CN102051368B - 稻瘟病抗性基因Pik及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pik及其应用。本发明提供了水稻稻瘟病抗性基因Pik的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。该序列包含有2个基因，都属于CC-NBS-LRR抗性基因家族的成员，且皆为组成型表达的基因。本发明还提供了应用该基因转化水稻或其它植物培育抗病品种以及根据该基因序列产生的分子标记应用于育种。

Description

稻瘟病抗性基因Pik及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因Pik的克隆及其应用。

背景技术

植物在生长的过程中，常常受到多种病原物的侵害，而植物则采取多种防御策略以保护自身，避免受其侵袭。植物中一个最重要的防御机理就是能够识别专性致病微生物的存在并启动自身的防御应答系统。植物对病原菌的识别由抗病基因所介导。因此，对抗病基因产物结构进行分析与研究，是了解植物抗病机制的基础，对于其病害的预防和控制也具有重要的指导意义。

迄今为止，已经从植物中分离了80多个抗病基因。对这些抗病基因的结构和产物的研究发现，虽然寄主植物不同，所对应的病原物也有真菌、细菌、病毒和线虫等差异，但抗病基因的结构和产物却有许多共同的结构特征，如C-端存在富亮氨酸重复序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉链(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋结构域(coiled-coil，CC)，跨膜结构域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(proteinkinase，PK)，以及果蝇Toll蛋白及哺乳动物白介素-1受体(Toll and interleukin-1 receptor，TIR)等。根据它们所编码蛋白的结构特征，可将抗病基因分为7类(Hammond-Kosack&Jones，1997；Dangl & Jones 2001；Iyer & McCouch 2004)。

第一类，毒素还原酶类抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1个被克隆的植物抗病基因，它控制对真菌Cochliobolus carbonum小种1的抗性。Hm1编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小种1产生的致病因子，它决定该病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二类，NBS-LRR类抗病基因。它们编码的蛋白近N端为NBS，而近C端则由LRR组成。如RPS2(Bent et al.，1994)、RPM1(Grant et al.，1995)、I2(Simonet al.，1998)；RPP5(Parker et al.，1997)、N(Dodd et al.，2001)、L6(Lawrence et al.，1995)、Mla1(Zhou et al.，2001)、Mla6(Halterman et al.，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimuraet al.，1998)、Pib(Wang et al.，1999)、Pita(Bryan et al.，2000)等。第三类，PK类抗病基因。如番茄Pto基因，其产物是一种位于细胞内的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，没有LRR结构域(Martinet al.，1993)。第四类，LRR-TM类抗病基因。番茄抗叶霉病不同生理小种的基因Cf-2(Dixon etal.，1996)、Cf-4(Thomas et al.，1997)、Cf-5(Dixon et al.，1998)、Cf-9(Jones et al.，1994)，以及甜菜抗胞囊线虫的基因Hs1^pro-1(Cai et al.，1997)等。第五类，LRR-TM-PK类抗病基因，以水稻抗白叶枯病基因Xa21(Song et al.，1995)为代表。第六类，以拟南芥的RPW8为代表，其编码的蛋白仅含有完整的CC和NBS结构域(Xiao et al.，2001)。第七类，以水稻的xa5基因为代表，其编码的蛋白为一个转录因子(TFIIAγ)(Iyer&McCouch，2004)。

编码NBS-LRR类抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一类抗病基因，根据NBS-LRR类抗病蛋白N末端的结构特点，又可将该类基因分为两大类TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR(Meyers et al.，2002；Pan et al.，2000；Cannon et al.，2002；Richly et al.，2002)。TIR-NBS-LRR类抗病基因主要发现在双子叶植物，至今还没有在单子叶植物基因组中发现(Baiet al.，2002；Meyers et al.，2002)。目前在单子叶植物中鉴定到的抗病基因主要编码CC-NBS-LRR类抗病蛋白，双子叶植物中也存在大量的CC-NBS-LRR类抗病基因，相对而言，单子叶植物中的CC-NBS-LRR类抗病基因比双子叶植物中的更丰富多样(Cannon et al.，2002)。

研究表明，NBS、CC、TIR结构域可能参与信号传导(Hammond-Kosack&Jones 1997)，尽管这类R蛋白不具有内在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有结合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut et al.，1994)。TIR结构可能参与植物抗病防卫反应下游的信号传导(Jones et al.，1994)。最近的证据表明，亚麻的L族多样性选择也发生在TIR区域，这个区域与相应的LRR区域共进化形成特异性(Luck et al.，2000)。LRR结构域的功能主要涉及到蛋白质-蛋白质和与配体的相互作用(Jones&Jones，1996；Kajava et al.，1998)，据推测是抗病基因产物直接和病原菌无毒基因编码的产物或间接产物相互作用的部位(Bent，1996；Baker et al.，1997)。Jia et al.(2000)通过酵母双杂交证明AVR-Pita编码的蛋白加工为一个176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita₁₇₆小种特异性的激发子，传递到植物细胞质特异地与Pita受体的LRD区域结合，从而激活细胞内Pita介导的防卫反应。当Pita中的Ala变为Ser后Av-rPita₁₇₆不能与LRD结合，因而表现感病。这一结果直接证明了LRR结构域可能就是病原菌识别的区域；Pita与AvrPita的互作第一次从分子水平验证了水稻与稻瘟病菌的“基因对基因”关系。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，约有一半以上的人口以稻米为主食。由病原真菌Magnapothe oryzae(无性态：Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，每年都造成严重的粮食损失。从环境保护与农业的可持续发展的观点来看，抗病品种的育成与利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群体的多样性及易变性，加之人们缺乏对抗性基因的有效利用，以及对抗性机理缺乏充分的了解，以致抗病品种的感病化问题不但没有得到解决，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品种的短命化而成为育种学家最为棘手的问题。因此，发掘、鉴定和克隆抗病基因并合理地应用于抗病育种计划中，已成为农业科研中优先解决的重要问题。

随着分子生物学的快速发展，迄今，至少有80多个水稻稻瘟病主效抗性基因已经被报道，其中60个已经被分子定位。目前，除了水稻的第3染色体上还没有被鉴定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11条染色体上均被鉴定到有主效抗性基因位点，并且有的染色体上含有多个稻瘟病抗性位点，而且有些基因位点的抗性基因是成簇存在的。目前，在稻瘟病抗性基因的克隆研究方面，正式报道的已有13个抗性基因，Pib(Wang et al.，1999)，Pita(Bryan et al.，2000)，Pi9(Qu et al.，2006)，Pid2(Chen et al.，2006)，Piz-t和Pi2(Zhou et al.，2006b)，Pi36(Liu et al.，2007a)，Pi37(Lin et al.，2007)，Pik-m(Ashikawa et al.，2008)，Pit(Hayashi et al.，2009)，Pi5(Leeet al.，2009)，Pid3(Shang et al.，2009)和pi21(Fukuoka et al.，2009)。

克隆抗病基因是对水稻抗性机理深入研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子机理可以更好地控制和降低稻瘟病菌对水稻的危害。同时，对克隆的抗病基因进行修饰和改造，可以人为地控制和增加植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻稻瘟病抗性基因和包含调控这个基因的启动子的DNA片段。本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因所编码的蛋白质。本发明的另一个目的是提供上述含有上述抗性基因的载体。本发明的另一个目的是提供上述载体的宿主细胞。本发明的另一个目的是提供上述基因在制备转基因植物中的应用。本发明的进一步目的是提供上述抗性基因产生的分子标记及其在选育对稻瘟病具有抗病性的水稻中的应用。

本发明从水稻品种Kusabue中分离得到Pik基因，包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pik-1和Pik-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示，它们分别编码SEQ ID NO.3以及SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，结构如图6和图7所示。它们的蛋白都包含2个主要的结构域：NBS和LRR区域，其中Pik-1NBS结构域含有保守的kinase 1a：GLPGGGKTTVAR，kinase 2：NKKYLIVIDDIW，kinase 3a：DLGGRIIMTTRLNSI，GLPL：EDNSCYDIVNMCYGMPLALIW；Pik-2NBS结构域含有保守的kinase 1a：VLSIVGFGGVGKTTIA，kinase 2：LEQLLAEKSYILLIDDIW，kinase 3a：EQVPEEIWKICGGLPLAIVT，GLPL：EQVPEEIWKICGGLPLAIV，RNBS-D：CLLYLSIFPKGWK，MHDV：KTFQVHDMVLEYI。而Pik-1蛋白的C-末端为16个不完整的LRR重复，其亮氨酸含量为14.0％(附图6)。Pik-2蛋白的C-末端为13个不完整的LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％(附图7)。

应当理解，在不影响蛋白活性的前提下(不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响蛋白表达的条件下，对编码上述蛋白的基因序列进行修改。本发明还包括基于所述基因的正义序列或反义序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

本发明同样包括将Pik抗性基因的主要结构部分有效地连接上合适的调节序列所形成的嵌合基因，以及在基因组中包含这种基因的植物和这种植物的种子。这种基因可以是天然的或是嵌合的。例如，将包含该基因的片段和一个组成型表达的启动子连接，该启动子可以在任何条件下和细胞发育的任何时期表达。这种组成型表达的启动子包括花椰菜花叶病毒的35S启动子等。另一方面，也可以将该基因和一个组织特异性表达的启动子或发育时期特异性表达的启动子或精确环境诱导的启动子连接，这些启动子称之为诱导型启动子。这样，环境的改变，发育时期的不同都可以改变该基因的表达。同样地，也可以将该基因的表达限定在某一个组织内，使由该基因诱导的抗病反应得到人为的控制。其中环境条件包含病原菌的攻击、厌氧条件和光等，组织和发育时期包括叶、果实、种子和花等。

本发明还进一步克隆得到所述基因的启动子，包含调控该基因的启动子的DNA片段分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

根据本发明提供的Pik基因序列信息(SEQ ID No.1和SEQ ID No.2)，本领域技术人员可以通过以下方法容易地获得与Pik等同的基因：(1)通过数据库检索获得；(2)以Pik基因片段为探针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据Pik基因序列信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；(4)在Pik基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因。

本发明提供的稻瘟病抗性基因Pik具有重要的应用价值，其赋予植物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)所引起的病害产生特异性的抗病反应(图2)。其适用于对所有对该病原菌敏感的植物，这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。应用之一是将所述的Pik基因序列连接到任何一种植物转化载体，用任何一种转化方法将Pik抗病基因导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以在其转录起始密码子前用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽和增强植物对病原菌的抗性。

本发明提供的抗性基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAPS(切割扩增片段多态)。用此标记可鉴定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种的选择效率。

本发明具有明显的优点和效果。将克隆的抗病基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用转化技术在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中不良基因的连锁问题，并且可以缩短育种时间。抗病基因的克隆是克服传统育种中不能在植物种间转移抗病基因的问题的前提。

本发明能够进一步提供或应用利用上述DNA片段获得的抗病的转基因植株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他的植株中。

附图说明

图1.水稻稻瘟病抗性基因Pik的图位克隆技术路线图。

图2.4个Pik簇等位基因对10个中国稻瘟病菌群体抗谱的比较。

图中纵坐标为抗性频率，横坐标为10个稻瘟病菌群体(GD，广东；FJ，福建；HN，湖南；YN，云南；GZ，贵州；SC，四川；JS，江苏；LN，辽宁；JL，吉林；HLJ，黑龙江)。4个Pik簇等位基因(Shin 2，Pik-s；K60，Pik-p；Kusabue，Pik；Tsuyuake，Pik-m)。由此可以看出，Pik对广东、福建、湖南、贵州、四川、江苏的稻瘟病菌群体表现高度的抗性。

图3A.Pik基因位点的连锁标记图。

图中横线上面的数字为标记之间的物理距离[用碱基(bp)表示]；括号内的数字为该标记检测出的重组体/配子体。

图3B.Pik基因位点在日本晴类型基因组上存在的具有NBS-LRR保守结构的6个抗性候选基因。

图3C.Pik基因位点在Kusabue/K60/Tsuyuake类型基因组上存在的具有NBS-LRR保守结构的2个抗性候选基因。

由此可以看出，在Pik基因位点存在两种类型的基因组，彼此之间存在很大的缺失/插入；Pik基因只有2个候选基因(Pik1-KU和Pik2-KU)。

图4(左桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik之组成基因Pik-1(K3)之遗传互补T₀植株的抗性鉴定实物图。

由于受体品种Q1063存在与Pik-1(K3)匹配(序列完全相同)的Pik-2(K4)，图中的转化植株中出现抗病个体(实线箭头)，说明单一的Pik-1导入与之匹配的背景中也能产生抗性。

图4(中桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik之组成基因Pik-2(K4)之遗传互补T₀植株的抗性鉴定实物图。

由于受体品种Q1063不存在与Pik-2(K4)匹配的Pik-1(K3)，图中所有转化植株都表现感病(虚线箭头)，说明单一的Pik-2不具备抗性功能。

图4(右桶).水稻稻瘟病抗性基因Pik(由Pik-1和Pik-2组成)之遗传互补T₀植株的抗性鉴定实物图。

图中实线箭头所指的是抗病植株，虚线箭头所指的是感病植株，说明抗性基因Pik由Pik-1和Pik-2组成才能表现功能。

图5.水稻稻瘟病抗性基因Pik遗传互补的部分T₀转化体的选择标记HPT基因的PCR检测图。

图中由左至右，泳道1：分子量标记DL2000；泳道2：空载体(Vector)，阳性对照；泳道3：H₂O，阴性对照；泳道4：受体品种龙粳24，阴性对照；泳道5-14：T₀转化体。结果表明，所有抗病的转化体都检测到了选择性标记的PCR扩增产物，而大部分的感病转化体没有检测到选择性标记的PCR扩增产物，说明抗病的转化体是由于转化构建体已经整合到了高感的受体品种中获得了表达而恢复了抗性。其中出现的阳性中感个体(泳道12)可能是由于外源基因的整合等问题，在受体品种中并没有得到充分的表达。R：高抗；MR：中抗；MS：中感；S：感病。

图6A.水稻稻瘟病抗性基因Pik之组成基因Pik-1的基因结构图。

图中浅色方框表示5’和3’-UTR；深色方框表示外显子；线条表示内含子；该基因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及各个区域的大小(bp)亦标示于其中。

图6B.水稻稻瘟病抗性基因Pik之组成基因Pik-1编码的氨基酸多肽序列结构图。

图中CC结构域中的斜体字表示形成CC motif的氨基酸，NBS区域的黑体字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域，黑体字表示形成LRR区域的xLDL保守基序。LRR区域后面还带有一段CNL(C端非LRR区域)氨基酸序列。星号标示的氨基酸序列为Pik特异的氨基酸替换[substitution，与Pik簇的其他其他等位基因(Pik-h，Pik-p，Pik-m)相比]。

图7A.水稻稻瘟病抗性基因Pik之另一组成基因Pik-2的基因结构图。

图中浅色方框表示5’和3’-UTR；深色方框表示外显子；线条表示内含子；该基因编码区的启动子(ATG)和终止子(TAG)以及各个区域的大小(bp)亦标示于其中。

图7B.水稻稻瘟病抗性基因Pik之另一组成基因Pik-2编码的氨基酸多肽序列结构图。

图中CC结构域中的斜体字表示形成CC结构的氨基酸，NBS区域带下划线的黑体字表示NBS中保守的氨基酸序列。下部分独立列出的氨基酸残基为C-末端LRR区域，黑体字表示形成LRR区域的xLDL保守基序。

图8.水稻稻瘟病抗性基因Pik表达特性的定量RT-PCR检测图。

左图为组成基因Pik-1在不同的接种时间点(0hr，12hr，24hr，72hr)的相对表达水平，由此可以看出，该基因呈逐步上调的表达类型。中图为另一个组成基因Pik-2在不同的接种时间点的相对表达水平，由此可以看出，该基因也呈逐步上调的表达类型，但是前者上调的幅度比后者的大。右图为病原菌诱导表达基因PBZ1(pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作为对照的相对表达水平，由此可以看出，该基因在接种对照(H₂O)和接种病原菌之间表现明显不同的诱导型表达。2个组成基因都表现为组成型表达，因为接种之前和之后都能检测到2个基因的表达。

图9.利用水稻稻瘟病抗性基因Pik特异性分子标记的基因型鉴定图。

由此可以看出，利用该分子标记可以把抗性品种Kusakue(Ku)的基因型(Pik/Pik)；感病品种IR36(IR)的基因型(pik/pik)；含有与Pik等位的抗性品种Tsuyuake(TS)的基因型(Pikm/Pikm)；抗性品种K60的基因型(Pikp/Pikp)；抗性品种K3的基因型(Pikh/Pikh)；以及抗性品种Kusabue与感病品种IR36的杂交F₂之感病个体S1-S4的基因型(pik/pik)；R1-R2的杂合基因型(Pik/pik)鉴别出来。图中，M：分子量标记DL2000。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

在本发明的实施例部分，我们阐述了Pik基因的分离过程(附图1)和该基因的特点，分离的Pik基因能够与载体连接，转入植物体中，使该植物体带有抗性。

实施例1：抗性基因Pik的抗性特征

首先，为了比较和明确在Pik位点上4个等位基因(Pik，Pik-p，Pik-s，Pik-m)的抗谱，利用从广东(GD，60个菌株)，福建(FJ，40个)，湖南(HN，40个)，贵州(GZ，60个)，云南(YN，43个)，四川(SC，66个)，江苏(JS，72个)，辽宁(LN，108个)，吉林(JL，60个)和黑龙江(HLJ，63个)，收集的总计612个菌株对上述4个等位基因所持品种(分别是Kusabue，K60，Shin 2和Tsuyuake)进行了抗谱比较分析。结果表明，Pik对广东、福建、湖南、贵州、四川、江苏的稻瘟病菌群体表现高度的抗性。由此说明该基因可在上述地区使用。生物材料水稻品种Kusabue，Shin 2，K60，Tsuyuake已在文献(Wang et al.Characterization of riceblast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus.Phytopathology，2009，99：900-905)中公开。

实施例2：水稻稻瘟病抗性基因Pik的定位及电子物理作图

本发明对由粳稻抗病品种Kusabue与IR36等籼稻感病品种的杂交组合由来的F₂群体，接种CHL346等对双亲品种表现分明的非亲和性/亲和性反应的菌株(稻瘟病菌单一孢子分离的菌株)。结果表明，这些F₂群体中抗病植株与感病植株的分离比都符合3∶1。由此推断，Kusabue所表现的对这些接种菌株的抗性都是由一对显性基因控制的。对这些F₂群体对应的抗性基因进行连锁分析，结果表明它们受同一显性基因控制，因此，构建了由499个体组成的一个作图群体(相当于998个配子体)。生物材料水稻品种IR36已在文献(Lin et al.A high-resolution map ofthe rice blast resistance gene Pi15constructed by sequence-ready markers.Plant Breeding，2007，126：287-290)中公开。生物材料水稻品种CHL346已在文献(Ma et al.Identification and fine mappingof AvrPi15，a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea.Theor Appl Genet，2006，113：875-883)中公开。

前期的遗传分析表明Pik基因与Pik-m基因是等位的，而申请人所在的研究室已经对Pik-m基因进行了精细定位(Li et al.2007，Molecular Breeding，20：179-188)。因此，申请人利用Li et al(2007)开发的分子标记进行了连锁分析。结果表明，在标记K34和RM5766分别检测出了7个和11个重组体(附图3)。为了缩小Pik位点的染色体区域并找到与之共分离的标记(没有重组体发生的标记)，进一步在K34--RM5766区域内，从Li et al(2007)开发的标记中获得了2个多态性标记(K33，K28)，并对上述18个不同的重组体进行了连锁分析。结果表明，在标记K33和K28分别检测出了0个和7个重组体。因此，Pik位点最终被界定于K34--K28之间的区域内，其中标记K33与之完全共分离。

为了构建Pik位点的电子物理图，把与之连锁的标记通过生物信息学方法着陆于水稻品种日本晴(Nipponbare)的参考序列上，并由此构建了该基因位点的重叠群。由参考序列可以推测Pik位点被界定于侧翼标记K34和K28之间约127kb的范围内。

实施例3：水稻稻瘟病抗性基因Pik候选基因的注释及序列分析

为了确定Pik的候选基因，申请人利用日本晴的参考序列，通过3种基因预测软件RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)、Gramene(http://143.48.220.116/resources/)和Softberry的FGENESH(http://www.softberry.com)对目的基因区域进行了基因预测及注释分析，初步确定了Pik的候选抗性基因为6个核苷酸结合位点和富亮氨酸重复(nucleotide binding site-leucine-rich repeat，NBS-LRR)的候选基因(Pik1-NP，Pik2-NP，Pik3-NP，Pik4-NP，Pik5-NP，和Pik6-NP)。

对6个候选基因进行基于基因特异性标记的存在/缺失(presence/absence，P/A)分析，结果表明，在日本晴参考序列存在的4个候选基因(Pik1-NP，Pik2-NP，Pik3-NP，Pik4-NP)在Kusabue中是不存在的。因此，Pik的候选抗性基因实际上只有2个Pik-1和Pik-2(图3)。下一步通过以下的基因功能互补实验确认其功能。

实施例4：水稻稻瘟病抗性基因Pik的遗传互补实验及转化子的抗性鉴定

首先，利用高保真酶phusion结合长片段PCR(long-range PCR，LR-PCR)技术，以Kusabue的总DNA为模板，根据或参考Liu et al.(2007，Genetics，176：2541-2549)和Lin et al.(2007，Genetics，177：1871-1880)描述的实验方法和程序，分别扩增、克隆了Pik-1(正向引物：TTTTGGCGCGCCGCCAGTGTCCACCAACCACAGTAATAAA；反向引物：TTTTGGCGCGCCGAACAGCCTGAGGAAGCAGAACATCGTC)和Pik-2(正向引物：TTTTGGCGCGCCGCAAGATCAGTACCATCACGAGTAATAGCA；反向引物：TTTTGGCGCGCCAGGGACAGAATGACAGTGTAAGTGAGTTTG)，并进行了遗传互补实验。结果表明，候选基因Pik-1在感病受体品种Q1063(Lin et al.，The blast resistance gene Pi37encodesan NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1.Genetics，2007，177：1871-1880)中实现了功能互补(附图4左桶)；而候选基因Pik-2在感病受体品种Q1063中则没有实现功能互补(表1；附图4中桶)。对感病受体品种Q1063进行序列比较分析发现，该品种中存在与候选基因Pik-1匹配的Pik-2，而不存在与候选基因Pik-2匹配的Pik-1。

表1.Pik 2个组成基因的遗传互补实验分析结果

^a自各个构建体的T₀转化植株接种对Pik无毒性的菌株CHL381或CHL346。R，抗病；MR，中抗；MS，中感；S，感病。

^b功能互补成功率(％)为R+MR/R+MR+MS+S*100。

进一步将上述2个候选基因拼接为一个整体的基因在上述感病受体品种Q1063以及完全没有这2个候选基因的感病受体品种龙粳24中进行遗传互补实验。结果表明，该拼接基因在上述2个感病受体品种中都实现了功能互补(表1；附图4右桶)。利用转化载体中的潮霉素基因(HPT)标记对转化体进行了PCR检测。结果表明，目的基因片段已经导入所有抗病转化体中，而没有导入大部分的感病转化体中(部分结果见附图5)。

上述遗传互补的实验结果表明，抗性基因Pik由2个基因Pik-1和Pik-2组成才能表现其功能。

实施例5：Pik基因的结构

采用移步法对Pik的DNA序列进行了测定。利用RACE技术，获得了Pik的全长cDNA序列并对其进行了测序。Pik基因DNA长度为16.9kb(包含Pik-1和Pik-2)，其中，Pik-1的全长cDNA序列为3695bp，含有一个3432bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为73bp和190bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有2个内含子和3个外显子(附图6A)。另一个组成基因Pik-2的全长cDNA为3511bp，含有一个3066bp的开放读码框，5’和3’非翻译区分别为162bp和283bp。通过比较基因组DNA和cDNA序列，发现该基因的开放读码框含有1个内含子和2个外显子(附图7A)。

实施例6：Pik抗性蛋白的结构

Pik基因包含的2个组成基因编码的蛋白序列如序列表中Pik-1SEQ ID No.3和Pik-2SEQID No.4所示。Pik-1基因编码1个由1143个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为126.80KD，等电点为6.16。利用COIL工具分析表明该蛋白多肽有CC(coiled-coil)结构域。Pik-1蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GLPGGGKTTVAR)位于该多肽的第291个氨基酸残基；kinase 2(NKKYLIVIDDIW)位于该多肽的第376个氨基酸残基；kinase 3a(DLGGRIIMTTRLNSI)位于该多肽的第403个氨基酸残基，GLPL(EDNSCYDIVNMCYGMPLALI)位于该蛋白多肽462个氨基酸残基。而该蛋白的C-端的611-961个氨基酸残基为16个不完整LRR重复，其亮氨酸含量为14.0％，其C末端还有个非LRR结构(CNL)的氨基酸序列(附图6B)。图中星号标示的氨基酸序列为Pik基因特异的氨基酸替换(substitution)，由此可以鉴别Pik基因与其他等位基因(Pik-s，Pik-h，Pik-m，Pik-p)的不同。

Pik-2基因编码1个由1021个氨基酸残基组成的蛋白多肽，分子量为114.57KD，等电点为8.39。利用COIL工具分析表明该蛋白多肽没有CC结构域，但是利用更为强大的预测工具Paircoil2分析发现有CC结构域。Pik-2蛋白属于NBS-LRR蛋白，NBS结构域中保守的kinase 1a(GFGGVGKTTIA)位于该多肽的第211个氨基酸残基；kinase 2(KSYILLIDDIW)位于该多肽的第330个氨基酸残基；kinase 3a(GGRIIVTTRFQAV)位于该多肽的第358个氨基酸残基，GLPL(EQVPEEIWKICGGLPLAIV)位于该多肽的第415个氨基酸残基，RNBS-D(CLLYLSIFPKGWK)位于该多肽的第488个氨基酸残基，MHDV(KTFQVHDMVLEYI)位于该多肽的第553个氨基酸残基。而该蛋白的C-末端的610-960个氨基酸残基为13个不完整LRR重复，其亮氨酸含量为17.0％(附图7B)。

实施例7：Pik基因的表达特性分析

利用定量RT-PCR技术对Pik基因的表达模式进行了分析。在抗病品种Kusabue接种后不同的时间点(0hr，12hr，24hr，72hr)上采集叶片并提取其总RNA，利用反转录试剂盒SuperScript^TMReverse TranscriptaseII(Invitrogen公司)进行反转录cDNA第一条链的合成。RT-PCR的引物为，RRT5F：GAAGCTCTGATCAACGGTATTCC，RRT5R：TCTTTGATCATCTTCGGGATACG；RRT17F：TGAACTTCCACGATTGGATCCAC，RRT17R：ACATGGTTCTTGAATACATCATGTC。

实时定量RT-PCR使用CFX96Real-time PCR检测系统和SYBR Premix Ex Taq试剂盒(宝生物公司)，操作按照试剂盒说明进行。附图8(左)为组成基因Pik-1在不同的接种时间点的相对表达水平，由此可以看出，该基因呈逐步上调的表达类型。附图8(中)为另一个组成基因Pik-2在不同的接种时间点的相对表达水平，由此可以看出，该基因也呈逐步上调的表达类型，但是前者逐步上调的幅度比后者的大。附图8(右)为病原菌诱导表达基因PBZ1(pathogenesis-related probenazole-inducible gene)作为对照的相对表达水平，由此可以看出，该基因在接种对照(H₂O)和病原菌接种之间表现明显不同的诱导型表达。2个组成基因都表现为组成型表达，因为接种之前和之后都能检测到2个基因的表达。

实施例8：转化Pik基因产生的抗性植株的应用

将Pik基因克隆到植物转化载体pCAMBIA1300(Lin et al.，The blast resistance gene Pi37encodes an NBS-LRR protein and is a member of a resistance gene cluster on rice chromosome 1.Genetics，2007，177：1871-1880)，导入农杆菌菌株EHA105中，用于转化感病的水稻品种龙粳24，获得了24株转化植株，其中19株表现抗性反应(表1)。这说明可以用Pik基因转化水稻感病品种，结合现有技术经过自交、纯化选择等一系列育种程序之后，即可产生抗病品种而应用于生产。

实施例9：Pik基因序列在分子标记辅助选择育种中的应用

利用本发明提供的Pik基因序列信息可开发基因特异性的dCAPS分子标记(Pik-SNP-1F：TTCGAGGCCCTACCAAGACA；Pik-SNP-1R：CATGGAAGGCTATCCTTGGTA，扩增产物用限制性内切酶KpnI进行酶切)，既可用于鉴别Pik基因与其他等位基因(Pik-h，Pik-m，Pik-p，Pik-s)的不同，也可在杂交后代用于鉴定Pik位点上的各种基因型，即Pikh/Pikh、Pikh/pikh和pikh/pikh的植株，这些信息可在分子标记辅助选择育种过程中加以应用，以提高育种的目的性和效率(附图9)。

序列说明

SEQ ID NO.1&2是Pik-1和Pik-2的核苷酸序列；SEQ ID NO.3&4是SEQ ID NO.1&2的编码产物；SEQ ID NO.5&6是带有启动子的Pik-1和Pik-2核苷酸序列。SEQ ID NO.7&8和SEQ ID NO.9&10是分别用来扩增Pik-1和Pik-2的引物对；SEQ ID NO.11&12和SEQ IDNO.13&14分别是引物对RRT5F、RRT5R和RRT17F、RRT17R；SEQ ID NO.15&16是引物对Pik-SNP-1F和Pik-SNP-1R；SEQ ID NO.17～26分别是Pik-1的kinase 1a、kinase 2、kinase 3a、GLPL序列以及Pik-2的kinase 1a、kinase 2、kinase 3a、GLPL、RNBS-D、MHD序列。

Claims (8)

1.稻瘟病抗性基因Pik，其编码SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求1或2所述基因的cDNA序列。

4.权利要求1或2所述基因编码的蛋白质。

5.由权利要求1或2所述基因或权利要求3所述cDNA与启动子构建的表达盒。

6.含有权利要求1或2所述基因或权利要求3所述cDNA的表达载体。

7.权利要求1或2所述基因、权利要求3所述cDNA、权利要求4所述蛋白质、权利要求5所述表达盒或权利要求6所述表达载体在制备转基因植物中的应用。

8.权利要求1或2所述基因、权利要求3所述cDNA、权利要求4所述蛋白质、权利要求5所述表达盒或权利要求6所述表达载体在提高水稻抗稻瘟病中的应用。

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