagatctccc 5520

aatcgttgcg cgtgcttgcc ggtgacagtg gcgatggcgt gcggttgccc gaaggcgtct 5580

gcgaagctct gatcaacggt attccagggg ctacgcgtgc aaaatgcagg gaggttctgt 5640

ccatcgcgat catcgatcgt ttcggacctc cccttgttgg gatattcaaa gttcccggca 5700

gtcatatgcg tatcccgaag atgatcaaag accacttccg cgttctttct tgcctagaca 5760

tcaggctctg ccacaagctt gaggatgatg accaaaagtt cctcgccgag atgcccaacc 5820

tgcagacgct cgtgctgagg ttcgaggccc taccaagaca acccataacc atcaacggca 5880

caggcttcca gatgctggag agcttccgtg tcgacagccg ggtgccaagg atagccttcc 5940

atgaagacgc catgcccaac ctcaagcttc tcgagttcaa gttctacgcc ggcccagcaa 6000

gcaacgatgc catcggcatc accaacctga agagcctcca aaaggtggtc tttcggtgct 6060

cgccatggta caagagcgac gcccctggca tcagcgccac cattgacgtc gtgaagaaag 6120

aagccgagga gcatcccaac cggccgatca ccctcctcat caatgctggg tataaggaga 6180

tatcaactga gtcacacggg agcagtgaaa acattgcggg cagcagtggg atcgatactg 6240

agcctgcaca ggcacagcat gataatctcc ctgctgttcg agatgactac aagggaaaag 6300

ggattcttct tgatggcagg tgtcctacct gcggccgagc gactaaaatt gaagaggaaa 6360

cccaagatcg agtagcagat attgaaattc aaacagaaac tactagctag ctagtaccgc 6420

tgtctaattt tatttgtatt aaatactctc cttcatgtaa tactctaagt ccccgctcaa 6480

tttttcttgc ctccgcaact ctacatgata ctcaaaactg atttcttacc tccctttgat 6540

tgtagaaaaa acatgggaag tttggaggat ttcaatccta tgaaaaggac tttgagaaac 6600

aaattacgga atcctatctt ttcctttaaa agatatataa tagaaaatcc tatagagatt 6660

tttataggaa agttaacaaa agcctcaatc ttatggagaa ttcctgtgtt tatttgcata 6720

gaggaaagtg agactcacct aatcaggggc ggttctagtg ggtggtccag gtgatccctg 6780

gaccacccta aaatttggcc catgagaacc gccccccccc tcctcctccc ggggttggtc 6840

gaaaccagaa aaaaggccac tgagctaagc tagggttagg gagaggtgta gccatgaact 6900

agccacagca gcacgcatcg ctggctgccg cctccgcctc tgcgtcagcg ccagcgtgcc 6960

gtctccccgg ctctcgactc tgcctccgcc tccgccttgg cgccgatgcg tcgcctcctc 7020

ggctcccgct tctacctcag cgccagcgtg ccgcctccgc cttagcgccg cctcctcgcc 7080

tcctcccttc cccgactcct ccagtccccc actcctgtcg gttgctatcg tcggcgggcg 7140

gcgaccaacg cctacaagcc aactacggct gcctgggcaa gccggcggcc acccccgccc 7200

ctggaaaggg aaaacattgc cattccacag gcggcgccag gtcccctttc tctctagctt 7260

tcttgttgct cagcaaagtt caaaggtcag tagacatttc ttgttggttt tttgcaatgt 7320

tgccctatgc agtagtgagt agtcagtact cagtagtagt gctagtgaaa aatttctgcc 7380

ttgagtgtag tgaaaagcaa gctgagaaat agcatgtgtg acaaattatt aaatgatggt 7440

ttaatcacat ctattgagcg ggttattttc tctcaagtta gcaaagaaga cattatgcat 7500

aatttcatgt ctatatatga acggagagta gaaaagaagt agggttttgt aatcttctac 7560

ttatctatta taagatattt gaatgattat gttctaactt tcgtaacttc aaatttagat 7620

gttggtttta agcaagttgt gatgttgtga gatatattgc tacatttcaa ttatattttt 7680

attatttttg acacatttgg cttgaatttg taacaatgtg acaatttgga gcatcaagta 7740

ggactacccg acgattcatg aaaccaatgt gccgatattt agcggttctt aatcatactg 7800

aggtaagaag gcaacatttt gcaaaagtag aatttcttca tgaaaatcag gcttatagct 7860

ttaatgttca caaactagct aagtttcctt gtaccttaga ggaggggcat catgttcgat 7920

tctcaaatac tccttgtaat ctaagtagga atgtaaataa tttggttgtt aatgaataaa 7980

atgccagaat tttattctaa aagaatatgt aattcaaatt aatattattc tagatgtatc 8040

ttgaatagcc cattagcact ggaccagtct ttcaagttgg gtcagtggtc ggtacc 8096

<210>2

<211>7543

<212>DNA

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(155)，(1037)..(1145)

<220>

<221>CDS

<222>(1146)..(2137)，(2302)..(4375)

<220>

<221>3’UTR

<222>(4376)..(4658)

<400>2

gcctggccag ctctggtcgg aggagggttc agttccatgg gtgcgccccc tgcccatccc 60

tccacttcta ctttcgtctt gagatctcgc cgtttctgat ctccttgcca tggcaaccag 120

ttgatttggc tgccaagatc gtccgtgctt tgcaaaggtg aacaatcttt ttcttcttgg 180

gctttcactt tgttgtgtta atagactcag cgccgtcgca acttgcaaat aaaaaggttc 240

agatcggaaa atggaaatac cgtacacagt agtctataga gaatcgacta gtatttcctg 300

actgtaagta aggaagttgt aggtaccatg ttctgatgat tatctttgaa gcttggaggg 360

ggacaaaaag ttgggagaga aacaagaatg tatttgttca cttgattggg ggcagtaggt 420

aaaatctcag cgttaggaat ttgcacctct ttattaagtt tgactaaatt tatagaaaaa 480

aattagcaac acttaaaaca ccaaattagt ttcattgaat ccaacattga atatattttg 540

ataatatgtt tactttgtgt tcaaaatgtt actatatttt tctataaatt tgatcaaatt 600

tcaataagtt tgactagaaa aaaaagtcaa accgacttat aatatgaata taaatggagg 660

gagtagatta taaattatct ttattataat actttgagtg tacaaacgaa tgaataaagt 720

ttacaaagtt gaaaagttat ttttaaatac tattccgata aacctgtata tagagaactt 780

gtgaaaaaaa acaccgtttg aaatgtgtct gtgataatct ataagaggaa cggggcctaa 840

atatattcct tttttcctac gaaaatgcaa gaagtattgc ctaatatatt gatagagctg 900

aagttttaaa gtaaaatgaa acatttgcat gaggcagcac tggacaaaaa gcgcttgtga 960

aaaaaatatg ttccaaatat tattaattca ttcatggtat ggtctttatt ttcattttcc 1020

ccccttatcc atgggcagga cacggaaatt ctcagcaggt tcgcgcttga tctgaactgt 1080

ctgtggctca tactctcttg tgcttgcgcc agctgaaagt tgcagtgaga agtacagaga 1140

acaagatgga gttggtggta ggtgcttccg aagccaccat gaaatctctc ttgggcaagc 1200

tgggcaatct tctagcccag gagtatgctc tcatcagcgg tatccgtggt gacatccagt 1260

acatcaatga cgagcttgcc agcatgcagg ccttcctccg tgatctcagc aacgtgccag 1320

agggtcacag tcatggccac cggatgaagg actggatgaa gcagatccga gacatcgcct 1380

atgatgttga ggactgtatc gatgactttg cccaccgcct ccctcaggat tccatcagcg 1440

atgccaaatg gtccttccta ctcacaaaaa tctatgaact atggacatgg tggccacgtc 1500

gtgtgattgc ttccaacatt gcccaactca aggtacgggc acaacagatc gcagatcgac 1560

gtagtagata cggagtgaac aacccagaac accttgacag tagcagcagt gccaggaccc 1620

gtgctgtcaa ttacgaaatt gctgagtatc aggtcacaag ccctcagatc attggtataa 1680

aggagcctgt ggggatgaag acggtcatgg aggagcttga ggtttggtta actaatcctc 1740

aagctgaaaa tgggcaagct gttctgtcca tagtcggttt tggaggtgtg ggaaagacta 1800

ccattgccac agcattgtac agaaaagtca gtgataaatt tcagtgccgg gcatcagtag 1860

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atcaggagca gggcagcagc acaacaatta gtgagaaaaa gaacctcacc tcaggcgcta 1980

agagcatgtt gaagacagcc ctgtcactgc tcagaggtaa ttgtatatgt cagccagaaa 2040

atgatggaaa ccctgataat acaccaatca ggctgcagga aacaacggac gatgatcaaa 2100

accccagaaa actggaacag ctcctggccg aaaagaggta cctttttttg taaataaaat 2160

tgctttgctt atctgtaaat taacttactc atcccactct aaatctaatg tttatttcct 2220

tctatacaca gcacaactcc atcttttgaa tgggttttat ttttctcact tgtgctcatt 2280

ttttttttat catctctgca gttatatcct cttgattgat gacatttggt ctgccgaaac 2340

atgggagagt atcagatcga ttttgcctaa aaataataaa ggcggtagaa taatagtgac 2400

tacaagattt caagctgttg gttcaacatg ctcccctctt gaaactgatc gtttgcatac 2460

agttgatttt ctcaccgatg acgagtccca aaacttattc aatacaagta tttgtgaatc 2520

aaagataaga aaagatagca acaaagtaga cgagcaagtc cctgaggaaa tatggaaaat 2580

atgtggggga ttgcctttgg ccatagtcac catggctggt cttgtcgcct gcaacccaag 2640

gaaagcctgc tgcgattgga gtaaactttg caaatcatta tttccagagc aagaaactcc 2700

tcttaccctc gatggtgtta caaggatact ggattgttgt tacaatgatt tgcctgcgga 2760

tctgaagact tgcttattgt acttgagtat atttccgaag ggttggaaaa ttagtaggaa 2820

acgtttgtcc cggcgatgga tagctgaagg ttttgctaat gagaagcaag ggttaaccca 2880

ggaaagagtt gcagaggcat actttaatca actcacaaga aggaacttag tacgtcccat 2940

ggagcatggc agcaatggga aggtaaaaac gtttcaagtt catgacatgg ttcttgaata 3000

catcatgtcc aaatcaatcg aagagaattt tattactgtg gttggtggac actggcagat 3060

gactgcacca agcaataaag tccgtcgact gtcgatgcaa agcagtggat ccaatcgtgg 3120

aagttcaaca aaaggcctga acttggctca agtgagatca ctgacggtgt ttgggaacct 3180

gaaccatatg ccattccatt cattcaacta tgggataata caggtgctgg atcttgagga 3240

ctggaagggt ttgaaagaga gacatatgac ggagatatgt caaatgcttt tactcaagta 3300

tttgagcatc cgacgaacag aaatttccaa aattccctcc aagattcaga aacttgagta 3360

cttggaaact cttgacataa gggagacata tgtcagggac ctgcctaagt caatagtcca 3420

gctaaaacgg atcattagca tacttggagg gaataaaaac acacggaagg ggctgaggtt 3480

gcctcaagaa aaaagtaaga agccaattaa aaacccgtcg cctcaaggaa aaacaaagga 3540

gcccgcaaag aaaggattct tatcccaaga aaaaggtaaa ggcgcaatga aagcactccg 3600

tgtactgtca gggattgaga ttgttgagga atcatcagaa gtagctgcag gccttcatca 3660

gttgacaggg ctaaggaagc ttgccatata caagctcaat ataacaaagg gtggtgatac 3720

cttcaaacaa ttacagtcct ccattgagta ccttggcagc tgtggtctgc agactctggc 3780

catcaatgat gagaattctg aatttatcaa ctcactgggc gacatgcccg cgcctccaag 3840

atatcttgtc gcccttgagc tgtctggcaa gttggagaag ctacccaagt ggatcaccag 3900

catcactact ctcaacaagc taaccatatc tgtaacagtt cttaggactg aaactttgga 3960

gatcctccac attttacctt cattgttttc cctcaccttc gccttttcac ttagtgcagc 4020

gaagcaggat caggacataa taaaggacat ccttgagaat aataaattgg acagtgatgg 4080

ggaaatcgtc attccagctg aaggattcaa gagtcttaag ctgcttcgct tctttgcacc 4140

tttagtgccg aagctcagct ttttggacaa gaatgcaatg ccagcactcg aaatcattga 4200

aatgcggttt aaagacttcg aaggtctatt tggcatcgaa atccttgaaa atctccgtga 4260

ggtgcatctc aaagttagtg atggggcaga agcaataacc aagttccttg taaatgattt 4320

gaaggttaat actgagaaac caaaagtatt tgttgatggc atcgtcactg catgagaagt 4380

aaaattgctg caaatcggag aacttaccaa tcatctgagg cttcccctct attattactc 4440

tcttagaata tattgttatt attgctcacc ttgcaaaata aaatagggat ggcatagcat 4500

attgctacaa cgtaccatgg ttccatcata gttgatttca cttgtcatta cagtgtctgt 4560

tcagttgtgt tttctattaa taaaagggag atctccgcaa gaaaccatta ttatacttat 4620

attcggttat gaactctata aatgatggga ttgctatatt tatggtgcca caatttccat 4680

gagtgcggta tttttttttc tagcagttgg ctggtgttaa gatttgtgct gccattgctc 4740

ctctattatt ggtgcccaaa attacgcttt gcactatgtt cacagttgta aaacttacct 4800

aaatttcgtg tattagtact gtaatgttgt gattttcgcg tccagttata tttttttctt 4860

tgccagaagt ttgatttcaa ggtatatctg gtaagcttca gccggattcg ttaagttttt 4920

agtttaatca gctaaacttt taacagtatg catgcactag tttctcccgt tatcttatcc 4980

aatataatta atgggctaat tggatctatg ccattacaaa catggcaaga ttcagaaaaa 5040

tgctactaca atttgtctat tcatagctgt gctagtgaaa ttttacaaaa ttggaaccgt 5100

gctattgata tcacgttttc catccatctt ttcttttttt tccttttctt ctttatcccg 5160

tcttcttccc gcaccgacga gaggcgagtg gcggcgggac cggcaagcga tggcaggacc 5220

tcggcagctc agtggtggca gcggcaaaag ggaaagggga aggggtagga gagaacctgg 5280

cccgccgacg caagcatgtt ggtcgtcgtc ttccccgagg agcttgagca gtggcaatgg 5340

tagaggaatc caaggaggcc gaggaggttg agcggcacta atggtagagg atgccgagga 5400

ggtcgagcat cagcgagctt gccctgggtg ggcgagtgag ggagagctct cccaagtgtc 5460

tgcgaagctc tcatcttcgt tttcctcatc cccactttgc tcctcttcca ctactgctgt 5520

tgaagctagc ggccctctct caccagatct gggcggagct caagcgaggc gccaccaccg 5580

acgatggagc ttcgcgtgga ccccacagcc tcacccgatt gccatccctc ctaccctcat 5640

cactccatct ccaagcccaa atcccacctc ccccaccggc tcctcctcct cagcccctgc 5700

cgtggcagcc gaggccaccg atgggccaac cctcaacatc gtctcgaagc agctccgcgc 5760

actgtggaag aagcacaacc aaatcctcca gatggaggag tcgctcactg gcgggaggaa 5820

gctgaacaag gagcaggagg aggtgctccg atccaagccc atcgtcatcg cgctcattga 5880

tgagctcgag cggatgcgtg ccctgctcgc cgacgccctc gccgaggagc tctcctcctg 5940

ccccgcccct tccctatctg tcactccctc ctcctccacc tcctccggcg ctgatttgtc 6000

cgtcaaggat ctcctcacgc tcatctactt cggctccctc ttcgacgtca agtcgcagat 6060

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ggtcccgccg ccacttgctt ctcatcggtg cgggaagaag atgggagaaa gaaggaagaa 6240

aacgggaaaa aaaagagatg gatgaaaaac gtgacagcaa tagcacggtt ccaatttcgt 6300

aaaatttcaa tggcaccgct acgaatagaa gaattgtagt agcatttttc tgaatcaaca 6360

tatttgtaat ggcatggatc caataaaccc caaatttatt ttatgccaat acaaatattg 6420

gcaactggtg tcattaacgt ataaatgggt cgcctacata aaaccttccg cgtccttctt 6480

ggttgaacag gtaattaatt gcaaccattt tctgaaaaaa ttgactggaa gtctgaaacc 6540

gtccctgcta ctccctgaat gctttagttc aatctctatg aagctccatc caaacaaaat 6600

ctccagatga tatttcatta aaaacatcat gtccagaact gtccagtatc caagaatggc 6660

tatgatcttt tctgaattct ggactcggga cttatattac atgtatcaaa tccagttatt 6720

ttctggagct acaccagatg aaatcaccaa gtaaaacaat tatataagga tggtgagttg 6780

ttaattaatt acagctttga tagaccactc tgtttgttaa tgcctgacaa gagttcacaa 6840

agaaaaaaat acacaggatt acaaaacttt ttagatacta tctgatgtgt gttaattctc 6900

tcaaatacta tgtacctgaa caaacaagag agaacatgtt gtgaattgtg atctcctcat 6960

gcgagtgacc tgaaactctc tacagggtca gactcctcaa gcatcactgc agcctggaaa 7020

caatcagcag catcattgat cctcccatca ttcctgtgaa ctctccctaa atgaagccaa 7080

gccatcctgt tcgtaggctc aattctcagt gcatcagaga ggaagcatct cgctgcaggg 7140

agataccttg acccttgctt gcagagaagt gcaccaatgg ccaccttgga tggaacatgc 7200

tctagctcta tcgagaatgc gttgacgtag gcagccagtg cctccttgtt ctgatctcgc 7260

gcctcgagca tgaaacctga acttatagca tccacgagtc agattttgat gttgaattca 7320

gttgaatgca gagaattgtc atgttagtgt tacatagaag tggtgaaagt tcaagtttag 7380

ttgagttgat caccttctgc atgcattgtt gcagccgagt aggattttag ggctctagcc 7440

ttctgcagac atatctcagc gtctctccag attgagagac tggagtacag gtttgcaagt 7500

ccttgccata tttcaaactc acttacactg tcattctgtc cct 7543

<210>3

<211>1142

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>3

Met Glu Ala Ala Ala Met Ala Val Thr Ala Ala Thr Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Pro Val Leu Val Lys Leu Ala Ala Leu Leu Asp Asp Gly Glu Cys Asn

20 25 30

Leu Leu Glu Gly Ser Arg Ser Asp Ala Glu Phe Ile Arg Ser Glu Leu

35 40 45

Glu Ala Val His Ser Leu Leu Thr Pro Asn Ile Leu Gly Arg Met Gly

50 55 60

Asp Asp Asp Ala Ala Cys Lys Asp Gly Leu Ile Ala Glu Val Arg Glu

65 70 75 80

Leu Ser Tyr Asp Leu Asp Asp Ala Val Asp Asp Phe Leu Glu Leu Asn

85 90 95

Phe Glu Gln Arg Arg Ser Ala Ser Pro Phe Gly Glu Leu Lys Ala Arg

100 105 110

Val Glu Glu His Val Ser Asn Arg Phe Ser Asp Trp Lys Leu Pro Ala

115 120 125

Ala Ser Leu Pro Pro Ser Ser Val His Arg Arg Ala Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Pro Asp Ala Glu Leu Val Gly Met Asp Lys Arg Met Glu Glu Leu Thr

145 150 155 160

Lys Leu Leu Glu Gln Gly Ser Asn Asp Ala Ser Arg Trp Arg Lys Arg

165 170 175

Lys Pro His Phe Pro Leu Arg Lys Thr Gly Leu Lys Gln Lys Ile Val

180 185 190

Ile Lys Val Ala Met Glu Gly Asn Asn Cys Arg Ser Lys Ala Met Ala

195 200 205

Leu Val Ala Ser Thr Gly Gly Val Asp Ser Val Ala Leu Val Gly Asp

210 215 220

Leu Arg Asp Lys Ile Glu Val Val Gly Tyr Gly Ile Asp Pro Ile Lys

225 230 235 240

Leu Ile Ser Ala Leu Arg Lys Lys Val Gly Asp Ala Glu Leu Leu Gln

245 250 255

Val Ser Gln Ala Asn Lys Asp Val Lys Glu Thr Thr Pro Met Leu Ala

260 265 270

Pro Val Lys Ser Ile Cys Glu Phe His Lys Val Lys Thr Val Cys Ile

275 280 285

Leu Gly Leu Pro Gly Gly Gly Lys Thr Thr Val Ala Arg Glu Leu Tyr

290 295 300

Asp Ala Leu Gly Thr His Phe Pro Cys Arg Val Phe Val Ser Val Ser

305 310 315 320

Pro Ser Ser Ser Pro Ser Pro Asn Leu Thr Lys Thr Leu Ala Asp Ile

325 330 335

Phe Ala Gln Ala Gln Leu Gly Val Thr Asp Thr Leu Ser Thr Ser Tyr

340 345 350

Gly Gly Ser Gly Thr Gly Arg Ala Leu Gln Gln His Leu Ile Asp Asn

355 360 365

Ile Ser Ala Phe Leu Leu Asn Lys Lys Tyr Leu Ile Val Ile Asp Asp

370 375 380

Ile Trp His Trp Glu Glu Trp Glu Val Ile Arg Lys Ser Ile Pro Lys

385 390 395 400

Asn Asp Leu Gly Gly Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg Leu Asn Ser Ile

405 410 415

Ala Glu Lys Cys His Thr Asp Asp Asn Asp Val Phe Val Tyr Glu Val

420 425 430

Gly Asp Leu Asp Asn Asn Asp Ala Leu Ser Leu Ser Trp Gly Ile Ala

435 440 445

Thr Lys Ser Gly Ala Gly Asn Arg Ile Gly Thr Gly Glu Asp Asn Pro

450 455 460

Cys Tyr Asp Ile Val Asn Met Cys Tyr Gly Met Pro Leu Ala Leu Ile

465 470 475 480

Trp Leu Ser Ser Ala Leu Val Gly Glu Ile Glu Glu Leu Gly Gly Ala

485 490 495

Glu Val Lys Lys Cys Arg Asp Leu Arg His Ile Glu Asp Gly Ile Leu

500 505 510

Asp Ile Pro Ser Leu Gln Pro Leu Ala Glu Ser Leu Cys Leu Gly Tyr

515 520 525

Asn His Leu Pro Leu Tyr Leu Arg Thr Leu Leu Leu Tyr Cys Ser Ala

530 535 540

Tyr His Trp Ser Asn Arg Ile Glu Arg Gly Arg Leu Val Arg Arg Trp

545 550 555 560

Ile Ala Glu Gly Phe Val Ser Glu Glu Lys Glu Ala Glu Gly Tyr Phe

565 570 575

Gly Glu Leu Ile Asn Arg Gly Trp Ile Thr Gln His Gly Asp Asn Asn

580 585 590

Ser Tyr Asn Tyr Tyr Glu Ile His Pro Val Met Leu Ala Phe Leu Arg

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Asp Thr Ser Thr Ser Ala Ser Ser Pro Arg Leu Ile Arg Arg Leu Ser

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Leu Gln Gly Gly Tyr Pro Val Asp Cys Leu Ser Ser Met Ser Met Asp

645 650 655

Val Ser His Thr Cys Ser Leu Val Val Leu Gly Asp Val Ala Arg Pro

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Lys Gly Ile Pro Phe Tyr Met Phe Lys Arg Leu Arg Val Leu Asp Leu

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Leu Lys His Leu Arg Ile Leu Asp Val Arg Asn Thr Asp Ile Thr Glu

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Leu Pro Leu Gln Ile Arg Glu Leu Gln His Leu His Thr Leu Asp Val

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Asn Leu Lys Ile Met Cys Val Arg Ser Thr Gly Val Arg Glu Leu Pro

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Leu Arg Val Leu Ala Gly Asp Ser Gly Asp Gly Val Arg Leu Pro Glu

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Gly Val Cys Glu Ala Leu Ile Asn Gly Ile Pro Gly Ala Thr Arg Ala

865 870 875 880

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885 890 895

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Val Leu Glu Tyr Ile Met Ser Lys Ser Ile Glu Glu Asn Phe Ile Thr

565 570 575

Val Val Gly Gly His Trp Gln Met Thr Ala Pro Ser Asn Lys Val Arg

580 585 590

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tatgcaaata ataaaaataa aaagttgtgc ttaaaagatt ttagataata aaataagtaa 540

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ttggctataa ataaattgaa gctactactt ggctgtactg ttaaccttgc tctaattaca 1260

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agccgccgat cgaggcgcga gtagggatgg aggcggctgc catggccgta accgcagcca 1380

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ctctcttgat tctttaattt ggaagtactg tataacaaac atggagggat cgtcatttaa 2040

cttaattttt tttgttgcag caaaaaatcg tgatcaaggt tgccatggag ggcaataatt 2100

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ccacagggag tggtcatctt ttttttttta agataatgaa tagaaatctg gcctctatat 3000

agaaagccaa aggttacaca agtgcataca ctccaaatct caaagctgag aaacacgaaa 3060

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ctttcgtatc aatggacatg tggcattaaa tttaatccca atatttgttc tctcgaagtc 3900

ctgaacatat aattggacaa aattatataa tttaattagg ccaattgagc catatataca 3960

cacactataa gaaacttcta caaaacaaac attcgctcct tttaggtttt gaccagtcta 4020

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caaagcatag aacaaccaca agaaaaaaaa aaacaactag aacaagttct ggaactagtt 4200

agggattcgg gaagccattg cttgctggct tgggacaagc tatgcctgcc attggactat 4260

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catggctgac tgcaaggaga tatatttctt gcaacggaaa ttttcattgc aaaagctgaa 4380

aatcgttgcg atatgtacct attgtgacat aattgaatcc attgggagcc gtagcaataa 4440

atcccgtggt aataggctat tgcaatgatt ttccgatggt tgcataaaaa ggtgctatta 4500

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ctccaaaaat tcaccaataa gagaaacgaa ttaaatcata tacacaatta tttcacaccg 4860

tacagtgcac ttaagtgtag gaaatataat gctatataca tttccaaccc tcaatacagg 4920

ttctgtaaat aatgaaaaga aacatcaatt tgatttcttg accggtccct ctgagacaca 4980

cagtgctttc ctcagcaaca tcgttgccga tctatgtaac ttgtaaactc cttgtgctta 5040

ataaattctg gccagggtta cttcagcctg catggcgaaa aaaaagaact tgttagggag 5100

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gaactgcaag tttaaatttc aacaaaagca aaatacaacc agatgacaaa ctaatatata 5280

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atgctaatgt aatactaata tgctattgag gcttattact cttctcgact tttataggta 5400

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gaagtgccac actgatgaca atgatgtttt tgtctacgaa gttggggatc tagataataa 5580

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accattggcg gagagtttat gccttggtta taaccatctt cctctttatc tgaggacttt 5880

gttgttgtac tgtagtgcat accattggtc taacagaatc gaaaggggtc gtctggtcag 5940

gaggtggatt gcggaaggat ttgtgtcgga agagaaagaa gcagaaggtt actttggcga 6000

gcttattaac agaggatgga ttacgcagca cggagacaac aacagttata attactatga 6060

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gctgtctctt cagggggggt atccagtgga ctgcttgtca agcatgagta tggatgtgtc 6240

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ggagaattcc tgtgtttatt tgcatagagg aaagtgagac tcacctaatc aggggcggtt 8040

ctagtgggtg gtccaggtga tccctggacc accctaaaat ttggcccatg agaaccgccc 8100

cccccctcct cctcccgggg ttggtcgaaa ccagaaaaaa ggccactgag ctaagctagg 8160

gttagggaga ggtgtagcca tgaactagcc acagcagcac gcatcgctgg ctgccgcctc 8220

cgcctctgcg tcagcgccag cgtgccgtct ccccggctct cgactctgcc tccgcctccg 8280

ccttggcgcc gatgcgtcgc ctcctcggct cccgcttcta cctcagcgcc agcgtgccgc 8340

ctccgcctta gcgccgcctc ctcgcctcct cccttccccg actcctccag tcccccactc 8400

ctgtcggttg ctatcgtcgg cgggcggcga ccaacgccta caagccaact acggctgcct 8460

gggcaagccg gcggccaccc ccgcccctgg aaagggaaaa cattgccatt ccacaggcgg 8520

cgccaggtcc cctttctctc tagctttctt gttgctcagc aaagttcaaa ggtcagtaga 8580

catttcttgt tggttttttg caatgttgcc ctatgcagta gtgagtagtc agtactcagt 8640

agtagtgcta gtgaaaaatt tctgccttga gtgtagtgaa aagcaagctg agaaatagca 8700

tgtgtgacaa attattaaat gatggtttaa tcacatctat tgagcgggtt attttctctc 8760

aagttagcaa agaagacatt atgcataatt tcatgtctat atatgaacgg agagtagaaa 8820

agaagtaggg ttttgtaatc ttctacttat ctattataag atatttgaat gattatgttc 8880

taactttcgt aacttcaaat ttagatgttg gttttaagca agttgtgatg ttgtgagata 8940

tattgctaca tttcaattat atttttatta tttttgacac atttggcttg aatttgtaac 9000

aatgtgacaa tttggagcat caagtaggac tacccgacga ttcatgaaac caatgtgccg 9060

atatttagcg gttcttaatc atactgaggt aagaaggcaa cattttgcaa aagtagaatt 9120

tcttcatgaa aatcaggctt atagctttaa tgttcacaaa ctagctaagt ttccttgtac 9180

cttagaggag gggcatcatg ttcgattctc aaatactcct tgtaatctaa gtaggaatgt 9240

aaataatttg gttgttaatg aataaaatgc cagaatttta ttctaaaaga atatgtaatt 9300

caaattaata ttattctaga tgtatcttga atagcccatt agcactggac cagtctttca 9360

agttgggtca gtggtcggta cc 9382

<210>6

<211>8806

<212>DNA

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<220>

<221>promoter

<222>(1)..(1263)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1264)..(1418)，(2300)..(2408)

<220>

<221>CDS

<222>(2409)..(3400)，(3565)..(5638)

<220>

<221>3’UTR

<222>(5639)..(5921)

<400>6

gagtgtaatt agagcaaggt taacagtaca gccaagtagt agcttcaatt tatttatagc 60

caatctaata gcttattcat acaagtacta tactattaat acctggtccc acctgtcata 120

cacactgtgt cttggagtct gtgctacagt tggctacaaa tctatagccc gctacccttc 180

tctctcctta tttatctcct taaaatatgt ttgcagttgg cttatagcct gctattgtaa 240

ctgctcttaa agtggtggta tttttctcgg tcctctcgca atgggttaga gaactgcttt 300

cacataatta gttcgtttgt tctctaatat aaggtatttt aacattttac tttgtactcc 360

cttcattcta aattgatcta tatatagttt ttttaggtta ttcctaaatg atctatatat 420

ttgtgttcat ttattaagtc tattcgttat ttgtgtgcat tggagtaaat ggacattgat 480

gcatgcttcc atgcacacaa gtatttataa cccacatgca atatcttgat ttgctattgg 540

ctaggaaata ttggggatga tgcatgcatt gagtttgttg ttagagtaaa tataatatga 600

aagagttatt agtttttctt ggtcttggtg tacctatgaa atacgtagat caatttagaa 660

tggagggagt acgatccttc gttttattaa aaaaaagttt gaaaattatt atttaatttt 720

cttttactta ttttattatc taaaatcttt taagcacaac tttttatttt tattatttgc 780

ataatttttt taaaataaga taaatggtta aataggactc cctctattcc ataatataag 840

gcacaaccac ttttcttaga tgtttcataa tataaggcat gcatgcatat aggcaattaa 900

ctatgacctc ttttttatta aattattatt catgctctct gattctattg gatgcatgca 960

ttgtatttat taggatgttc taaactacaa gataataata attattttct tggtgtttgg 1020

gttaggggtg gttatgactt atattttata atggagggag tagtacaagt ataatattaa 1080

agactttaat attatattaa aggacggagg aaatattagg gagaaacggc atgaccacga 1140

gtcagtcaac gagtctgcga atgcagtgca gtattattgg cctccgccca aaagcctcac 1200

ccccaaggcc ccaatcttcc caccgcgccg ctgtcccccc cccccccccc ccccaatctt 1260

ctggcctggc cagctctggt cggaggaggg ttcagttcca tgggtgcgcc ccctgcccat 1320

ccctccactt ctactttcgt cttgagatct cgccgtttct gatctccttg ccatggcaac 1380

cagttgattt ggctgccaag atcgtccgtg ctttgcaaag gtgaacaatc tttttcttct 1440

tgggctttca ctttgttgtg ttaatagact cagcgccgtc gcaacttgca aataaaaagg 1500

ttcagatcgg aaaatggaaa taccgtacac agtagtctat agagaatcga ctagtatttc 1560

ctgactgtaa gtaaggaagt tgtaggtacc atgttctgat gattatcttt gaagcttgga 1620

gggggacaaa aagttgggag agaaacaaga atgtatttgt tcacttgatt gggggcagta 1680

ggtaaaatct cagcgttagg aatttgcacc tctttattaa gtttgactaa atttatagaa 1740

aaaaattagc aacacttaaa acaccaaatt agtttcattg aatccaacat tgaatatatt 1800

ttgataatat gtttactttg tgttcaaaat gttactatat ttttctataa atttgatcaa 1860

atttcaataa gtttgactag aaaaaaaagt caaaccgact tataatatga atataaatgg 1920

agggagtaga ttataaatta tctttattat aatactttga gtgtacaaac gaatgaataa 1980

agtttacaaa gttgaaaagt tatttttaaa tactattccg ataaacctgt atatagagaa 2040

cttgtgaaaa aaaacaccgt ttgaaatgtg tctgtgataa tctataagag gaacggggcc 2100

taaatatatt ccttttttcc tacgaaaatg caagaagtat tgcctaatat attgatagag 2160

ctgaagtttt aaagtaaaat gaaacatttg catgaggcag cactggacaa aaagcgcttg 2220

tgaaaaaaat atgttccaaa tattattaat tcattcatgg tatggtcttt attttcattt 2280

tcccccctta tccatgggca ggacacggaa attctcagca ggttcgcgct tgatctgaac 2340

tgtctgtggc tcatactctc ttgtgcttgc gccagctgaa agttgcagtg agaagtacag 2400

agaacaagat ggagttggtg gtaggtgctt ccgaagccac catgaaatct ctcttgggca 2460

agctgggcaa tcttctagcc caggagtatg ctctcatcag cggtatccgt ggtgacatcc 2520

agtacatcaa tgacgagctt gccagcatgc aggccttcct ccgtgatctc agcaacgtgc 2580

cagagggtca cagtcatggc caccggatga aggactggat gaagcagatc cgagacatcg 2640

cctatgatgt tgaggactgt atcgatgact ttgcccaccg cctccctcag gattccatca 2700

gcgatgccaa atggtccttc ctactcacaa aaatctatga actatggaca tggtggccac 2760

gtcgtgtgat tgcttccaac attgcccaac tcaaggtacg ggcacaacag atcgcagatc 2820

gacgtagtag atacggagtg aacaacccag aacaccttga cagtagcagc agtgccagga 2880

cccgtgctgt caattacgaa attgctgagt atcaggtcac aagccctcag atcattggta 2940

taaaggagcc tgtggggatg aagacggtca tggaggagct tgaggtttgg ttaactaatc 3000

ctcaagctga aaatgggcaa gctgttctgt ccatagtcgg ttttggaggt gtgggaaaga 3060

ctaccattgc cacagcattg tacagaaaag tcagtgataa atttcagtgc cgggcatcag 3120

tagctgtgtc tcagaactat gaccaaggca aagtcctcaa tagtattctg agtcaagtca 3180

gcaatcagga gcagggcagc agcacaacaa ttagtgagaa aaagaacctc acctcaggcg 3240

ctaagagcat gttgaagaca gccctgtcac tgctcagagg taattgtata tgtcagccag 3300

aaaatgatgg aaaccctgat aatacaccaa tcaggctgca ggaaacaacg gacgatgatc 3360

aaaaccccag aaaactggaa cagctcctgg ccgaaaagag gtaccttttt ttgtaaataa 3420

aattgctttg cttatctgta aattaactta ctcatcccac tctaaatcta atgtttattt 3480

ccttctatac acagcacaac tccatctttt gaatgggttt tatttttctc acttgtgctc 3540

attttttttt tatcatctct gcagttatat cctcttgatt gatgacattt ggtctgccga 3600

aacatgggag agtatcagat cgattttgcc taaaaataat aaaggcggta gaataatagt 3660

gactacaaga tttcaagctg ttggttcaac atgctcccct cttgaaactg atcgtttgca 3720

tacagttgat tttctcaccg atgacgagtc ccaaaactta ttcaatacaa gtatttgtga 3780

atcaaagata agaaaagata gcaacaaagt agacgagcaa gtccctgagg aaatatggaa 3840

aatatgtggg ggattgcctt tggccatagt caccatggct ggtcttgtcg cctgcaaccc 3900

aaggaaagcc tgctgcgatt ggagtaaact ttgcaaatca ttatttccag agcaagaaac 3960

tcctcttacc ctcgatggtg ttacaaggat actggattgt tgttacaatg atttgcctgc 4020

ggatctgaag acttgcttat tgtacttgag tatatttccg aagggttgga aaattagtag 4080

gaaacgtttg tcccggcgat ggatagctga aggttttgct aatgagaagc aagggttaac 4140

ccaggaaaga gttgcagagg catactttaa tcaactcaca agaaggaact tagtacgtcc 4200

catggagcat ggcagcaatg ggaaggtaaa aacgtttcaa gttcatgaca tggttcttga 4260

atacatcatg tccaaatcaa tcgaagagaa ttttattact gtggttggtg gacactggca 4320

gatgactgca ccaagcaata aagtccgtcg actgtcgatg caaagcagtg gatccaatcg 4380

tggaagttca acaaaaggcc tgaacttggc tcaagtgaga tcactgacgg tgtttgggaa 4440

cctgaaccat atgccattcc attcattcaa ctatgggata atacaggtgc tggatcttga 4500

ggactggaag ggtttgaaag agagacatat gacggagata tgtcaaatgc ttttactcaa 4560

gtatttgagc atccgacgaa cagaaatttc caaaattccc tccaagattc agaaacttga 4620

gtacttggaa actcttgaca taagggagac atatgtcagg gacctgccta agtcaatagt 4680

ccagctaaaa cggatcatta gcatacttgg agggaataaa aacacacgga aggggctgag 4740

gttgcctcaa gaaaaaagta agaagccaat taaaaacccg tcgcctcaag gaaaaacaaa 4800

ggagcccgca aagaaaggat tcttatccca agaaaaaggt aaaggcgcaa tgaaagcact 4860

ccgtgtactg tcagggattg agattgttga ggaatcatca gaagtagctg caggccttca 4920

tcagttgaca gggctaagga agcttgccat atacaagctc aatataacaa agggtggtga 4980

taccttcaaa caattacagt cctccattga gtaccttggc agctgtggtc tgcagactct 5040

ggccatcaat gatgagaatt ctgaatttat caactcactg ggcgacatgc ccgcgcctcc 5100

aagatatctt gtcgcccttg agctgtctgg caagttggag aagctaccca agtggatcac 5160

cagcatcact actctcaaca agctaaccat atctgtaaca gttcttagga ctgaaacttt 5220

ggagatcctc cacattttac cttcattgtt ttccctcacc ttcgcctttt cacttagtgc 5280

agcgaagcag gatcaggaca taataaagga catccttgag aataataaat tggacagtga 5340

tggggaaatc gtcattccag ctgaaggatt caagagtctt aagctgcttc gcttctttgc 5400

acctttagtg ccgaagctca gctttttgga caagaatgca atgccagcac tcgaaatcat 5460

tgaaatgcgg tttaaagact tcgaaggtct atttggcatc gaaatccttg aaaatctccg 5520

tgaggtgcat ctcaaagtta gtgatggggc agaagcaata accaagttcc ttgtaaatga 5580

tttgaaggtt aatactgaga aaccaaaagt atttgttgat ggcatcgtca ctgcatgaga 5640

agtaaaattg ctgcaaatcg gagaacttac caatcatctg aggcttcccc tctattatta 5700

ctctcttaga atatattgtt attattgctc accttgcaaa ataaaatagg gatggcatag 5760

catattgcta caacgtacca tggttccatc atagttgatt tcacttgtca ttacagtgtc 5820

tgttcagttg tgttttctat taataaaagg gagatctccg caagaaacca ttattatact 5880

tatattcggt tatgaactct ataaatgatg ggattgctat atttatggtg ccacaatttc 5940

catgagtgcg gtattttttt ttctagcagt tggctggtgt taagatttgt gctgccattg 6000

ctcctctatt attggtgccc aaaattacgc tttgcactat gttcacagtt gtaaaactta 6060

cctaaatttc gtgtattagt actgtaatgt tgtgattttc gcgtccagtt atattttttt 6120

ctttgccaga agtttgattt caaggtatat ctggtaagct tcagccggat tcgttaagtt 6180

tttagtttaa tcagctaaac ttttaacagt atgcatgcac tagtttctcc cgttatctta 6240

tccaatataa ttaatgggct aattggatct atgccattac aaacatggca agattcagaa 6300

aaatgctact acaatttgtc tattcatagc tgtgctagtg aaattttaca aaattggaac 6360

cgtgctattg atatcacgtt ttccatccat cttttctttt ttttcctttt cttctttatc 6420

ccgtcttctt cccgcaccga cgagaggcga gtggcggcgg gaccggcaag cgatggcagg 6480

acctcggcag ctcagtggtg gcagcggcaa aagggaaagg ggaaggggta ggagagaacc 6540

tggcccgccg acgcaagcat gttggtcgtc gtcttccccg aggagcttga gcagtggcaa 6600

tggtagagga atccaaggag gccgaggagg ttgagcggca ctaatggtag aggatgccga 6660

ggaggtcgag catcagcgag cttgccctgg gtgggcgagt gagggagagc tctcccaagt 6720

gtctgcgaag ctctcatctt cgttttcctc atccccactt tgctcctctt ccactactgc 6780

tgttgaagct agcggccctc tctcaccaga tctgggcgga gctcaagcga ggcgccacca 6840

ccgacgatgg agcttcgcgt ggaccccaca gcctcacccg attgccatcc ctcctaccct 6900

catcactcca tctccaagcc caaatcccac ctcccccacc ggctcctcct cctcagcccc 6960

tgccgtggca gccgaggcca ccgatgggcc aaccctcaac atcgtctcga agcagctccg 7020

cgcactgtgg aagaagcaca accaaatcct ccagatggag gagtcgctca ctggcgggag 7080

gaagctgaac aaggagcagg aggaggtgct ccgatccaag cccatcgtca tcgcgctcat 7140

tgatgagctc gagcggatgc gtgccctgct cgccgacgcc ctcgccgagg agctctcctc 7200

ctgccccgcc ccttccctat ctgtcactcc ctcctcctcc acctcctccg gcgctgattt 7260

gtccgtcaag gatctcctca cgctcatcta cttcggctcc ctcttcgacg tcaagtcgca 7320

gatcgagttc gtcaccacca tgctcgcacg ctaaggagct agactgatgc atcacctacg 7380

actatgtccg tccttgccgc agcacgactt gctacggtcc cgcctcacgc cccgtcgctc 7440

gccggtcccg ccgccacttg cttctcatcg gtgcgggaag aagatgggag aaagaaggaa 7500

gaaaacggga aaaaaaagag atggatgaaa aacgtgacag caatagcacg gttccaattt 7560

cgtaaaattt caatggcacc gctacgaata gaagaattgt agtagcattt ttctgaatca 7620

acatatttgt aatggcatgg atccaataaa ccccaaattt attttatgcc aatacaaata 7680

ttggcaactg gtgtcattaa cgtataaatg ggtcgcctac ataaaacctt ccgcgtcctt 7740

cttggttgaa caggtaatta attgcaacca ttttctgaaa aaattgactg gaagtctgaa 7800

accgtccctg ctactccctg aatgctttag ttcaatctct atgaagctcc atccaaacaa 7860

aatctccaga tgatatttca ttaaaaacat catgtccaga actgtccagt atccaagaat 7920

ggctatgatc ttttctgaat tctggactcg ggacttatat tacatgtatc aaatccagtt 7980

attttctgga gctacaccag atgaaatcac caagtaaaac aattatataa ggatggtgag 8040

ttgttaatta attacagctt tgatagacca ctctgtttgt taatgcctga caagagttca 8100

caaagaaaaa aatacacagg attacaaaac tttttagata ctatctgatg tgtgttaatt 8160

ctctcaaata ctatgtacct gaacaaacaa gagagaacat gttgtgaatt gtgatctcct 8220

catgcgagtg acctgaaact ctctacaggg tcagactcct caagcatcac tgcagcctgg 8280

aaacaatcag cagcatcatt gatcctccca tcattcctgt gaactctccc taaatgaagc 8340

caagccatcc tgttcgtagg ctcaattctc agtgcatcag agaggaagca tctcgctgca 8400

gggagatacc ttgacccttg cttgcagaga agtgcaccaa tggccacctt ggatggaaca 8460

tgctctagct ctatcgagaa tgcgttgacg taggcagcca gtgcctcctt gttctgatct 8520

cgcgcctcga gcatgaaacc tgaacttata gcatccacga gtcagatttt gatgttgaat 8580

tcagttgaat gcagagaatt gtcatgttag tgttacatag aagtggtgaa agttcaagtt 8640

tagttgagtt gatcaccttc tgcatgcatt gttgcagccg agtaggattt tagggctcta 8700

gccttctgca gacatatctc agcgtctctc cagattgaga gactggagta caggtttgca 8760

agtccttgcc atatttcaaa ctcacttaca ctgtcattct gtccct 8806

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ttttggcgcg ccgccagtgt ccaccaacca cagtaataaa 40

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

ttttggcgcg ccgaacagcc tgaggaagca gaacatcgtc 40

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

ttttggcgcg ccgcaagatc agtaccatca cgagtaatag ca 42

<210>10

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ttttggcgcg ccagggacag aatgacagtg taagtgagtt tg 42

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

caccttgagc tgtccggcaa gtt 23

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

cagtgacgat gccatcaaca a 21

<210>13

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tttactagtg gtacctcagc ggtatccgtg gtg 33

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tttgagctcg gatccgcgcc tgaggtgagg ttct 34

<210>15

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

tttactagtg gtacctcacc gatgacgagt ccc 33

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tttgagctcg gatcctgcca gtgtccacca acc 33

<210>17

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

tttactagtg gtacctggcc agatctccca atcgt 35

<210>18

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

tttgagctcg gatcctgtgc ctgtgcaggc tcagt 35

<210>19

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

tttactagtg gtaccttcaa tagctgagaa gtgcc 35

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

tttgagctcg gatccccaaa gtaaccttct gcttc 35

<210>21

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gaagctctga tcaacggtat tcc 23

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

tctttgatca tcttcgggat acg 23

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tgaacttcca cgattggatc cac 23

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

acatggttct tgaatacatc atgtc 25

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

gacgtcgtga agaaagaagc 20

<210>26

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

caatgttttc actgctcccg t 21

<210>27

<211>12

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>27

Gly Leu Pro Gly Gly Gly Lys Thr Thr Val Ala Arg

1 5 10

<210>28

<211>11

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>28

Lys Lys Tyr Leu Ile Val Ile Asp Asp Ile Trp

1 5 10

<210>29

<211>15

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>29

Asp Leu Gly Gly Arg Ile Ile Met Thr Thr Arg Leu Asn Ser Ile

1 5 10 15

<210>30

<211>11

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>30

Gly Phe Gly Gly Val Gly Lys Thr Thr Ile Ala

1 5 10

<210>31

<211>11

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>31

Lys Ser Tyr Ile Leu Leu Ile Asp Asp Ile Trp

1 5 10

<210>32

<211>13

<212>PRT

<213>稻属水稻(Orysa sativa L.)

<400>32

Gly Gly Arg Ile Ile Val Thr Thr Arg Phe Gln Ala Val

1 5 10

Claims

1.稻瘟病抗性基因Pik-p，其编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述基因的cDNA序列。

4.权利要求1或2所述基因编码的蛋白。

5.由权利要求1或2所述基因或权利要求3所述cDNA与启动子构建的表达盒。

6.含有权利要求1或2所述基因或权利要求3所述cDNA的表达载体。