CN108026150B - 小麦秆锈病抗性基因及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于增强小麦植物抵抗由小麦秆锈病菌引起的小麦秆锈病的抗性的组合物和方法。所述组合物包含编码抗性(R)基因产物及其变体的核酸分子，以及包含所述核酸分子的植物、种子和植物细胞。用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法包括将编码R基因产物的核酸分子引入小麦植物细胞中。本发明另外提供在农业中使用所述小麦植物以限制小麦秆锈病的方法。

Description

小麦秆锈病抗性基因及使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年8月4日提交的美国临时专利申请号62/200,894的权益，该申请以引用方式全部并入本文。

参照以文本文件提交的序列表

序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web以电子方式提交，文件名为070294-0101SEQLST.TXT，于2016年7月29日创建，并且大小为711千字节，而且与说明书同时提交。在该ASCII格式的文件中所包含的序列表为说明书的一部分，并且以引用方式全文并入本文。

技术领域

本发明涉及基因分离和植物改良领域，特别涉及通过使用疾病抗性基因增强植物抵抗植物疾病的抗性。

背景技术

在全世界小麦生产中，植物疾病导致显著的产量损失。锈病是最具破坏性的小麦疾病的一种。由小麦秆锈病菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)引起的小麦秆锈病是当今影响小麦生产的最毁灭性的疾病之一。尽管已经证明包含抵抗小麦秆锈病菌的抗性基因(R)的小麦植物有效地限制由小麦秆锈病引起的农业损失，但是近期出现了小麦秆锈病菌的新物种，而所述R基因对其是无效的。虽然杀虫剂可以用于控制小麦秆锈病，可是杀虫剂是昂贵的并且与农业的可持续强化不一致，而且在发展中国家，简而言之，杀虫剂是自给农民负担不起的。

农业的可持续强化要求增加使用遗传解决方法，替代化学解决方法(例如杀虫剂)来保护农作物抵抗病原体和害虫(Jones et al.(2014)Philos.T.Roy.Soc.B 369:20130087)。驯化的农作物(例如小麦)的野生近源种包含巨大多样性的可用的R基因，其为用于可持续性疾病控制的有价值的来源。然而，用于引入R基因的传统方法通常涉及长的育种时间线，以破坏与其他基因的有害等位基因的连锁。此外，当一次部署一个R基因时，在几个季节内可以克服R基因(McDonald and Linde(2002)Annu.Rev.Phytopathol.40:349-379)。但是，分子克隆可以避免连锁累赘并同时引入多个R基因(Dangl et al.(2013)Science341:746-751)，这可以延迟抗性突破病原体物种快速进化，由此提供更持久的抗性(McDonald and Linde(2002)Annu.Rev.Phytopathol.40:349-379)。

尽管传统的基于图谱的克隆法已经用于分离植物的R基因，但是许多植物基因组携带大的染色体区域，这些区域由于抑制重组而使得传统的基于图谱的克隆法无法达到(Gaut et al.(2007)Nature Rev.Genet.8:77-84)，并且小麦也不例外。因此，不依赖于重组的新的补充方法必须用于鉴定农作物植物和它们的非驯化的近源种中的其他R基因。

发明概述

本发明提供了已知赋予植物以抵抗引起小麦秆锈病的至少一种病原体菌株(小麦秆锈病菌)的抗性的抗性(R)基因的核酸分子。在一个实施方案中，本发明提供了包含R基因Sr22及其变体(例如包括直系同源物和非天然形成的变体)的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了包含R基因Sr45及其变体(例如包括直系同源物和非天然形成的变体)的核酸分子。

本发明进一步提供了在其基因组中包含本发明的一个或多个核苷酸构建体的植物、植物细胞和种子。所述多核苷酸构建体包含编码本发明的抗性(R)蛋白质的核苷酸序列。此类R蛋白质由本发明的R基因编码。在优选的实施方案中，植物和种子是使用本发明的一个或多个核苷酸构建体转化的转基因小麦植物和种子。优选地，与不包含所述多核苷酸构建体的对照小麦植物的抗性相比，此类小麦植物包含抵抗引起小麦秆锈病的至少一种病原体菌株(小麦秆锈病菌)的增强的抗性。

本发明提供了用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法。此类方法包括将包含本发明的R基因的核苷酸序列的多核苷酸构建体引入至少一种小麦植物细胞中。在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体或其部分被稳定地引入植物细胞的基因组中，并且在其他的实施方案中，所述多核苷酸构建体不稳定地引入小麦植物细胞的基因组中。用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法可以任选地进一步包括使小麦植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的小麦植物。优选地，相对于对照小麦植物而言，此类小麦植物包含抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。

本发明另外提供了用于鉴定小麦植物的方法，所述小麦植物展现出抵抗小麦秆锈病的新赋予的或增强的抗性。所述方法包括检测小麦植物中选自Sr22和Sr45的至少一个R基因的存在情况。

本发明还提供了在农业农作物生产中使用本发明的小麦植物限制小麦秆锈病的方法。所述方法包括种植通过本发明的小麦植物生产的小麦种子，其中所述小麦种子包含本发明的至少一个R基因核苷酸序列。所述方法进一步包括使小麦植物在有利用于小麦植物生长和发育的条件下生长，并且任选地由所述小麦植物收获至少一个种子。

本发明另外提供了包含本发明的一个或多个核酸分子的植物、植物部分、种子、植物细胞、其他宿主细胞、表达盒和载体。

附图简述

图1.Schomburgk(Sr22)、EMS-诱导的易感突变体和易感对照Morocco的秆锈病感染表型。

图2.CS1D5406(Sr45)、EMS-诱导的易感突变体和易感对照Chinese Spring的秆锈病感染表型。

图3.在六倍体小麦(普通小麦(Triticum aestivum))中，在Sr22周围的标志物的连锁。

图4.在六倍体小麦中，在Sr45周围的标志物的连锁。

图5.通过测序EMS-诱导的易感突变体来克隆Sr22。Sr22的示意图显示内含子-外显子边界、蛋白质结构域结构、5'和3'UTR、以及错义和无义(*)突变的位置。还显示了通过RenSeq获得的Sr22和Sr45重叠群(contig)。3'重叠群被鉴定为由突变体的序列比较而得到的最佳候选物。3'和5'重叠群通过Sr22 RNAseq读值以及通过NCBI中全长NB-LRR的BLAST桥接。重叠群通过局部RenSeq和染色体步移进行延伸，并且通过PCR扩增并对得自基因组DNA的7.815kb片段的测序证明全长Sr22序列。

图6.通过测序EMS-诱导的易感突变体来克隆Sr45。Sr45的示意图显示内含子-外显子边界、蛋白质结构域结构、5'和3'UTR以及错义和无义(*)突变的位置。还显示了通过RenSeq获得的Sr45重叠群。3'重叠群被鉴定为由突变体的序列比较得到的最佳候选物。

图7.由二倍体(A基因组)和六倍体小麦鉴定的Sr22基因变体的邻接树分析。基于对小麦秆锈病的抗性假设的Sr22的存在或缺乏分别以“+”或“-”记号表示，在框、三角或圆内分别表示野生一粒小麦(T.boeoticum)、栽培一粒小麦(T.monococcum)或普通小麦起源。

图8.由Schomburgk得到的SR22的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。突出显示的结构域为使用SMART(可以在互联网上得到：smart.embl-heidelberg.de)预测的卷曲螺旋结构域(黑体；氨基酸120-147)、核苷酸结合结构域(下划线；氨基酸178-465)和富含亮氨酸重复结构域(斜体；氨基酸601-853)。

图9.由CS1D5406得到的SR45的氨基酸序列(SEQ ID NO:50)。突出显示的结构域为使用SMART(可以在互联网上得到：smart.embl-heidelberg.de)预测的卷曲螺旋结构域(黑体；氨基酸32-55)、核苷酸结合结构域(下划线；氨基酸175-452)和富含亮氨酸重复结构域(斜体；氨基酸578-867)。

图10A-10P.由以下二倍体和六倍体小麦得到的Sr22氨基酸序列的多重比对：PI573523(SEQ ID NO:14)、IG44878(SEQ ID NO:29)、DV92(SEQ ID NO:38)、PI289605(SEQID NO:8)、PI330550(SEQ ID NO:11)、PI190945(SEQ ID NO:5)、W3534(SEQ ID NO:35)、IG44857(SEQ ID NO:23)、IG44921(SEQ ID NO:26)、IG44855(SEQ ID NO:20)、Schomburgk(SEQ ID NO:2)、PI355523(SEQ ID NO:17)、PI272557(SEQ ID NO:32)和Westonia(SEQ IDNO:41)。

图11A-11E全部为多面板图，其示出由Fielder的秆锈病抗性测试得到的结果，其中所述Fielder使用得自Schomburgk的Sr22、得自PI190945的Sr22以及Sr45进行转化。在图11A-11E的各图中，白色标尺对应于10mm。

图11A示出使用构建体PC103转化的易感栽培品种Fielder的结果，其中所述构建体PC103包含得自Schomburgk(野生一粒小麦)的Sr22以及天然Sr22的5’和3’调控元件。图片示出6种转基因植物(编号PC103-1、-2、-3、-4、-5、-6)。发现所有的植物都对澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6具有抗性，类似于栽培品种Schomburgk(感染型2-)中的Sr22应答。在图像中，泳道1为Fielder(易感的对照)，而用泳道2至7分别为转基因系1至6。

图11B示出使用构建体PC129转化的易感栽培品种Fielder的结果，其中所述构建体PC129包含得自PI190945(栽培一粒小麦)的Sr22以及天然的5’和3’调控元件。回收总计13种转基因植物，并针对澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性进行评分。植物编号PC129-1、-4、-6、-7、-8、-10、-11、-13具有与PI190945(感染型2-)中的Sr22应答相似的抗性。所有这8种植物中，PC129-1、-4、-6、-11和-13示于图像中。一种植物(PC129-9)具有感染型2(稍微高于PI190945)，而3种植物(PC129-2、-5和-12)具有感染型2+(高于PI190945)。一种植物(PC129-3)具有感染型3+，其类似于Fielder。

图11C示出使用构建体PC110转化的易感栽培品种Fielder的结果，其中所述构建体PC110包含得自节节麦(Aegilops tauschii)编号AUS18911的Sr45以及天然的5’和3’调控元件。回收总计12种转基因植物，并针对澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性进行评分。7种植物(PC110-1、-2、-4、-5、-7、-10、-12)具有感染型1，其类似于AUS18911和CS1D5406中的Sr45。4种植物(PC110-3、-6、-9、-11)具有感染型1(稍微高于AUS18911)。一种植物(PC110-8)具有感染型3+，其类似于Fielder。

图11D-11E示出转基因植物的结果，所述转基因植物包含得自Schomburgk的Sr22、得自PI190945的Sr22和得自PI573523的Sr22以及天然的或非天然的调控元件。使用构建体PC126、PC127、PC128、PC130、PC131、PC132、PC146和PC147转化易感栽培品种Fielder。各构建体的启动子、编码区和终止子列于表6中。对于各构建体而言，针对澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性，对10种转基因植物进行评分。在图11D中，衍生自PC126、PC127、PC128、PC130和PC132的植物均具有抗性，并且感染型范围为1+至2，而衍生自PC131的植物均是易感的，并且感染型为3+。各构建体的代表性植物示于图片中。在图11E中，衍生自PC146的所有植物均是高度易感的，而衍生自PC147的植物(除了系列9)产生感染型1，是Sr45的强抗性反应的典型。

序列表

使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的3字母密码示出在所附的序列表中列出的核苷酸和氨基酸序列。核苷酸序列符合在序列5'末端开始，向前进行(即，在各行的左至右)至3'末端的标准惯例。仅示出各核苷酸序列的一条链，但是应该理解通过对所显示的链的任何参照而包含互补链。氨基酸序列符合在序列的氨基末端开始，向前进行(即，在各行的左至右)至羧基末端的标准惯例。

SEQ ID NO:1列出得自普通小麦“Schomburgk”的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:2列出由得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:3的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:4列出得自栽培一粒小麦编号PI190945的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:5列出由得自栽培一粒小麦编号PI190945的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6列出得自栽培一粒小麦编号PI190945的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:6的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:7列出得自栽培一粒小麦编号PI289605的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:8列出由得自栽培一粒小麦编号PI289605的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9列出得自栽培一粒小麦编号PI289605的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:9的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:10列出得自栽培一粒小麦编号PI330550的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:11列出由得自栽培一粒小麦编号PI330550的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12列出得自栽培一粒小麦编号PI330550的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:12的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:13列出得自栽培一粒小麦编号PI573523的抗性基因类似物的核苷酸序列。该抗性基因类似物为得自Schomburgk的Sr22的类似物。

SEQ ID NO:14列出由抗性基因类似物编码的蛋白质的氨基酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列。

SEQ ID NO:15列出由抗性基因类似物的编码区的核苷酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:13中列出的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:15的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:16列出得自栽培一粒小麦编号PI355523的抗性基因类似物的核苷酸序列。该抗性基因类似物为得自Schomburgk的Sr22的类似物。

SEQ ID NO:17列出由抗性基因类似物编码的蛋白质的氨基酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:16中列出的核苷酸序列。

SEQ ID NO:18列出抗性基因类似物的编码区的核苷酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:16中列出的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:18的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:19列出得自野生一粒小麦编号IG44855的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:20列出由得自野生一粒小麦编号IG44855的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21列出得自野生一粒小麦编号IG44855的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:21的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:22列出得自野生一粒小麦编号IG44857的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:23列出由得自野生一粒小麦编号IG44857的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:24列出得自野生一粒小麦编号IG44857的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:24的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:25列出得自野生一粒小麦编号IG44921的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:26列出由得自野生一粒小麦编号IG44921的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:27列出得自野生一粒小麦编号IG44921的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:27的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:28列出得自野生一粒小麦编号IG44878的抗性基因类似物的核苷酸序列。该抗性基因类似物为得自Schomburgk的Sr22的类似物。

SEQ ID NO:29列出由抗性基因类似物编码的蛋白质的氨基酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:28中列出的核苷酸序列。

SEQ ID NO:30列出抗性基因类似物的编码区的核苷酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:28中列出的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:30的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:31列出得自栽培一粒小麦编号PI272557的抗性基因类似物的核苷酸序列。该抗性基因类似物为得自Schomburgk的Sr22的类似物。

SEQ ID NO:32列出由抗性基因类似物编码的蛋白质的氨基酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:31中列出的核苷酸序列。

SEQ ID NO:33列出抗性基因类似物的编码区的核苷酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:31中列出的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:33的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:34列出得自普通小麦编号W3534的R基因Sr22的核苷酸序列。

SEQ ID NO:35列出由得自普通小麦编号W3534的Sr22编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:36列出得自普通小麦编号W3534的Sr22的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:36的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:37列出得自栽培一粒小麦编号DV92的抗性基因类似物的核苷酸序列。该抗性基因类似物为得自Schomburgk的Sr22的类似物。

SEQ ID NO:38列出由抗性基因类似物编码的蛋白质的氨基酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:37中列出的核苷酸序列。

SEQ ID NO:39列出抗性基因类似物的编码区的核苷酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:37中列出的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:39的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:40列出得自普通小麦‘Westonia’的抗性基因类似物的核苷酸序列。该抗性基因类似物为得自Schomburgk的Sr22的类似物。

SEQ ID NO:41列出由抗性基因类似物编码的蛋白质的氨基酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:40中列出的核苷酸序列。

SEQ ID NO:42列出抗性基因类似物的编码区的核苷酸序列，其中所述抗性基因类似物包含SEQ ID NO:40中列出的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:42的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:43列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的2S突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:44列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的7S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:45列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的1S突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:46列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的3S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:47列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的5S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:48列出得自普通小麦“Schomburgk”的Sr22的6S突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:49列出得自节节麦编号AUS18911的R基因Sr45的核苷酸序列。

SEQ ID NO:50列出得自节节麦编号AUS18911的Sr45编码的R蛋白质的氨基酸序列。

SEQ ID NO:51列出得自节节麦编号AUS18911的Sr45的cDNA的编码区的核苷酸序列。如果需要，终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)与包含SEQ ID NO:51的核酸分子的3'末端可操作地连接。

SEQ ID NO:52列出普通小麦代换系CS1D5406的52S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:53列出普通小麦代换系CS1D5406的57S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:54列出普通小麦代换系CS1D5406的59S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:55列出普通小麦代换系CS1D5406的49S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:56列出普通小麦代换系CS1D5406的55S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:57列出普通小麦代换系CS1D5406的61S1突变体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:58-137为下文实施例中描述的寡核苷酸序列。

SEQ ID NO:138列出实施例13中描述的启动子玉米泛素构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:139列出实施例13中描述的从节节麦得到的Sr33衍生的启动子Sr33天然构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:140列出实施例13中描述的从栽培一粒小麦编号PI190945的Sr22衍生的启动子PI190945天然构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:141列出实施例13中描述的从普通小麦“Schomburgk”的Sr22衍生的编码区-1Sr22基因座构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:142列出实施例13中描述的从普通小麦“Schomburgk”的Sr22衍生的编码区-2Sr22基因座驯化的BsaI构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:143列出实施例13中描述的从栽培一粒小麦编号PI190945的Sr22衍生的编码区-1PI190945构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:144列出实施例13中描述的从栽培一粒小麦编号PI190945的Sr22基因座衍生的编码区-2PI190945驯化的BsaI构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:145列出实施例13中描述的从栽培一粒小麦编号PI573523的Sr22衍生的编码区-1PI573523构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:146列出实施例13中描述的从栽培一粒小麦编号PI573523的Sr22衍生的编码区-2PI573523驯化的BsaI构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:147列出实施例13中描述的从节节麦的Sr33衍生的终止子Sr33天然构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:148列出实施例13中描述的从普通小麦“Schomburgk”的Sr22衍生的终止子Schomburgk驯化的BsaI构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:149列出实施例13中描述的从栽培一粒小麦编号PI190945的Sr22衍生的终止子PI190945驯化的BsaI构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:150列出实施例13中描述的从节节麦编号AUS18911的Sr45衍生的编码区Sr45基因座驯化的BsaI构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:151列出实施例13中描述的从全基因Sr33启动子Sr22编码区Sr33天然终止子构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:152-162列出在下表6中中描述的构建体的核苷酸序列。

SEQ ID NO:163列出双元载体pVecBARII的核苷酸序列，其还称为VecBARII。

发明详述

现在参照附图，下文将更全面地描述本发明，其中示出本发明的一些实施方案，但不是全部的实施方案。事实上，这些发明可以以多种不同的形式体现，并且不应该解释成限制于本发明列出的实施方案，而且提供这些实施方案，使得本发明公开满足适用的法律需要。在全文中，相同的数字是指相同的元件。

本文中列出的本发明的许多修改和其他的实施方案提醒本发明所属技术领域的任一技术人员，在上述说明书和相关的附图中呈现的教导的益处。因此，应该理解的是本发明不限于所公开的具体的实施方案，并且修改和其他的实施方案应该被包含在所附权利要求书的范围内。尽管在本发明中使用了具体的术语，但是它们仅是一般的且描述意义上的使用，不是为了限定的目的。

本发明涉及植物抗性(R)基因的分离，特别是赋予小麦植物以抵抗由小麦秆锈病菌引起的小麦秆锈病的R基因。如下文所公开，使用快速克隆R基因的3步方法来分离R基因，Sr22和Sr45。称为“RenSeq+EMS”的方法涉及(i)化学诱变和针对易感突变体的筛选，(ii)外显子捕获和下一代测序；然后(iii)野生型与突变体的序列比较。RenSeq+EMS方法在均于2015年2月20日提交的美国专利申请号14/667,116和国际专利申请PCT/US2015/016792中公开。

本发明提供了包含R基因的核苷酸序列，特别是Sr22和Sr45的核苷酸序列，以及其天然形成的(例如直系同源物和等位基因变体)和合成的或人工的(即，非天然形成的)变体的核酸分子。这种R基因的核苷酸序列(在本发明中还称为R基因核苷酸序列)编码R蛋白质。本发明的R基因核苷酸序列包括但不限于野生型R基因(其包含天然启动子和包含编码区的3′相邻区)，cDNA序列，和仅包含编码区的核苷酸序列。这种R基因核苷酸序列的实例包括SEQ ID NO:1、3、4和6中列出的核苷酸序列及其变体。在其中天然R基因启动子不用于驱动编码R蛋白质的核苷酸序列的表达的实施方案中，异源启动子与编码本发明的R蛋白质的核苷酸序列可操作地连接，从而驱动编码R蛋白质的核苷酸序列在植物中表达。

优选地，本发明的R蛋白质为功能R蛋白质，其能够赋予包含R蛋白质的小麦植物以抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。在某些实施方案中，本发明的R蛋白质包括抵抗小麦秆锈病菌的多个物种的广谱抗性，例如Sr22和Sr45编码的R蛋白质。

本发明进一步提供了包含多核苷酸构建体的转基因植物，其中所述构建体包含本发明的R基因核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸构建体被稳定地引入至植物的基因组中，而在其他的实施方案中，通过瞬时转化方法转化植物，并且所述多核苷酸构建体不稳定地引入至植物的基因组中。用于植物的稳定的和瞬时转化的方法在本发明的其他处公开，或者在本领域中是已知的。在本发明的优选的实施方案中，转基因植物为小麦植物，其包含抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。

在某些实施方案中，本发明的转基因植物包含多核苷酸构建体，其包含编码R蛋白质的核苷酸序列和可操作地连接的用于表达编码R蛋白质的核苷酸序列的异源启动子。异源启动子的选择可以取决于多种因素，例如所需的时机、位置和表达方式，以及对特定生物或非生物刺激的应答。目的启动子包括但不限于病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。

在本发明的某些实施方案中，转基因植物，特别是转基因小麦植物，可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多的编码R蛋白质的核苷酸序列。通常但是不必须，2个或更多的R蛋白质彼此不同。就本发明而言，当2种R蛋白质具有不一致的氨基酸序列时，R蛋白质不同于另一种R蛋白质。在本发明的某些实施方案中，用于小麦秆锈病的各种不同的R蛋白质在抗性特征方面具有一种或多种差异，例如抵抗不同物种和/或几组物种的小麦秆锈病菌的抗性。应该认识到通过将2个、3个、4个、5个、6个或更多的核苷酸序列与编码用于小麦秆锈病的不同R蛋白质的各个核苷酸序列组合，可以产生包含抵抗小麦秆锈病菌的多个物种的广谱抗性的小麦植物。这种小麦植物发现用于已知形成小麦秆锈病菌的多个物种的地区的农业中。

可以在单一小麦植物中与本发明的Sr22和/或Sr45核苷酸序列组合的小麦秆锈病R基因的实例包括Sr26、Sr32、Sr33(GenBank编号KF031299.1)、Sr35(GenBank编号KC573058.1)、Sr39、Sr40、Sr47、Sr50及成株抗性基因Sr57/Lr34(GenBank编号FJ436983.1)和Sr55/Lr67。

包含多重R基因的本发明的转基因植物可以通过使用包含本发明的R基因核苷酸序列(包括例如Sr22或Sr45核苷酸序列或其变体)的多核苷酸构建体转化已经包含一个或多个其他的R基因核苷酸序列的植物来产生。已经包含一个或多个其他的R基因核苷酸序列的此类植物可以包含对于基因组或植物而言是天然的R基因，其通过有性生殖被引入至植物中，或者通过使用R基因核苷酸序列转化植物或其祖先而被引入。备选地，可以通过例如转化或有性生殖将一个或多个其他的R基因核苷酸序列引入至本发明的转基因植物中，其已经包含本发明的多核苷酸构建体。

在其他的实施方案中，2个或更多个不同的R基因序列可以通过使用包含2个或更多个R基因核苷酸序列的多核苷酸构建体或载体稳定地转化植物而被引入至所述植物中。应该认识到这种方法对于植物育种而言是优选的，这是因为预计2个或更多个R基因核苷酸序列将紧密地连锁，因此隔离单一的基因座。备选地，可以使用在本发明中其他处描述的或者本领域已知的基于同源重组的基因组修饰方法将本发明的多核苷酸构建体以与另一个R基因核苷酸序列紧密相邻的方式引入至植物的基因组中。

本发明进一步提供了用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法。所述方法包括将本发明的多核苷酸构建体引入至至少一种小麦植物细胞中。在某些实施方案中，多核苷酸构建体被稳定地引入至小麦植物细胞的基因组中。如果需要，所述方法可以进一步包括使植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的小麦植物。优选地，相对于对照小麦植物抵抗由小麦秆锈病菌的至少一种物种引起的小麦秆锈病的抗性而言，这种再生的小麦植物包含抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。如果需要，所述方法可以进一步包括产生小麦植物，如上文所述，所述植物包含编码R蛋白质的1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个核苷酸序列，优选地每个核苷酸序列均编码不同的R蛋白质。

本发明公开的小麦植物在用于农业农作物生产(特别是在其中小麦秆锈病盛行的地区)中限制小麦秆锈病的方法中具有用途。本发明的方法包括种植由本发明的小麦植物产生的小麦种子，其中所述小麦种子包含本发明的至少一个R基因核苷酸序列。所述方法进一步包括使小麦植物在有利于小麦植物生长和发育的条件下生长，并且任选地，由小麦植物收获至少一个种子。116本发明另外提供了用于鉴定小麦植物的方法，其中所述小麦植物展示出新赋予的或增强的抵抗小麦秆锈病的抗性。所述方法在育种用于抵抗小麦秆锈病的小麦植物中具有用途。这种抗性小麦植物在小麦种子的农业生产中具有用途。所述方法包括检测小麦植物中至少一种R基因的存在情况，其中所述R基因选自Sr22和Sr45。在本发明的一些实施方案中，检测R基因的存在情况包括检测由小麦植物分离的基因组DNA中的完整R基因。但是，在优选的实施方案中，检测R基因的存在情况包括检测R基因中至少一种标志物的存在情况。在本发明的其他实施方案中，检测R基因的存在情况包括使用例如免疫检测方法(涉及对R蛋白质具有特异性的抗体)检测由R基因编码的R蛋白质的存在情况。

在用于鉴定小麦植物的方法中，其中所述小麦植物展示出新赋予的或增强的抵抗小麦秀病菌的抗性，检测小麦中R基因的存在情况可以涉及在本发明的其他处公开的或本领域已知的以下分子生物学技术的一种或多种，包括但不限于由小麦植物分离基因组DNA和/或RNA，通过PCR扩增而扩增包含R基因和/或其标志物的核酸分子，对包含R基因和/或标志物的核酸分子测序，通过核酸杂交鉴定R基因、标志物或R基因的转录物，以及针对R基因编码的R蛋白质的检测实施免疫测定法。应该认识到寡核苷酸探针和PCR引物可以设计成鉴定本发明的R基因，并且这种探针和PCR引物可以用于本发明其他处公开的或本领域已知的方法中，用于快速鉴定小麦植物群体中一种或多种包含本发明的R基因的小麦植物。

根据所需的结果，本发明的多核苷酸构建体可以被稳定地引入至植物细胞的基因组中，或者不稳定地引入至植物细胞的基因组中。例如如果所需的结果是为了产生稳定转化的植物，该植物具有抵抗小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性，则所述多核苷酸构建体可以例如被融合至适用于将多核苷酸构建体稳定地引入植物细胞基因组中的植物转化载体中。通常，稳定转化的植物细胞将再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的转化的植物。这种稳定转化的植物能够通过有性和/或无性生殖在随后的传代中将所述多核苷酸构建体传送至后代植物中。植物转化的载体、使用引入的多核苷酸构建体稳定地转化植物的方法以及由转化的植物细胞和组织使植物再生的方法对于单子叶植物和双子叶植物而言是本领域公知的，或者在本发明的其他处有所描述。

本发明提供了包含R基因的核苷酸分子。优选地，这种R基因能够赋予宿主植物(特别是小麦植物)以抵抗引起小麦秆锈病的病原体(小麦秆锈病菌)的至少一个物种的增强的抗性。因此，这种R基因在农业生产中在限制由小麦秆锈病菌引起的小麦秆锈病中具有用途。本发明的R基因包括但不限于其核苷酸序列在本发明中公开的R基因，但还包括能够赋予小麦植物以抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的抗性的直系同源物和其他的变体。本领域已知或本发明另外公开的方法用于确定植物抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的秆锈病的抗性。

本发明的方法在生产小麦植物中具有用途，其中所述小麦植物具有抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的秆锈病的增强的抗性。通常，与对照小麦植物抵抗小麦秆锈病菌的相同物种或多个物种的抗性相比，本发明的方法将题述小麦植物抵抗小麦秆锈病菌的至少一个物种的抗性增强或增加至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、500％或更高。除非另外陈述或者由使用内容显而易见，否则用于本发明的对照植物为不包含本发明的多核苷酸构建体的植物。优选地，对照植物与包含本发明的多核苷酸构建体的植物是基本一致的(例如相同的物种、亚种和变体)，不同之处在于所述对照不包含所述多核苷酸构建体。在一些实施方案中，所述对照包含多核苷酸构建体，但是不包含在本发明的多核苷酸构建中的一个或多个R基因序列。

此外，本发明提供了通过本发明的方法产生的和/或包含本发明的多核苷酸构建体的转化的植物、种子和植物细胞。此外，提供了包含本发明的多核苷酸构建体的后代植物及其种子。本发明还提供了通过本发明的转化的植物和/或后代植物产生的种子、蔬菜部分和其他植物部分以及由这种植物部分产生的、旨在被人和其他动物消耗或使用的食物产物和其他农业产物，所述其他动物包括但不限于宠物(例如狗和猫)和家畜(例如猪、奶牛、小鸡、火鸡和鸭子)。

本发明的组合物和方法的非限定性实例如下：

1.包含核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自：

(a)SEQ ID NO:1、4、7、10、19、22、25、34或49中列出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的；

(c)SEQ ID NO:3、6、9、12、21、24、27、36或51中列出的核苷酸序列；

(d)与(a)或(c)中列出的核苷酸序列的至少一种具有至少85％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的；以及

(e)包含编码氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，其中所述氨基酸序列与(c)中列出的至少一种氨基酸序列具有至少85％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的。

2.实施方案1的核酸分子，其中所述核酸分子为分离的核酸分子。

3.实施方案1或2的核酸分子，其中(d)或(e)的所述核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复结构域的蛋白质。

4.实施方案3的核酸分子，其中所述卷曲螺旋结构域、所述核苷酸结合结构域和所述富含亮氨酸重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:2或50中对应的结构域具有至少95％,96％,97％,98％,99％或100％的氨基酸序列。

5.实施方案3或4的核酸分子，其中所述富含亮氨酸重复结构域包含选自以下的氨基酸：在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸607的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，在对应于SEQ IDNO:2的氨基酸650的氨基酸位置处的酪氨酸(Y)，在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸651的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，以及在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸657的氨基酸位置处的甘氨酸(G)。

6.表达盒，其包含实施方案1-5中任意一项的核酸分子以及可操作地连接的异源启动子。

7.载体，其包含实施方案1-5中任意一项的核酸分子或者实施方案6的表达盒。

8.实施方案7的载体，其进一步包含其他的小麦秆锈病抗性基因。

9.实施方案8的载体，其中所述其他的小麦秆锈病抗性基因选自Sr26、Sr32、Sr33、Sr39、Sr40、Sr47和Sr50。

10.使用实施方案1-5中任意一项的核酸分子、实施方案6的表达盒或实施方案7-9中任意一项的载体转化的宿主细胞。

11.实施方案10的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞、细菌、真菌细胞或动物细胞。

12.实施方案10或11的宿主细胞，其中所述宿主细胞不是野生一粒小麦或栽培一粒小麦。

13.使用实施方案1-5中任意一项的核酸分子、实施方案6的表达盒或实施方案7-9中任意一项的载体转化的植物。

14.实施方案13的植物，其中所述植物为小麦植物。

15.实施方案14的植物，其中所述小麦植物不是野生一粒小麦或栽培一粒小麦。

16.包含在其基因组中稳定地引入多核苷酸构建体的转基因植物或种子，其中所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO:1、4、7、10、19、22、25、34或49中列出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的；

(c)SEQ ID NO:3、6、9、12、21、24、27、36或51中列出的核苷酸序列；

(d)与(a)或(c)中列出的核苷酸序列的至少一种具有至少85％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的；以及

(e)包含编码氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，其中所述氨基酸序列与(c)中列出的至少一种氨基酸序列具有至少85％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的。

17.实施方案16的转基因植物或种子，其中(d)或(e)的所述核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复结构域的蛋白质。

18.实施方案17的转基因植物或种子，其中所述卷曲螺旋结构域、所述核苷酸结合结构域和所述富含亮氨酸重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:2或50中对应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

19.实施方案17或18的转基因植物或种子，其中所述富含亮氨酸重复结构域包含选自以下的氨基酸：在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸607的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸650的氨基酸位置处的酪氨酸(Y)，在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸651的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，以及在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸657的氨基酸位置处的甘氨酸(G)。

20.实施方案16-19中任意一项的转基因植物或种子，其中所述多核苷酸构建体包含(b)-(e)中任意一项的核苷酸序列并且进一步包含可操作地连接的用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

21.实施方案20的转基因植物或种子，其中所述启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。

22.实施方案16-21中任意一项的转基因植物或种子，其中所述转基因植物为小麦植物并且所述转基因种子为小麦种子。

23.实施方案22的转基因植物或种子，其中相对于对照小麦植物而言，所述转基因植物或种子包含抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。

24.实施方案22或23的转基因植物或种子，其中所述多核苷酸构建体包含编码用于小麦秆锈病的R蛋白质的至少2个核苷酸序列。

25.实施方案24的转基因植物或种子，其中所述编码用于小麦秆锈病的R蛋白质的至少2个核苷酸序列的每一个编码用于小麦秆锈病的不同的R蛋白质。

26.用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法，所述方法包括将多核苷酸构建体引入至少一种小麦植物细胞中，所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO:1、4、7、10、19、22、25、34或49中列出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的；

(c)SEQ ID NO:3、6、9、12、21、24、27、36或51中列出的核苷酸序列；

(d)与(a)或(c)中列出的核苷酸序列的至少一种具有至少85％序列一致性的核苷酸序列，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的；以及

(e)包含编码氨基酸序列的核苷酸序列的核酸分子，其中所述氨基酸序列与(c)中列出的至少一种氨基酸序列具有至少85％序列一致性，其中所述核酸分子能够赋予包含所述核酸分子的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述核苷酸序列不是天然形成的。

27.实施方案26的方法，其中(d)或(e)的所述核酸分子编码包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复结构域的蛋白质。

28.实施方案27的方法，其中所述卷曲螺旋结构域、所述核苷酸结合结构域和所述富含亮氨酸重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:2或50中对应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

29.实施方案27或28的方法，其中所述富含亮氨酸重复结构域包含选自以下的氨基酸：在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸607的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，在对应于SEQ IDNO:2的氨基酸650的氨基酸位置处的酪氨酸(Y)，在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸651的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，以及在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸657的氨基酸位置处的甘氨酸(G)。

30.实施方案26-29中任意一项的方法，其中所述多核苷酸构建体被稳定地引入所述植物细胞的基因组中。

31.实施方案26-30中任意一项的方法，其中所述小麦植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的小麦植物。

32.实施方案26-31中任意一项的方法，其中所述多核苷酸构建体包含(b)-(e)中任意一项的核苷酸序列并且进一步包含可操作地连接的用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

33.实施方案32的方法，其中所述启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。

34.实施方案26-33中任意一项的方法，其中相对于对照小麦植物而言，包含所述多核苷酸构建体的所述小麦植物包含抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。

35.实施方案26-34中任意一项的方法，其中所述多核苷酸构建体包含编码小麦秆锈病的R蛋白质的至少2个核苷酸序列。

36.实施方案35的方法，其中所述编码用于小麦秆锈病的R蛋白质的所述至少2个核苷酸序列的每一个编码用于小麦秆锈病的不同的R蛋白质。

37.通过实施方案26-36中任意一项的方法产生的小麦植物。

38.实施方案37的小麦植物的种子，其中所述种子包含所述多核苷酸构建体。

39.在农业农作物生产中限制小麦秆锈病的方法，所述方法包括种植根据实施方案22-25和38中任意一项的小麦种子以及使小麦植物在有利于所述小麦植物生长和发育的条件下生长。

40.实施方案39的方法，其进一步包含由所述小麦植物收获至少一个种子。

41.实施方案22-25、37和38中任意一项的小麦植物或种子在农业中的用途。

42.使用实施方案22-25、37和38中任意一项的小麦植物或种子生产的人类或动物食物产品。

43.包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

(a)由SEQ ID NO:1、4、7、10、19、22、25、34或49中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35或50中列出的氨基酸序列；

(c)由SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；以及

(d)与(c)中列出的至少一个氨基酸序列具有至少85％序列一致性的氨基酸序列，其中包含所述氨基酸序列的多肽能够赋予包含所述多肽的小麦植物以抵抗秆锈病的抗性，并且任选地，其中所述多肽不是天然形成的。

44.实施方案43的多肽，其中(d)的所述多肽包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复结构域。

45.实施方案44的多肽，其中所述卷曲螺旋结构域、所述核苷酸结合结构域和所述富含亮氨酸重复结构域的至少一种包含与SEQ ID NO:2或50中对应的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列。

46.实施方案44或45的多肽，其中所述富含亮氨酸重复结构域包含选自以下的氨基酸：在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸607的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，在对应于SEQ IDNO:2的氨基酸650的氨基酸位置处的酪氨酸(Y)，在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸651的氨基酸位置处的丝氨酸(S)，以及在对应于SEQ ID NO:2的氨基酸657的氨基酸位置处的甘氨酸(G)。

47.用于鉴定小麦植物的方法，其中所述小麦植物展示新赋予的或增强的抵抗小麦秆锈病的抗性，所述方法包括检测所述小麦植物中选自Sr22和Sr45的R基因的存在情况。

48.实施方案47的方法，其中所述R基因的存在情况是通过检测所述R基因中至少一种标志物而检测的。

49.实施方案47或48的方法，其中所述方法包括检测Sr22和Sr45两者的存在情况。

50.实施方案47-49中任意一项的方法，其中所述Sr22包含SEQ ID NO:1、4、7、10、19、22、25或34中列出的所述核苷酸序列或由其组成，并且所述Sr45包含SEQ ID NO:49中列出的核苷酸序列或由其组成。

51.实施方案47-50中任意一项的方法，其中检测所述R基因的存在情况包括选自以下的一种：PCR扩增、核酸测序、核酸杂交以及用于检测R基因编码的R蛋白质的免疫测试。

52.通过实施方案47-51中任意一项的方法鉴定的小麦植物。

53.实施方案52的小麦植物的种子。

本发明的方法和组合物的其他实施方案在本发明的其他处描述。

本发明的方法用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性，特别是由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的秆锈病。本发明的优选的植物为小麦植物、小麦种子、小麦植物部分和小麦植物细胞。如本文所用，术语“小麦植物”通常是指作为小麦属的成员或者在小麦族(Triticeae tribe)内另一个属的成员的植物，特别是能够与至少一个小麦物种产生种间杂交物的另一个属的成员。这种小麦族内另一个属的实例为山羊草属和黑麦属。

本发明的小麦植物包括例如驯化的或非驯化的植物。本发明的小麦植物包括但不限于下述小麦属、山羊草属和黑麦属物种：普通小麦、栽培一粒小麦、圆锥小麦(T.turgidum)、野生一粒小麦、提莫菲维小麦(T.timopheevii)、乌拉尔图小麦(T.urartu)、粗山羊草(A.tauschii)、黑麦(S.cereale)及它们的杂交物。本发明中所包含的普通小麦亚种的实例是普通(普通小麦)、密穗(密穗小麦)、莫迦(莫迦小麦)、瓦维洛夫(瓦维洛夫小麦)、斯卑尔脱和印度圆粒小麦(sphaecrococcum，shot wheat)。本发明中所包含的圆锥小麦亚种的实例是圆锥(turgidum)、波斯(carthlicum)、二粒(dicoccom)、硬质(durum)、paleocoichicum、波兰(polonicum)、东方(turanicum)和野生二粒(dicoccoides)。本发明中所包含的栽培一粒小麦亚种的实例是一粒(单粒)和aegilopoide。在本发明的一个实施方案中，小麦植物为圆锥小麦物种的一员；具体为硬质小麦亚种的一员，例如Ciccio、Colosseo或Utopia栽培品种。应该认识到本发明的小麦植物可以是驯化的或非驯化的小麦植物。

本发明还涵盖了包含本发明的R基因的黑小麦植物、黑小麦植物部分和黑小麦植物细胞。如本文所用，“黑小麦植物”是指通过将黑麦植物(黑麦(Secale cereale))与四倍体小麦植物(例如圆锥小麦)或六倍体小麦植物(例如普通小麦)杂交而创建的植物。本发明还包括通过本发明所述黑小麦植物产生的种子，以及在本发明所述黑小麦植物附近控制杂草的方法。如本文所用，术语“小麦植物”涵盖了黑小麦植物，除非另外陈述或由使用内容显而易见。

术语“小麦植物”意图涵盖处于成熟或发育的任何阶段的小麦植物，以及由任何这种植物取得的或衍生的任何组织或器官(植物部分)，除非内容中另外清楚地说明。植物部分包括但不限于茎、根、花朵、胚珠、雄蕊、叶子、胚芽、分生区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体等。本发明还包括通过本发明的小麦植物产生的种子。

在本发明的一个实施方案中，编码R蛋白质的核苷酸序列与SEQ ID NO:1中列出的完整的核苷酸序列或其片段具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在本发明的另一个实施方案中，编码R蛋白质的核苷酸序列与SEQ ID NO:3中列出的完整的核苷酸序列或其片段具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。

本发明涵盖分离的或基本纯化的多核苷酸(在本发明中还称为“核酸分子”、“核酸”等)或蛋白质(在本发明中还称为“多肽”)组合物，其包含例如在所附的序列表中列出的序列的多核苷酸和蛋白质以及这种多核苷酸和蛋白质的变体和片段。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质或者其生物活性部分基本上或本质上不含在其天然形成环境中发现的正常情况下与所述多核苷酸或蛋白质伴随或相互作用的成分。因此，当通过重组技术生产时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质基本上不含其他的细胞物质或培养介质，或者当化学合成时，基本上不含化学前体或其他化学物质。最佳地，在衍生多核苷酸的有机体的基因组DNA中，“分离的”多核苷酸不含天然情况下位于所述多核苷酸的侧翼(即，位于所述多核苷酸的5'和3'末端的序列)的序列(最佳地，蛋白质编码序列)。例如在多个实施方案中，分离的多核苷酸可以包含少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列天然情况下位于衍生所述多核苷酸的细胞的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼。基本上不含细胞物质的蛋白质包括蛋白质的制备物，其具有少于大约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染蛋白质。当本发明的蛋白质或其生物活性部分以重组方式生产时，最佳的培养介质表示少于大约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或目的非蛋白质化学物质。

本发明公开的多核苷酸及由其编码的蛋白质的片段和变体也涵盖在本发明的范围内。“片段”是指多核苷酸的部分，或氨基酸序列及因此由其编码的蛋白质的部分。包含编码序列的多核苷酸的片段可以编码保留全长或天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段。备选地，用作杂交探针的多核苷酸的片段通常不编码保留生物活性或不保留启动子活性的蛋白质。因此，核苷酸序列的片段可以为至少大约20个核苷酸、大约50个核苷酸、大约100个核苷酸以及多至本发明的全长的多核苷酸。

作为天然R多核苷酸的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、125、150、175、200、300、400、500、1000、2000、5000、7500或9500个相邻的核苷酸，或者多至本发明公开的全长R多核苷酸中存在的核苷酸的数量(例如SEQ ID NO:1中9859个核苷酸)。

“变体”是指基本相似的序列。就多核苷酸而言，变体包括具有以下的多核苷酸：在5'和/或3'末端的删除(即，截短)；在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处一个或多个核苷酸的删除和/或加入；和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然的”多核苷酸或多肽分别包括天然形成的核苷酸序列或氨基酸序列。就多核苷酸而言，保守的变体包括由于遗传密码的简并性而编码本发明的一种R蛋白质的氨基酸序列的那些序列。天然形成的等位基因变体例如这些可以使用公知的分子生物学技术鉴定，例如下文概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括合成衍生的多核苷酸，例如通过使用定点诱变生成但是仍然编码本发明的R蛋白质的那些。通常，本发明的特定的多核苷酸的变体与特定的多核苷酸具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，这是通过本发明其他处所述的序列比对程序和参数测定。在本发明的某些实施方案中，本发明的特定的多核苷酸变体与选自SEQ ID NO:1、3、4、6、7、9、10、12、19、21、22、24、25、27、34、36、49和51的至少一个核苷酸序列具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，并且任选地，包含与SEQ ID NO:1、3、4、6、7、9、10、12、19、21、22、24、25、27、34、36、49和/或51中列出的核苷酸序列具有至少一个核苷酸修饰的不同的非天然形成的核苷酸序列，其中所述核苷酸修饰选自至少一个核苷酸的取代、至少一个核苷酸的加入和至少一个核苷酸的删除。

还可以通过比较变体多核苷酸编码的多肽与参照多核苷酸编码的多肽之间的百分序列一致性来评价本发明的特定的多核苷酸(即，参照多核苷酸)的变体。因此，公开了例如编码多肽的多核苷酸，其中所述多肽与SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35和50的至少一个的多肽具有给定的百分序列一致性。可以使用本发明其他处描述的序列比对程序和参数来计算任2个多肽之间的百分序列一致性。在通过比较本发明的任意给定的一对多核苷酸所编码的2个多肽所共有的百分序列一致性来评价所述这对多核苷酸的情况下，2个编码的多肽之间的百分序列一致性为至少大约60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在本发明的某些实施方案中，本发明的特定的多肽的变体与选自SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35和50中的至少一个氨基酸序列具有至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，并且任选地，包含与SEQ IDNO:2、5、8、11、20、23、26、35和/或50中列出的氨基酸序列具有至少一个氨基酸修饰的不同的非天然形成的氨基酸序列，其中所述氨基酸修饰选自至少一个氨基酸的取代、至少一个氨基酸的加入和至少一个氨基酸的删除。

“变体”蛋白质是指通过以下方式由天然蛋白质衍生的蛋白质：在天然蛋白质的N-末端和/或C-末端处的一个或多个氨基酸的删除(所谓的截短)；在天然蛋白质的一个或多个内部位点处的一个或多个氨基酸的删除和/或加入；或者在天然蛋白质的一个或多个位点处的一个或多个氨基酸的取代。这种变体可以得自例如遗传多态性或得自人类的操作。R蛋白质的生物活性变体与天然蛋白质的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35和/或50中列出的氨基酸序列)具有至少大约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性，这是通过在本发明中其他处所述序列比对程序和参数测定。本发明的蛋白质的生物活性变体与所述蛋白质可以具有1-15个氨基酸残基、1-10个(例如6-10)、5个、4、3、2或者甚至1个氨基酸残基的不同。

本发明的蛋白质可以以多种方式改变，包括氨基酸取代、删除、截短和插入。用于这种操作的方法是本领域公知的。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域公知的。例如参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel et al.(1987)Methodsin Enzymol.154:367-382；U.S.Patent No.4,873,192；Walker and Gaastra,eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)和其中引用的参考文献。不影响目的蛋白质的生物活性的合适的氨基酸取代的指导可以在Dayhoff et al.(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到，该文献以引用方式并入本文。保守性取代(例如将一个氨基酸与具有相似性质的另一个氨基酸交换)可以是最佳的。

因此，本发明的基因和多核苷酸包括天然形成的序列以及突变体和其他变体形式。类似地，本发明的蛋白质涵盖天然形成的蛋白质以及其改变和修饰形式。更优选地，这种变体赋予包含该变体的植物或其部分以抵抗由小麦秆锈病菌的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。在一些实施方案中，在编码变体的DNA中形成的突变不会将所述序列置于阅读框外。最佳地，突变不会创建会产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公开号75,444。

预计本发明涵盖的蛋白质序列的删除、插入和取代在蛋白质的特征中不会产生自由基变化。但是，在进行取代、删除或插入之前难以预计此类操作的确切作用时，本领域的技术人员将理解所述作用通过常规的筛选测定法来评价。换言之，可以通过下文公开的测定法来评价活性。

例如可以使用Sr22或Sr45多核苷酸转化小麦植物，该小麦植物对于由小麦秆锈病菌的特定物种引起的小麦秆锈病是易感的，然后所述小麦植物再生成包含所述多核苷酸的转化的或转基因的植物，并使用本领域已知的或本发明中其他处所述标准的抗性测定法，针对由小麦秆锈病菌的特定物种引起的小麦秆锈病的抗性进行测试。本发明的优选的变体多核苷酸或多肽赋予或者能够赋予小麦植物以抵抗小麦秆锈病菌的至少一个物种的增强的抗性，其中已知所述小麦秆锈病菌在易感小麦植物中会引起小麦秆锈病。

变体多核苷酸和蛋白质还涵盖由诱变和重组过程(例如DNA改组)衍生的序列和蛋白质。这种DNA改组的策越是本领域已知的。例如参见Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer(1994)Nature370:389-391；Crameriet al.(1997)Nature Biotech.15:436-438；Moore et al.(1997)J.Mol.Biol.272:336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature 391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。

本发明的多核苷酸可以用于从其他有机体，特别是其他植物，分离相应的序列。在这种方式中，诸如PCR、杂交等之类的方法可以用于基于它们的序列与本发明列出的序列的同源性来鉴定这种序列。基于它们的序列与本发明列出的完整序列或者其变体和片段的序列一致性而分离的序列被涵盖在本发明之内。这种序列包括作为本发明公开的序列的直系同源物的序列。“直系同源物”是指由共同的祖先基因衍生并且作为物种形成的结果在不同物种中发现的基因。当在不同的物种中发现的基因的核苷酸序列和/或它们编码的蛋白质序列共享至少60％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性时，任何这些基因是直系同源物。在多种物种中，直系同源物的功能通常是高度保守的。因此，编码R蛋白质并且在严谨条件下与本发明公开的或者本领域已知的至少一种R蛋白质杂交的分离的多核苷酸、或者它们的变体或片段被涵盖在本发明之内。

在一个实施方案中，本发明的直系同源物具有编码序列，其与选自SEQ ID NO:1、3、4、6、7、9、10、12、19、21、22、24、25、27、34、36、49和51中列出的核苷酸序列的核苷酸序列包含至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸序列一致性，和/或本发明的直系同源物编码蛋白质，其与选自SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26、35和50中列出的氨基酸序列的氨基酸序列包含至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的氨基酸序列一致性。

如图8和9所示，SR22和SR45蛋白质包含某些保守的结构域。在得自Schomburgk(包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列)的SR22中，保守的结构域包含例如卷曲螺旋结构域(氨基酸120-147)、核苷酸结合结构域(氨基酸178-465)和富含亮氨酸重复结构域(氨基酸601-853)。在SR45(包含SEQ ID NO:50中列出的氨基酸序列)中，保守的结构域包含例如卷曲螺旋结构域(氨基酸32-55)、核苷酸结合结构域(氨基酸175-452)和富含亮氨酸重复结构域(氨基酸578-867)。优选地，本发明的变体SR22和SR45蛋白质包含对应于分别在图8和9中示出的结构域的卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富含亮氨酸重复结构域。

在一些实施方案中，与本发明公开的SR22(例如SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26或35)或SR45(例如SEQ ID NO:50)蛋白质的一个或多个全长氨基酸序列相比，本发明的变体SR22和SR45蛋白质包含与1个、2个或3个这种保守结构域的更高百分率的氨基酸序列一致性。优选地，这种变体包含相应的结构域或多个结构域，所述结构域与图8所示的1个、2个或3个保守的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性，并且所述变体进一步包含氨基酸序列，该序列与选自SEQ ID NOS:2、5、8、11、20、23、26、35和50中列出的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。

在一些实施方案中，本发明的变体SR22蛋白质包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的以下氨基酸中的至少一种，其中所述氨基酸在SR22蛋白质(包含SEQ ID NO:2、5、8、11、20、23、26和35中列出的氨基酸序列)的富含亮氨酸重复结构域中是保守的：在氨基酸位置607处的丝氨酸(S)，在氨基酸位置650处的酪氨酸(Y)，在氨基酸位置651处的丝氨酸(S)，以及在氨基酸位置657处的甘氨酸(G)。在优选的实施方案中，变体SR22蛋白质包含1个、2个、3个或4个这些保守的氨基酸，并且任选地包含与选自SEQ ID NOS:2、5、8、11、20、23、26、35和50中列出的氨基酸序列的氨基酸序列具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，并且备选地包含或者任选地进一步包含与分别在图8中所示的1个、2个或3个保守的结构域具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的相应的结构域或多个结构域。

应该认识到变体SR22和SR45蛋白质中的结构域(对应于图8和9中所示的那些保守的结构域)以及其中任何特定的保守的氨基酸可以通过本领域那些技术人员已知的或者本发明其他处公开的方法鉴定，例如多重序列比对。进一步认识到在特定的变体SR22和SR45中的这种保守的结构域和保守的氨基酸的位置可以由SEQ ID NO:2和50中列出的氨基酸序列中的位置处改变，并且通过诸如多重序列比对之类的方法，针对本发明的任何变体SR22或SR45蛋白质，可以测定这种保守的结构域和保守的氨基酸的相应位置。

优选地，本发明的变体SR22或SR45蛋白质以及编码它们的多核苷酸赋予或者能够赋予包含这种蛋白质或多核苷酸的小麦植物以抵抗小麦秆锈病菌的至少一个物种的增强的抗性，其中已知所述小麦秆锈病菌在易感小麦植物中引起小麦秆锈病。

在PCR方法中，可以将寡核苷酸引物设计用于PCR反应中，以从由任何目的植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York)中公开。还参见Inniset al.,eds.(1990)PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(AcademicPress,New York)；Innis and Gelfand,eds.(1995)PCR Strategies(Academic Press,NewYork)和Innis and Gelfand,eds.(1999)PCR Methods Manual(Academic Press,NewYork)。已知的PCR方法包括但不限于使用成对引物、套式引物、单一特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。

在杂交技术中，使用已知多核苷酸的全部或部分作为探针，该探针与由所选有机体得到的克隆基因组DNA片段或cDNA片段的群体(即，基因组或cDNA文库)中存在的其他相应的多核苷酸选择性地杂交。杂交探针可以为基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以使用可检测基团(例如³²P)或任何其他的可检测标志物进行标记。因此，例如用于杂交的探针可以通过基于本发明的多核苷酸的加标记的合成寡核苷酸制成。用于制备杂交用探针以及用于cDNA和基因组文库构建的方法通常是本领域已知的，并且在Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2ded.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Plainview,New York)中公开。

例如本发明公开的完整多核苷酸或者其一个或多个部分可以用作能够与相应的多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了在多种条件下取得特异性杂交，这种探针包含在基因序列或者目的序列的cDNA中是独特的序列，并且最佳地，长度为至少大约10个核苷酸，最佳地长度为至少大约20个核苷酸。这种探针可以用于通过PCR扩增用于由所选植物得到的特定目的基因的相应多核苷酸。这种技术可以用于由所需的植物分离其他的编码序列，或者作为诊断测定法来确定植物中编码序列的存在情况。杂交技术包括铺板的DNA文库的杂交筛选(噬菌斑或集落，例如参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork))。

这种序列的杂交可以在严谨条件下实施。“严谨条件”或“严谨的杂交条件”是指在其中探针将以比与其他序列更高的可检测程度(例如超过背景至少2倍)与其靶序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖的，并且在不同的环境中不同。通过控制杂交的严谨性和/或洗涤条件，可以鉴定与探针具有100％互补性的靶序列(同源探针)。备选地，可以调节严谨条件，从而允许序列中具有一些错配，使得检测更低程度的相似性(异源探针)。通常，探针的长度少于大约1000个核苷酸，最佳地，长度少于500个核苷酸。

通常，严谨条件为其中在pH 7.0至8.3的盐浓度低于大约1.5M Na离子，通常为大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，并且温度为至少大约30℃(对于短探针，例如10至50个核苷酸)和至少大约60℃(对于长探针，例如超过50个核苷酸)的那些条件。严谨条件还可以通过加入去稳定试剂(例如甲酰胺)取得。示例性的低严谨条件包括在37℃使用30至35％甲酰胺、1MNaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液的杂交，以及在50℃至55℃在1x至2x SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中度严谨条件包括在37℃在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55℃至60℃在0.5x至1x SSC中洗涤。示例性的高严谨条件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60℃至65℃在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲剂可以包含大约0.1％至大约1％SDS。杂交的持续时间通常少于大约24小时，通常为大约4至大约12小时。洗涤时间的持续时间为至少足以达到平衡的时间长度。

特异性通常为杂交后洗涤的函数，重要的因子是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交物而言，T_m可以由Meinkoth and Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的等式近似得到：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为一价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分率，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分率，而L为碱基对中杂交物的长度。T_m是50％互补性靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在所定义的离子强度和pH下)。每错配1％，T_m降低大约1℃；因此可以调节T_m、杂交和/或洗涤条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如如果寻求一致性>90％的序列，则T_m可以降低10℃。通常，在所定义的离子强度和pH下，对于特定的序列及其互补物，将严谨条件选择为低于热熔点(T_m)大约5℃。然而，严格的严谨条件可以在低于热熔点(T_m)1、2、3或4℃采用杂交和/或洗涤；中度严谨条件可以在低于热熔点(T_m)6、7、8、9或10℃采用杂交和/或洗涤；低严谨条件可以在低于热熔点(T_m)11、12、13、14、15或20℃采用杂交和/或洗涤。利用等式、杂交和洗涤组合物以及所需的T_m，那些普通技术人员将理解的是杂交严谨性和/或洗涤溶液的改变本身就有所描述。如果所需的错配程度使得T_m低于45℃(水性溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，最佳的是增加SSC浓度，从而可以使用更高的温度。对核酸杂交的广泛的指导在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology—Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2(Elsevier,NewYork)和Ausubel et al.,eds.(1995)Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)中找到。参见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Plainview,New York)。

应该认识到本发明的R蛋白质编码序列涵盖包含与SEQ ID NO:1、3、4、6、7、9、10、12、19、21、22、24、25、27、36、37、39、40、42、49和51的任意一个或多个的核苷酸序列是足够一致的核苷酸序列的多核苷酸分子。术语“足够一致的”在本发明中用于指第一氨基酸或核苷酸序列，其含有与第二氨基酸或核苷酸序列足够或最少数量的一致的或相当的(例如具有相似的侧链)氨基酸残基或核苷酸，使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同的结构结构域和/或共同的功能活性。例如包含共同的结构结构域(具有至少大约45％、55％或65％一致性，优选为75％一致性，更优选为85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性)的氨基酸或核苷酸序列在本发明中定义为足够一致的。

为了确定2个氨基酸序列或2个核酸的百分一致性，针对最佳比较对序列进行比对。2个序列之间的百分一致性为序列所共有的相同位置的数量的函数(即，百分一致性＝相同位置的数量/位置的总数量(例如重叠的位置)x 100)。在一个实施方案中，2个序列为相同的长度。2个序列之间的百分一致性可以使用类似于下文所述那些的技术来确定(允许或不允许空位)。在计算百分一致性中，通常计数确切的匹配。

2个序列之间的百分一致性的确定可以使用数学算法来完成。用于比较2个序列的数学算法的优选的非限定性实例为Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264，在Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877)中修改的算法。这种算法被引入至Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以使用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸检索，从而得到与本发明的多核苷酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(得分＝50，字长＝3)进行BLAST蛋白质检索，从而得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位的比对，可以使用Gapped BLAST，如Altschul et al.(1997)NucleicAcids Res.25:3389中所述。备选地，PSI-Blast可以用于进行检测分子之间具有较远关系的迭代检索。参见Altschul et al.(1997)如上文。当使用BLAST、Gapped BLAST和PSI-Blast程序时，各程序的缺省参数(例如可利用互联网ncbi.nlm.nih.gov上的XBLAST和NBLAST)。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限定性实例为Myers and Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法。这种算法被引入至ALIGN程序(2.0版)中，其为GCG序列比对软件包的部分。当使用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。还可以通过检查进行人工比对。

除非另外陈述，否则本发明提供的序列一致性/相似性值是指使用本发明的全长序列，并通过算法Clustal W(Nucleic Acid Research,22(22):4673-4680,1994)使用软件包Vector NTI Suite Version 7(InforMax,Inc.,Bethesda,MD,USA)中包含的程序AlignX使用缺省参数；或者其任何相当的程序而使用多重比对而获得的值。“相当的程序”是指任何序列比较程序，对于任意2个所考虑的序列而言，所述程序生成这样的比对，与通过CLUSTALW(Version 1.83)使用缺省参数(可利用the European BioinformaticsInstitute website的互联网：ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html)生成的相应的比对相比时，所述比对具有一致的核苷酸或氨基酸残基匹配以及一致的百分序列一致性。

术语“多核苷酸”的使用不旨在将本发明限制在包含DNA的多核苷酸。本领域的那些普通技术人员将认识到多核苷酸可以包含核糖核苷酸，以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然形成的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。

包含R蛋白质编码区的多核苷酸构建体可以在用于在目的植物或其他有机体或非人类宿主细胞中表达的表达盒中提供。所述表达盒包含与R蛋白质编码区可操作地连接的5'和3'调控序列。“可操作地连接”是指2个或更多个元件之间的功能连接。例如目的多核苷酸或基因与调控序列(即，启动子)之间的可操作地连接是允许目的多核苷酸表达的功能连接。可操作地连接的元件可以是相邻的或非相邻的。当可操作地连接用于指2个蛋白质编码区的连接时，可操作地连接是指编码区处于相同的阅读框中。所述表达盒可以另外包含有待共同转化至有机体中的至少一个其他的基因。备选地，其他的基因可以提供在多重表达盒上。这种表达盒与用于插入R蛋白质编码区在调控区的转录调控下的多个限制性位点和/或重组位点一起提供。表达盒可以另外包含选择性标志物基因。

表达盒沿着转录的5'-3'方向包含转录和翻译起始区(即，启动子)、本发明的R蛋白质编码区以及在植物或其他有机体或非人类宿主细胞中具有功能的转录和翻译终止区(即，终止区)。调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或本发明的R蛋白质编码区对于宿主细胞或彼此而言可以是天然的/类似的。备选地，调控区和/或本发明的R蛋白质编码区对于宿主细胞或彼此而言可以是异源的。

如本文所用，关于核酸分子或核苷酸序列，“异源的”是起源于外来物种的核酸分子或核苷酸序列，或者如果起源于相同的物种，则通过谨慎的人类干预在组合物和/或基因组基因座中由其天然形式修饰得到。例如与异源多核苷酸可操作地连接的启动子得自一种物种，该物种不同于衍生所述多核苷酸的物种，或者如果得自相同/类似的物种，则一个或两个基本由它们的起源形式和/或基因组基因座修饰得到，或者启动子不是用于可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文所用，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，其中所述转录起始区对于编码序列而言是异源的。

本发明提供了至少包含本发明的核酸分子、表达盒和载体的宿主细胞。在本发明的优选的实施方案中，宿主细胞为植物细胞。在其他的实施方案中，宿主细胞选自细菌、真菌细胞和动物细胞。在某些实施方案中，宿主细胞为非人类动物细胞。然而，在一些其他的实施方案中，宿主细胞为体外培养的人类细胞。

尽管使用异源启动子表达R蛋白质可能是最佳的，但是可以使用相应的R基因的天然启动子。

终止区对于转录起始区可以是天然的，与目的可操作地连接的R蛋白质编码区是天然的，与植物宿主可以是天然的，或者可以由另一个来源衍生(即，对于启动子、目的R蛋白质和/或植物宿主而言是外来的或异源的)，或它们的组合。常规的终止区可以得自根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，例如章鱼碱合成酶和蓝曙红合成酶终止区。还参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell 64:671-674；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2:1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene 91:151-158；Ballas et al.(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903；和Joshi et al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627-9639。

在合适的情况下，可以针对在转化植物中增加的表达，优化所述多核苷酸。换言之，可以使用用于改进表达的植物优选密码子合成所述多核苷酸。例如参见Campbell andGowri(1990)Plant Physiol.92:1-11for a discussion of host-preferred codonusage。本领域中可利用多种方法用于合成植物优选的基因。例如参见美国专利号5,380,831和5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498，这些文献以引用方式并入本文。

已知其他的序列修饰用于增加细胞宿主中的基因表达。这些包括删除编码伪多腺苷酸信号的序列、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列和可能有损于基因表达的其他此类良好表征的序列。可以将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，其是通过参照在宿主细胞中表达的已知基因来计算的。在可能的情况下，对序列进行修饰，从而避免预计的发夹二级mRNA结构。

所述表达盒可以另外包含5'前导序列。这种前导序列可以发挥增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6126-6130)；马铃薯Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene 165(2):233-238)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)(Virology 154:9-20)，和人类免疫球蛋白重链结合蛋白质(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353:90-94)；由苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白质mRNA得到的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling et al.(1987)Nature325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in MolecularBiology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256)；以及玉米萎黄病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81:382-385)。还参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84:965-968。

在制备所述表达盒中，可以对多个DNA片段进行操作，从而以合适的取向并且如何合适，在合适的阅读框中提供DNA序列。为此，可以使用接头或连接体来连接DNA片段，或者可以涉及其他的操作从而提供常规的限制性位点、除去多余的DNA、除去限制性位点等。就此目的而言，可以涉及体外诱变、引物修复、限制、退火、再替代(resubstitution)，例如转换和颠换。

多种启动子可以用于本发明的实践中。可以根据所需的结果来选择启动子。核酸可以与构成型、组织优选型或用于植物中表达的其他启动子结合。这种构成型启动子包括例如核心CaMV 35S启动子(Odell et al.(1985)Nature313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2:163-171)；泛素(Christensen et al.(1989)PlantMol.Biol.12:619-632and Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他的构成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。

组织优选型启动子可以用于靶向特定植物组织中R蛋白质编码序列的增强的表达。这种组织优选型启动子包括但不限于叶子优选型启动子、根优选型启动子、种子优选型启动子和茎优选型启动子。组织优选型启动子包括Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2):255-265；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen etal.(1997)Mol.Gen Genet.254(3):337-343；Russell et al.(1997)Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp etal.(1996)Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini et al.(1996)PlantPhysiol.112(2):513-524；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco et al.(1993)Plant MolBiol.23(6):1129-1138；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3):495-505。对于弱表达而言，如果需要，可以修饰这种启动子。

通常，有利的是由诱导型启动子表达基因，特别是由病原体诱导型启动子。这种启动子包括由致病相关蛋白质(PR蛋白质)得到的那些，其在由病原体感染后诱导；例如PR蛋白质、SAR蛋白质、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。例如参见Redolfi et al.(1983)Neth.J.Plant Pathol.89:245-254；Uknes et al.(1992)Plant Cell 4:645-656；和VanLoon(1985)Plant Mol.Virol.4:111-116。还参见WO 99/43819，这些文献以引用方式并入本文。

关注在病原体感染位点处或附近局部表达的启动子。例如参见Marineau et al.(1987)Plant Mol.Biol.9:335-342；Matton et al.(1989)Molecular Plant-MicrobeInteractions 2:325-331；Somsisch et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:2427-2430；Somsisch et al.(1988)Mol.Gen.Genet.2:93-98；和Yang(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:14972-14977。也参见Chen et al.(1996)Plant J.10:955-966；Zhang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2507-2511；Warner et al.(1993)Plant J.3:191-201；Siebertz et al.(1989)Plant Cell1:961-968；美国专利号5,750,386(线虫诱导型)；并且这些文献以引用方式并入本文。特别关注用于玉米PRm基因的诱导型启动子，所述基因的表达是由病原体串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)诱导的(例如参见Cordero et al.(1992)Physiol.Mol.Plant Path.41:189-200)。

也关注由靶物种得到的其他抗性基因的天然启动子。这些启动子通常是病原体诱导型的，并且可能以合适的水平并且在合适的组织中表达抗性基因。这种启动子的实例为小麦的Sr57/Lr34、Sr33和Sr35启动子(Risk et al.(2012)Plant Biotechnol J 10:447-487；Periyannan et al.(2013)Science 341:786-788；Saintenac et al.(2013)Science341:783-786)。

此外，当病原体通过伤口或昆虫损伤进入植物中时，伤口诱导型启动子可以用于本发明的构建中。这种伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.28:425-449；Duan et al.(1996)Nature Biotechnology 14:494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford et al.(1989)Mol.Gen.Genet.215:200-208)；系统素(McGurl et al.(1992)Science 225:1570-1573)；WIP1(Rohmeier et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:783-792；Eckelkamp et al.(1993)FEBS Letters 323:73-76)；MPI基因(Corderok et al.(1994)Plant J.6(2):141-150)等，这些文献以引用方式并入本文。

化学诱导型启动子可以通过应用外源化学调控剂用于调制植物中基因的表达。根据目的，启动子可以为化学诱导型启动子，其中化学物质的应用诱导基因表达；或者为化学抑制型启动子，其中化学物质的应用抑制基因表达。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于玉米In2-2启动子，其被苯磺酰胺除草剂安全剂活化；玉米GST启动子，其被用作出土前使用的除草剂的疏水性亲电子化合物活化；以及烟草PR-1a启动子，其被水杨酸活化。其他的目的化学调节型启动子包括固醇类反应性启动子(如参见Schena et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425和McNellis et al.(1998)Plant J.14(2):247-257中的糖皮质激素诱导型启动子)，以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(例如参见Gatz et al.(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237,和美国专利号5,814,618和5,789,156)，这些文献以引用方式并入本文。

所述表达盒还包含用于选择转化的细胞的选择性标志物基因。选择性标志物基因用于选择转化的细胞或组织。标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些；以及赋予抵抗除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物例如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D)。其他的选择性标志物包括表型标志物，例如β-半乳糖苷酶；以及荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85:610-9and Fetter et al.(2004)PlantCell 16:215-28)，青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54and Kato et al.(2002)Plant Physiol 129:913-42)，和黄色荧光蛋白(来自的EvrogenPhiYFP^TM，参见Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117:943-54)。对于其他的选择性标志物，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6314-6318；Yao et al.(1992)Cell 71:63-72；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419-2422；Barkley et al.(1980)in The Operon,pp.177-220；Hu et al.(1987)Cell 48:555-566；Brown et al.(1987)Cell 49:603-612；Figge et al.(1988)Cell 52:713-722；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA86:5400-5404；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-2553；Deuschleet al.(1990)Science 248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,University ofHeidelberg；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:1917-1921；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343-3356；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3952-3956；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5072-5076；Wyborski etal.(1991)Nucleic Acids Res.19:4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.10:143-162；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35:1591-1595；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27:1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551；Oliva et al.(1992)Antimicrob.AgentsChemother.36:913-919；Hlavka et al.(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology,Vol.78(Springer-Verlag,Berlin)；Gill et al.(1988)Nature 334:721-724。这些公开文献以引用方式并入本文。

上述选择性标志物基因的列举无意于进行限定。任何选择性标志物基因都可以用于本发明。

用于转化植物的多种植物转化载体和方法是可利用的。例如参见An,G.et al.(1986)Plant Pysiol.,81:301-305；Fry,J.,et al.(1987)Plant Cell Rep.6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl Genet.76:767-774；Hinchee,et al.(1990)Stadler.Genet.Symp.203212.203-212；Cousins,et al.(1991)Aust.J.PlantPhysiol.18:481-494；Chee,P.P.and Slightom,J.L.(1992)Gene.118:255-260；Christou,et al.(1992)Trends.Biotechnol.10:239-246；D’Halluin,et al.(1992)Bio/Technol.10:309-314；Dhir,et al.(1992)Plant Physiol.99:81-88；Casas et al.(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA 90:11212-11216；Christou,P.(1993)In VitroCell.Dev.Biol.-Plant；29P:119-124；Davies,et al.(1993)Plant Cell Rep.12:180-183；Dong,J.A.and Mchughen,A.(1993)Plant Sci.91:139-148；Franklin,C.I.andTrieu,T.N.(1993)Plant.Physiol.102:167；Golovkin,et al.(1993)Plant Sci.90:41-52；Guo Chin Sci.Bull.38:2072-2078；Asano,et al.(1994)Plant Cell Rep.13；AyeresN.M.and Park,W.D.(1994)Crit.Rev.Plant.Sci.13:219-239；Barcelo,et al.(1994)Plant.J.5:583-592；Becker,et al.(1994)Plant.J.5:299-307；Borkowska et al.(1994)Acta.Physiol Plant.16:225-230；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.5:17-27；Eapen et al.(1994)Plant Cell Rep.13:582-586；Hartman,et al.(1994)Bio-Technology 12:919923；Ritala,et al.(1994)Plant.Mol.Biol.24:317-325；和Wan,Y.C.and Lemaux,P.G.(1994)Plant Physiol.104:3748。

本发明的方法涉及将多核苷酸构建体引入植物中。“引入”是指将多核苷酸构建体以使得该构建体接近植物细胞内部的方式呈递给植物。本发明的方法不依赖于用于将多核苷酸构建体引入植物中的特定的方法，仅依赖于多核苷酸构建体接近植物至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定的转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。

“稳定的转化”是指引入植物中的多核苷酸构建体整合至植物的基因组中，并且能够被其后代继承。“瞬时转化”是指引入植物中的多核苷酸构建体不整合至植物的基因组中。

就植物和植物细胞的转化而言，使用标准的技术将本发明的核苷酸序列插入本领域已知的适用于在植物或植物细胞中表达核苷酸序列的任何载体中。载体的选择取决于优选的转化技术，以及待转化的靶植物物种。

用于构建植物表达盒并且将外来核酸引入植物中的方法是本领域公知的，并且之前已经描述。例如可以使用肿瘤诱导型(Ti)质粒载体将外来DNA引入植物中。用于外来DNA传递的其他方法涉及PEG介导的原生质体转化、电穿孔、微注射须(microinjectionwhiskers)、以及用于直接DNA吸收的基因枪或微粒轰击的使用。这种方法是本领域已知的。(Vasil等人的美国专利号5,405,765；Bilang et al.(1991)Gene 100:247-250；Scheid etal.,(1991)Mol.Gen.Genet.,228:104-112；Guerche et al.,(1987)Plant Science 52:111-116；Neuhause et al.,(1987)Theor.Appl Genet.75:30-36；Klein et al.,(1987)Nature 327:70-73；Howell et al.,(1980)Science 208:1265；Horsch et al.,(1985)Science 227:1229-1231；DeBlock et al.,(1989)Plant Physiology 91:694-701；Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.)AcademicPress,Inc.(1988)和Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.)Academic Press,Inc.(1989))。转化的方法取决于待转化的植物细胞、所用的载体的稳定性、基因产物的表达水平以及其他参数。

将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入植物基因组中的其他合适的方法包括Crossway et al.(1986)Biotechniques 4:320-334所述显微注射；Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606所述电穿孔；Townsend等人的美国专利号5,563,055,Zhao等人的美国专利号5,981,840所述土壤杆菌介导的转化；Paszkowski et al.(1984)EMBO J.3:2717-2722所述直接基因转移；以及在例如Sanford等人的美国专利号4,945,050；Tomes等人的美国专利号5,879,918；Tomes等人的美国专利号5,886,244；Bidney等人的美国专利号5,932,782；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into IntactPlant Cells via Microprojectile Bombardment,”in Plant Cell,Tissue,and OrganCulture:Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin)；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6:923-926)；和Lec1 transformation(WO00/28058)的基因枪颗粒加速。还参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5:27-37(洋葱)；Christouet al.(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology6:923-926(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8:736-740(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:4305-4309(玉米)；Klein et al.(1988)Biotechnology6:559-563(玉米)；Tomes的美国专利号5,240,855；Buising等人的美国专利号5,322,783和5,324,646；Tomes et al.(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment,”in Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(玉米)；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91:440-444(玉米)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8:833-839(玉米)；Hooykaas-VanSlogteren et al.(1984)Nature(London)311:763-764；Bowen等人的美国专利号5,736,369(谷物)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科)；DeWet et al.(1985)in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues,ed.Chapmanet al.(Longman,New York),pp.197-209(花粉)；Kaeppler et al.(1990)Plant CellReports9:415-418and Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(须介导的转化)；D’Halluin et al.(1992)Plant Cell 4:1495-1505(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports 12:250-255以及Christou and Ford(1995)Annals of Botany75:407-413(水稻)；Osjoda et al.(1996)Nature Biotechnology 14:745-750(玉米，通过根癌土壤杆菌)，所有这些文献均以引用方式并入本文。

本发明的多核苷酸可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而被引入至植物中。通常，这种方法涉及将本发明的多核苷酸构建体引入至病毒DNA或RNA分子中。此外，应该认识到本发明的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。将多核苷酸构建体引入植物中并表达其所编码的蛋白质的方法(涉及病毒DNA或RNA分子)是本领域已知的。例如参见美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931；这些文献以引用方式并入本文。

如果需要，可以在配制物中制备修饰的病毒或修饰的病毒核酸。这种配制物以已知的方式制备(例如参见US 3,060,084,EP-A 707 445(用于液体浓缩物),Browning,“Agglomeration”,Chemical Engineering,Dec.4,1967,147-48,Perry’sChemicalEngineer’s Handbook,4th Ed.,McGraw-Hill,New York,1963,pages8-57以及下列等等：WO 91/13546,US 4,172,714,US 4,144,050,US 3,920,442,US 5,180,587,US 5,232,701,US 5,208,030,GB 2,095,558,US 3,299,566,Klingman,Weed Control as a Science,John Wiley and Sons,Inc.,New York,1961,Hance et al.Weed Control Handbook,8thEd.,Blackwell Scientific Publications,Oxford,1989and Mollet,H.,Grubemann,A.,Formulation technology,Wiley VCH Verlag GmbH,Weinheim(Germany),2001,2.D.A.Knowles,Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations,KluwerAcademic Publishers,Dordrecht,1998(ISBN 0-7514-0443-8)，例如通过使用适用于农用化学品配制物的辅助物质延伸活性化合物，例如溶剂和/或载体，如果需要可以使用乳化剂、表面活性剂、分散剂、防腐剂、消泡剂、防冻剂，对于种子处理配制物而言，还任选地使用着色剂和/或粘结剂和/或胶凝剂。

在特定的实施方案中，可以使用本领域已知的多种瞬时转化方法将本发明的多核苷酸构建体和表达盒提供给植物。这种方法包括例如显微注射或颗粒轰击。例如参见Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202:179-185；Nomura et al.(1986)PlantSci.44:53-58；Hepler et al.(1994)PNAS Sci.91:2176-2180和Hush et al.(1994)J.Cell Science 107:775-784，所有这些文献以引用方式并入本文。备选地，可以使用本领域已知的技术，将多核苷酸瞬时转化至植物中。这种技术包括病毒载体系统和根癌土壤杆菌介导的瞬时表达，如本发明其他处所述。

已经转化的细胞可以根据传统的方式生长成植物。例如参见McCormick et al.(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后，这些植物可以生长，并且使用相同转化的菌株或不同的菌株授粉，并且所得到的杂交物具有经鉴定的所需表型特征的构成型表达。可以生长2代或更多代，以确保所需的表型特征的表达被稳定地保持，遗传，然后得到收获后确保所需的表型特征被表达的种子。按照这种方式，本发明提供了转化的种子(还称为“转基因种子”)，其具有稳定地引入至基因组中的本发明的多核苷酸构建体，例如本发明的表达盒。

用于修饰植物基因组中的DNA的本领域已知的任何方法都可以用于原位改变植物中的R基因的编码序列，例如将同源的易感等位基因的核苷酸序列改变为提供抵抗秆锈病的至少一个物种的抗性的等位基因的核苷酸序列。这种方法包括基因组编辑技术，例如涉及靶向诱变、同源重组和突变育种的方法。靶向诱变或相似的技术在美国专利号5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972,5,871,984和8,106,259中公开，所有这些文献的全文以引用方式并入本文。用于基因修饰或基团替代(包括同源重组)的方法可以涉及诱导DNA中的双键断裂，使用锌指核酸酶(ZFN)，TAL(转录激活子样)效应物核酸酶(TALEN)，规律成簇的间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)/CRISPR相关的核酸酶(CRISPR/Cas核酸酶)，或者归位内切酶(经改造的核酸内切酶，使得植物、其他有机体或宿主细胞的基因组中的特异性识别序列的双链断裂)。例如参见Durai et al.,(2005)Nucleic Acids Res 33:5978-90；Mani et al.(2005)Biochem Biophys Res Comm 335:447-57；美国专利号7,163,824,7,001,768和6,453,242；Arnould et al.(2006)J Mol Biol 355:443-58；Ashworth et al.,(2006)Nature 441:656-9；Doyon et al.(2006)J Am Chem Soc 128:2477-84；Rosen et al.,(2006)Nucleic Acids Res34:4791-800；和Smith et al.,(2006)Nucleic Acids Res 34:e149；美国专利申请公开号2009/0133152；和美国专利申请公开号2007/0117128，所有这些文献的全文以引用方式并入本文。

TAL效应物核酸酶(TALEN)可以用于使植物基因组中的特异性识别序列处的双链断裂，从而通过同源重组用于基因修饰或基因替代。TAL效应物核酸酶为可以用于使植物或其他有机体基因组中特异性靶序列处的双链断裂的一类序列特异性核酸酶。TAL效应物核酸酶是通过使天然的或改造的转录激活子样(TAL)效应物或其功能部分与核酸内切酶(例如FokI)的催化结构域融合而创建的。独特的模块化TAL效应物DNA结合结构域使得可以设计具有潜在的任何给定DNA识别特异性的蛋白质。因此，TAL效应物核酸酶的DNA结合结构域可以改造成识别特异性DNA靶位点，并由此用于在所需的靶序列处使双链断裂。参见WO2010/079430；Morbitzer et al.(2010)PNAS10.1073/pnas.1013133107；Scholze andBoch(2010)Virulence 1:428-432；Christian et al.Genetics(2010)186:757-761；Li etal.(2010)Nuc.Acids Res.(2010)doi:10.1093/nar/gkq704；和Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29:143–148，所有这些文献均以引用方式并入本文。

CRISPR/Cas核酸酶系统还可以用于产生植物基因组中特异性识别序列处的双链断裂，从而通过同源重组用于基因修饰或基因替代。CRISPR/Cas核酸酶为RNA向导的(简单向导RNA，简称为sgRNA)DNA核酸内切酶系统，其在与所设计的RNA同源的DNA链段中使得序列特异性双链断裂。还可以设计序列的特异性(Cho S.W.et al.,Nat.Biotechnol.31:230-232,2013；Cong L.et al.,Science 339:819-823,2013；Mali P.et al.,Science 339:823-826,2013；Feng Z.et al.,Cell Research:1-4,2013)。

此外，ZFN可以用于产生植物基因组中特异性识别序列处的双链断裂，从而通过同源重组用于基因修饰或基因替代。锌指核酸酶(ZFN)为融合蛋白质，其包含用于DNA切割的FokI限制性核酸内切酶蛋白质的部分以及锌指蛋白质，所述锌指蛋白质识别特异性的设计的基因组序列，并且切割在这些序列中的双链DNA，由此产生游离的DNA末端(Urnov F.D.etal.,Nat Rev Genet.11:636-46,2010；Carroll D.,Genetics.188:773-82,2011)。

使用位点特异性核酸酶(例如本发明上文所述那些)断裂DNA可以增加断裂区中同源重组的速率。因此，将上文所述这种效应物与核酸酶偶联能够在包含加入、删除和其他修饰的基因组中生成靶向的变化。

本发明的核酸分子、表达盒、载体和多核苷酸构建体可以用于任何植物物种的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。本发明的优选的植物为小麦植物。其他目的植物物种的实例包括但不限于辣椒(辣椒属物种；例如甜辣椒(Capsicum annuum)、灯笼辣椒(C.baccatum)、中华辣椒(C.chinense)、灌木状辣椒(C.frutescens)、绒毛辣椒(C.pubescens)等)、番茄(Lycopersicon esculentum)、烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、矮牵牛(矮牵牛属物种；例如Petunia x hybrida或Petuniahybrida)、豌豆(Pisum sativum)、豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、苞米或玉米(Zeamays)、芸苔属物种(例如(B.napus)、芜青(B.rapa)、芥菜(B.juncea))、特别是用作种籽油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、稷(例如珍珠稷(Pennisetumglaucum)、黍稷(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(穇子(Eleusinecoracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、大豆(Glycinemax)、烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachishypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属物种)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、广柑树(柑橘属物种)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(香蕉属物种)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Olea europaea)、番木瓜(Caricapapaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属物种)、棕榈、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。

如本文所用，术语“植物”包括植物细胞、植物原生质体、可以再生成植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛以及在植物或植物的部分中是完好的植物细胞(例如胚芽、花粉、胚珠、种子、块茎、繁殖体、叶、花、枝、果实、根、根尖、花药等)。再生的植物的后代、变体和突变体也包含在本发明的范围内，只要这些植物包含引入的多核苷酸即可。如本文所用，“后代”和“后代植物”包括植物的任何后代，而不论其是由有性生殖和/或无性生殖得到的，除非内容中另外明确地陈述，或者由使用内容显而易见。

在本发明的一些实施方案中，使用编码本发明的R蛋白质的多核苷酸构建体转化植物细胞。如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。由DNA分子“表达”或“生产”蛋白质或多肽是指编码序列的转录和翻译，从而产生蛋白质或多肽，而由RNA分子“表达”或“生产”蛋白质或多肽是指RNA编码序列的翻译，从而产生蛋白质或多肽。编码R蛋白质的多核苷酸构建体和核酸分子的实例在本发明的其他处描述。

术语“DNA”或“RNA”在本发明中的使用无意于将本发明限制为包括DNA或RNA的多核苷酸分子。本领域的那些普通技术人员将认识到本发明的方法和组合物涵盖这样的多核苷酸分子，其包含脱氧核糖核苷酸(即，DNA)、核糖核苷酸(即，RNA)或者核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然形成的分子和合成的类似物，包括但不限于核苷酸类似物或修饰的主链残基或键，其是合成的、天然形成的和非天然形成，其具有与参照核酸相似的结合性质，并且以与参照核苷酸相似的方式代谢。这种类似物的实例包括但不限于磷硫酰酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。本发明的多核苷酸分子还涵盖多核苷酸分子的所有形式，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。此外，本领域那些普通技术人员理解的是本发明公开的核苷酸序列还涵盖示例性核苷酸序列的成分。

本发明描绘了用于增强植物抵抗植物疾病的抗性的组合物和方法，特别是用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的组合物和方法。“疾病抗性”是指植物避免由于植物-病原体相互作用的结果而导致的疾病症状。换言之，防止病原体导致植物疾病和相关的疾病症状，或者备选地，由病原体导致的疾病症状减少或减轻。

本发明涵盖了本发明公开的多核苷酸构建体，或者随附的序列表和/或附图，包括但不限于SEQ ID NO:138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161和162。本发明进一步涵盖了包含至少一种这种多核苷酸构建体的植物、植物细胞、宿主细胞和载体，以及由这种植物产生的食物产品。此外，本发明涵盖了包含至少一种这种多核苷酸构建体的植物在本发明其他处公开的方法中的用途，例如用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法，以及在农业农作物生产中限制小麦秆锈病的方法。

以下实施例通过示意性的方式提供，但不是限定。

实施例

实施例1：Sr22和Sr45的基因图位

Sr22被导入至得自二倍体A-基因组相关的野生一粒小麦的小麦染色体7A中(Gerechter-Amitai et al.(1971)Euphytica 20:281-285；The(1973)Nature-NewBiol.241:256)。在培育品种Schomburgk中，Sr22在全世界赋予抵抗市售可得的秆锈病重要物种的抗性，包括Ug99物种组，并且是有效抵抗Yemeni和Ethiopian分离物的少数抗性基因之一(图1；表1)。但是，Sr22的部署受到限定，这是由于关联基因的等位基因所赋予的差的农业性能(The et al.(1988)Proceedings of 7th International Wheat GeneticsSymposium,Miller and Koebner eds.,Bath Press,Bath,UK,pp.901-909)，并且我们试图使用标准的基于图谱的方法在小麦中克隆Sr22由于受抑制的重组而受挫(图3)。

我们通过将Schomburgk(一种六倍体小麦品系，其携带得自野生一粒小麦编号G-21的Sr22(Paull et al.(1994)Theor.Appl.Genet.89:1039-1045))与秆锈病易感栽培品种Westonia杂交而形成制图(mapping)群体。根据Kota等人的方法(Kota et al.(2006)Theor.Appl.Genet.112:492-499)，我们筛选1150个F₂种子，其具有密切关联的侧翼SSR标志物cfa2123和cfa2019(Khan et al.(2005)Theor.Appl.Genet.111:846-850)，并鉴定180个重组子。使所选的重组子的种子发展至F₃代，并使用Periyannan等人所述的方法和分离物针对锈病应答进行测试(Periyannan et al.(2011)Theor.Appl.Genet.122:1-7)。随后，使用cssu22(Periyannan et al.(2011)Theor.Appl.Genet.122:1-7)，染色体7A特异性小麦表达的序列标签(wESTs)BE443521、BG274853、BE498985、BG262287、BF201318、BG604641(Akhunov et al.(2010)BMC Genomics11:702))以及衍生自同源染色体7D(Luo et al.(2013)PNAS 110:7940-7945)的标志物AT7D7092和AT7D7094筛选180个重组子品系的DNA。发现标志物BG274853和BE498985处于远端，并且分别与Sr22分隔3个和1个重组事件，而发现标志物BE443521和AT7D7094处于近端，并且分别与Sr22分隔8个和2个重组事件。发现剩余的标志物cssu22、BG262287、BF201318和BG604641与Sr22共分隔(图3)。

除了六倍体群体以外，使用1150个F₂植物补充Sr22基因座作图，其中所述1150个F₂植物是由栽培一粒小麦编号PI190945(携带Sr22)(Rouse and Jin(2011)Phytopathology101:1418-1423)和秆锈病易感编号PI272557杂交衍生得到的。我们使用标志物BE498985和AT7D7094，并回收重组子(图3)。通过使用小麦秆锈病菌分离物06ND76C(物种QFCSC)筛选，验证重组子中Sr22的存在或缺乏，其中所述分离物06ND76C的特征在于对具有Sr22的品系是无毒力的(Rouse and Jin(2011)Phytopathology 101:1418-1423)。发现，由Schomburgkx Westonia群体得到的共分隔标志物在PI190945和PI272557之间均不是多态性的。

表1.Sr22TB(Schomburgk)和栽培一粒小麦(PI190945)(携带针对全世界范围的秆锈病分离物的集合的Sr22)的秆锈病感染类型(IT)

*物种细节和感染类型得自Rouse and Jin 2011。具有感染得分的品系；并且0至2+(分别为高到低水平的抗性)分类为抗性，而高于3分分为易感品系(Phytopathology 101:1418-1423；Plant Dis.95:941-944)和Olson et al.2010(Crop Science 50:1823-1830)。

#Sr22TB和Schomburgk携带得自相同来源(野生一粒小麦编号G-21)的Sr22(Paullet al.(1994)Theor.Appl.Genet.89:1039-1045；Olson et al.(2010)Crop Science 50:1823-1830)。

^类似于抵抗物种98-1,2,3,5和6的抗性应答，当与感染类型3+的易感品系Morocco相比时，六倍体品系Schomburgk也显示抵抗其他澳大利亚秆锈病物种(即，34-1,2,3,4,5,6,7；34-1,2,3,6,7,8,9；34-1,2,3,5,7,8,9；34-1,2,7+Sr38；40-1,2,3,4,5,6,7；98-1,2,3,5,6,7和17-1,2,3,7)的相似的感染类型。

为了对Sr45作图，使用在Periyannan et al.(2014)Theor.Appl.Genet.127:947-955中所述高分辨率作图群体(CS1D5406 x Chinese Spring)。亲代小麦品系CS1D5406(携带Sr45的Chinese Spring 1D替换；Jones et al.(1991)Genome 34:505-508)与ChineseSpring(CS-易感亲代)杂交，从而生成1150个F₂种子的高分辨率作图家族。由CS1D5406/CS高分辨率作图家族得到的421个F₂种子是简单重复序列标志物gwm106和gwm337的重组子，并且用于构建Sr45的连锁图。421个种子的胚芽部分发育成F₃，并且表型为幼苗抗性。使用其他的基于小麦EST的标志物(BE444266和BE446624)，Sr45区间(interval)进一步缩减至23个重组子(图4)。在缺乏密切连锁的EST的情况下，使用选择性扩增引物对(PstI+ATT和MseI+GAA)的AFLP分析扩增与抗性品系有关的片段，并作图为以0.39cM的距离接近Sr45(AFLP标志物AF45)。密切连锁的(AF45)片段用于鉴定BAC克隆HB079K08，其形成重叠群ctg2981的部分(得自University of California,Davis的小麦D基因组物理作图项目)，其中用于诊断Sr45的序列加标签标志物cssu45由所述重叠群ctg2981的部分发展而来(Periyannan et al.,2014Theor Appl Genet 127:947-955)。

实施例2：Ren-Seq+EMS由大基因组克隆抗性基因的用途

基于以下方面，使用3步法快速克隆R基因：(i)化学诱变和针对易感突变体的筛选；(ii)外显子捕获和下一代测序；然后(iii)野生型与突变体的序列比较。如下文所述，这种3步法用于由17Gb六倍体面包小麦基因组克隆广谱秆锈病抗性基因Sr22和Sr45。

大部分的植物R基因属于结构种类的基因，其编码核苷酸结合和富含亮氨酸重复(NB-LRR)结构域(Dangl et al.(2013)Science 341:746-751)。典型的植物基因组包含几百个NB-LRR同源物(“NB-LRRome”)，大部分的同源物存在于复合簇中(Hulbert et al.(2011)Annu.Rev.Phytopathol.39:285-312)。对植物基因组的这种较小的特定区域的富含R基因的测序(RenSeq)可以通过使用生物素化的RNA寡核苷酸由Illumina文库捕获片段，其中所述RNA寡核苷酸设计成与参照基因组的NB-LRR基因库互补(Jupe et al.(2013)PlantJ.76,530-544)。重要的是，对马铃薯群体(分割用于疾病抗性)所采用的RenSeq可以鉴定NB-LRR中特征连锁的单一核苷酸多态性(SNP)(Jupe et al.(2013)Plant J.76,530-544)。最近以来，RenSeq型方法(称为“RenSeq+EMS”)通过使用近-等基因变异(通过针对易感突变体筛选甲磺酸乙酯(EMS)-诱变的群体而获得，所述群体衍生自单一的抗性亲代)，而不使用NB-LRRome比较中2个不同的栽培品种，用于由小麦鉴定R基因(2015年2月20日提交的美国专利申请No.14/667,116和2015年2月20日提交的PCT/US2015/016792，这两份文献的全文均以引用方式并入本文)。通过使用RenSeq+EMS，相对直接地获得所述这种突变体，这是因为R基因抑制剂筛选通常在R基因的突变中产生大约90％突变体，而非第二位点抑制剂基因(B.Wulff,未公开的分析)。实施例3：EMS突变体群体的产生

我们对Schomburgk(携带Sr22)和CS1D5406(携带Sr45)的种子进行Periyannan等人所述EMS诱变(Periyannan et al.(2013)Science 341:786-788)。在杀菌曲线分析中，0.3％EMS被鉴定为导致50％死亡率和生长减少的最佳剂量。然后，我们使用这种浓度分别处理CS1D5406和Schomburgk的2000和3000个种子，并使植物发展至M₂代。我们收获680和1300个单头(由EMS处理的CS1D5406和Schomburgk得到的M₂家族)，并针对对澳大利亚秆锈病物种40-1,2,3,4,5,6,7(PBI培养编号383)的应答筛选这些种子。由不同的M₂家族的秆锈病筛选，我们鉴定6种易感突变体(1S、2S、3S1、5S1、6S和7S1)(对于Sr22)(图1)和6种突变体(49S1、52S1、55S1、57S1、59S1和61S1)(对于Sr45)，它们在M₃代中再次证实(图2)。

实施例4：富集文库的设计

我们使用得自MYcroarray(参见互联网：mycroarray.com/)的专用版本设计120个核苷酸的60000个诱饵(bait)。源序列衍生自公共可得的基因注释(International WheatGenome Sequencing Consortium(2014)Science345:1251788；Mayer et al.(2012)Nature491:711-716)和Ae.sharonensis(EBI|PRJEB5333)的其他的基因组原始数据。在Ae.sharonensis的情况下，我们使用RNASeq数据(EBI|PRJEB5340)，从而根据Mayer等人(Mayer et al.(2012)Nature 491:711-716)重新预测基因模型。我们包含了所有含有NB-ARC(Pfam|PF00931)结构域的基因，意识到这可能包含了其他的基因家族。使用pfam_scan，针对NB-ARC结构域筛选翻译的蛋白质序列(Finn et al.(2014)Nuc.Acids Res.42:D222-230)。将所有预测的属于所选基因的外显子加入至源序列组中。短于120bp的外显子向上游和下游延长60bp。所得的序列通过以下过程进一步精制：(i)使用RepeatMasker(可得自互联网：repeatmasker.org/)和Triticeae Repeat library TREP(可得自互联网：wheat.pw.usda.gov/ITMI/Repeats/)针对重复元件进行筛选；(ii)使用CD-HIT(Fu et al.(2012)Bioinformatics 28:3150-3152)聚类(一致性阈值为95％)，从而除去冗余的序列；以及(iii)确保序列不具有反向互补基序。最后一步是通过使用BLASTn(Zhang et al.(2000)Comput.Biol.7:203-214)将所有的序列针对所有的序列进行比对，并重新定向冲突的序列而取得的。

实施例5：DNA提取和文库制备

使用Lagudah等人所述方法(Lagudah et al.(1991)Genome 34:375-386)，我们由EMS突变体的叶组织提取总基因组DNA。使用NanoDrop分光光度计(ThermoFisherScientific)和Quant-iT PicoGreen dsDNA测定法(Life Technologies)进行DNA定量。将DNA样品归一化至3μg，并在Covaris S2Focused-超声发生器中剪切成平均长度为500bp。通过凝胶电泳测定小的等分物，并使用Agencourt AMPure XP珠(Beckman CoulterGenomics)进行其他尺寸的选择。将样品进行末端修复，然后使用NEBNext Ultra DNALibrary Prep Kit for Illumina(New England Biolabs)进行3'dA添加。将Illumina测序接头连接至末端，并使用AMPure XP珠进行随后的纯化，再使用索引的PCR引物(NEBNextMultiplex Oligos for Illumina,New England Biolabs)和Illumina PE1.0 PCR引物对DNA进行PCR扩增(6轮)。在使用AMPure XP珠进行纯化后，使用Bioanalyzer DNA 1000芯片(Agilent)和PicoGreen测定法进行定量测定法，从而确定平均片段尺寸和浓度。

实施例6：Illumina文库的靶物富集和测序

根据MYbaits(MYcroarray)方案并使用MYbaits试剂富集DNA文库。简言之，在65℃将500ng制备的文库在杂交缓冲剂(10x SSPE,10x Denhardt溶液,10mM EDTA,0.2％SDS)中与生物素化的RNA诱饵杂交40h。杂交后，使用链霉亲和素涂敷的磁珠按照如下方式回收结合的DNA：将杂交混合物加入洗涤3次并再次悬浮于结合缓冲剂(1M NaCl；10mM Tris-HCl,pH 7.5；1mM EDTA)中的Dynabeads MyOne Streptavidin C1(Invitrogen,LifeTechnologies)中。在RT 30min后，使磁珠沉淀，并在RT使用1x SSC/0.1％SDS洗涤1次15min，然后在65℃使用0.1x SSC/0.1％SDS洗涤3次，每次10分钟。使用0.1M NaOH洗脱捕获的DNA，并使用1M Tris-HCl,pH 7中和。使用AMPure XP珠纯化文库，并使用Q5 HighFidelity DNA Polymerase(New England Biolabs)以及Illumina P5(5’AATGATACGGCGACCACCGA 3；SEQ ID NO:58)和P7引物(5’CAAGCAGAAGACGGCATACGA 3’；SEQID NO:59)进行PCR扩增(14-16个循环)。将富集的文库在Illumina MiSeq或HiSeq平台上，以TGAC进行末端配对测序(表2)。

表2.针对Sr22和Sr45测序的文库

¹基于Bioanalyzer。

²与NB-LRR相关。

³重叠群上的TopHat作图。仅包含源BLAST命中≤1E-50的读值。

实施例7：NB-LRR读值组装及比较

使用CLC assembly cell(www.clcbio.com/products/clc-assembly-cell/)和标准的参数重头组装得自野生型的原始数据。使用BWA(Li and Durbin(2009)Bioinformatics 25:1754-1760)将各突变体和野生型的原始数据与野生型组装进行比对。使用SAMtools(Li et al.(2009)Bioinformatics 25:2078-2079)和参数-f 2，将所得的SAM文件过滤用于读值作图作为合适的对。使用SAMtools Mpileup将结果转化成累积格式。使用MegaBLAST(Zhang et al.(2000)Comput.Biol.7:203-214)将重头组装的野生型重叠群与诱饵文库的源序列进行比对。仅考虑与源序列具有局部比对的重叠群的子序列用于进一步的分析。使用累积格式，鉴定潜在的突变位置。如果由野生型原始数据针对野生型组装的作图衍生得到的局部覆盖率为至少50倍，并且突变体的备选等位基因的频率为至少10％，则考虑所述位置用于进一步的分析。后一步被设想为在极端敏感的，并且一定能够鉴定大量的假阳性位置，这些位置在随后的步骤中被滤出。因为2个独立突变的植物在相同的位置处具有突变是非常不可能的，则在超过1个突变体中发现的每个位置都被滤出。平均覆盖率低于中值总体覆盖率10％的区域被认为是该品系的删除突变。所得的候选重叠群通过子序列与诱饵源序列进行局部比对中SNP或删除突变的数量而进行评级。

对于Sr22，我们鉴定27个在2种突变体中突变的重叠群，以及单一的3,408bp重叠群，其在5种突变体中包含独立的突变(contig_10555_1)(图5)。对于Sr45，鉴定在2种或更多种突变体中包含独立的突变的28个重叠群，但是仅一个5,266bp重叠群在6种突变体中具有突变(contig_1795_1)(图6)。

实施例8：通过BLAST检索、全转录组测序和长距离PCR连接Sr22 5'和3'重叠群

BLAST检索(Zhang et al.(2000)Comput.Biol.7:203-214)：使用BLASTx将Sr225'候选重叠群(contig_10555_1)与NCBI非冗余蛋白质比对。最佳命中为得自节节麦(gi|475585845|gb|EMT20152.1)的疾病抗性基因类似物(RGA)的3'末端。然后，我们取得没有被contig_10555_1覆盖的RGA的5'末端，并使用tBLASTn检索我们的Sr22野生型组装。最佳命中contig_3841_1覆盖节节麦RGA的剩余5'部分，并且该重叠群包含Sr22突变体2S中的非同义突变。通过对各突变体的PCR和Sanger测序，我们还证明突变的存在。所有6种突变均为GC至AT过渡，其导致无义(2个)或错义(4个)突变。

RNASeq：使用Sickle(可得自互联网：github.com/najoshi/sickle)在一定品质下剪裁得自Sr22野生型(Schomburgk)的全转录组测序的末端配对读值。使用BLASTn(Zhanget al.(2000)Comput.Biol.7:203-214)，将剪裁的读值与Sr22(contig_10555_1)的3'重叠群比对。然后，将具有局部比对(≥99％一致性)和它们的配对物的所有读值与组装的其他重叠群比对。接着，通过读值最佳比对的次数对所有重叠群进行评分。

为了确认Sr22的完整的编码序列，使用Tophat2(Kim et al.(2013)GenomeBiol.14:R36)，将转录组读值针对最终的基因座进行作图。使用Tablet(Milne et al.(2013)Brief.Bioinform.14:193-202)手工检查比对。

长距离PCR：使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(New EnglandBiolabs Inc.)以及引物对S22F14(5’GCGAACTTTACTGTCAACGG 3’；SEQ ID NO:91)和S22R4(5’CAAAGATCTCATCGCGACG 3’；SEQ ID NO:92)，通过PCR扩增进一步证明Sr22开放阅读框的全长序列。将PCR产物克隆至pCR-XL-TOPO载体中(Life Technologies)，随后测序。

实施例9：局部靶向富集和基因组步移

为了获得Sr22的启动子和终止子区域，我们使用修改的RenSeq方法，将其称为局部RenSeq。这种方法使用长的生物素化的RNA探针(>500nt)，其靶向组装的重叠群的已知5’和3’末端，从而由基因组DNA文库富集长片段(>2kb)。使用这种方法，我们克隆2.5kb启动子(图5)。基本上如上文中标准的RenSeq所述(具有最少的修改)，构建用于局部RenSeq的基因组DNA文库。使用gTUBE遵循用于5kb的制造商的设定，剪切4μg基因组DNA，并且使用NEBNextUltra DNA Library Prep Kit for Illumina(P5-P7接头)以延长的扩增PCR时间(5分钟)从而可以扩增较长的DNA片段，由2μg构建文库。如上文中标准的RenSeq文库所述，实施所有的QC步骤。

为了生成对于Sr22的5'具有特异性的生物素化的RNA探针，我们由Sr22基因组DNA进行PCR扩增对应于5'候选重叠群(contig_10555_1)的第一600nt，并将其克隆至处于T7启动子之下的pGEM-T Easy载体(Promega)中。为了生成run-off转录物，使用PstI(NEB)将具有克隆的片段的质粒线性化，并使用the MAXIscript T7 Transcription Kit(LifeTechnologies)以60％UTP和40％Biotin-16-UTP(Cambio)体外合成生物素化的RNA。纯化生物素化的RNA，并使用RNA Clean and Concentrator-5kit(Zymo Research)进行浓缩，再使用Nanodrop定量。

将合成的生物素化的5'探针与长插入物的文库以1:1比例混合，并且如上文中标准的RenSeq所述进行杂交。为了进一步富集启动子序列，以用于文库构建的相同的设置使用Illumina P5正向引物(SEQ ID NO:58)和反向引物(5’TGCGCTCACCAGAACTTCCGCCATTGTTGC 3’；SEQ ID NO:136)实施富集后PCR，其中所述引物对5'候选物重叠群(在contig 3841_1中的位置163-192)具有特异性。在1％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，并切除2至4kb的片段，使用Nucleospin Extract Kit(Marchery-Nagel)进行纯化，再将其克隆至Zero Blunt PCR Cloning载体(Life Technologies)中。在转化后，我们使用P5(SEQ ID NO:58)和Sr22特异性引物筛选30个细菌集落，并得到6个阳性集落。克隆的片段的长度为1至2.5kb。将6种插入物进行Sanger测序，发现所有的插入物都具有一致的重叠序列，并且最长的克隆片段为2,545bp。为了证明克隆的片段属于Sr22启动子，我们PCR扩增2.5kb片段，其包含1.6kb新克隆的启动子和ATG的800bp下游，即，涵盖2S突变[使用引物KW_sr22_p_seq_F1(5’CAAGGCTGCTATTGCTGTGTTTGGCCCTGA 3’；SEQ ID NO:62)和KW_sr22_p_seq_R1(5’GAGCGTGGTCTTGCCCAACCCTCCATAT 3’；SEQ ID NO:63)]。在得自野生型和2S突变体的基因组DNA上实施PCR，得到单链，将其进行直接的Sanger测序。野生型PCR产物的测序证明假定的启动子的序列，同时得自S2的PCR产物的序列包含突变。

随后，还通过基因组步移技术鉴定Sr22和Sr45的启动子(在Sr22情况下，证明启动子序列)和终止子序列。就基因组步移技术而言，使用APAgene^TM GOLD Genome Walking Kit(Bio SandT Inc.,Canada)根据制造商的方案扩增在cDNA起始位点以上的上游区域。在Sr22基因序列的5’区域设计的引物S22R13(5’GTTCTTGAGCAGCTTGTATTCATCCG 3’；SEQ IDNO:64)、S22R12(5’CAACATAGCTCCCAACTTCCG 3’；SEQ ID NO:65)和S22R11(5’ACTTCCGCCATTGTTGCTCTC 3’；SEQ ID NO:66)用于扩增ATG上游的区域，而得自3’区域的S22F35(5’CTCCTTCTAATTAGATGCATACATTAGAGG 3’；SEQ ID NO:67)、S22F36(5’GTAGCTCAAACCGTCGGTCC 3’；SEQ ID NO:68)和S22F37(5’GATTCGTCGCGATGAGATC 3’；SEQ IDNO:69)引物用于鉴定下游区域。类似地，使用S45F11(5’GGCCTAAACTATGGGAACCAAAATCC 3’；SEQ ID NO:70)、S45F12(5’GGAAATATATGGTTCCTTCACTGCG 3’；SEQ ID NO:71)和S45F13(5’GCAAGCGTGAGTCTGAATAGAGG 3’；SEQ ID NO:72)引物鉴定Sr45基因序列的3’区域。

实施例10：Sr22和Sr45的5'和3'RACE

通过5’和3’RACE提供转录物UTR区域的证明。根据Krattinger等人(Krattingeret al.(2009)Science 323:1360-1363)中所述方法，进行RNA提取、cDNA合成、5'和3'RACE(cDNA末端的快速扩增)。使用在5’区域设计的引物S22R13(5’GTTCTTGAGCAGCTTGTATTCATCCG 3’；SEQ ID NO:64)[用于Sr22]和S45G1(5’CAGTGGCCTGACTACAAACTCC 3’；SEQ ID NO:73)[用于Sr45]进行5’RACE反应，而使用得自3’区域的S22F13(5’CCTGCTTTGGGTTGTATCC 3’；SEQ ID NO:74)[用于Sr22]和S45G3(5’GCTGGATTGCAATAGTATTGAGTCC 3’；SEQ ID NO:75)[用于Sr45]进行3’RACE反应。为了证明剪接结构，使用S22F24(5’GAGAGAGAGAGAGCAACAATGG 3’；SEQ ID NO:76)和S22R39(5’ATAGAATATAGATGCACGCTAGATCTTT 3’；SEQ ID NO:77)[用于Sr22，得自野生一粒小麦]，S22F24(5’GAGAGAGAGAGAGCAACAATGG 3’；SEQ ID NO:76)和S22R37(5’CTGAATTCGTGATACTTGTCTTACTTAT 3’；SEQ ID NO:78)[用于Sr22，得自栽培一粒小麦]，以及S45F7(5’GCCTAACTCCAGACCATTTC 3’；SEQ ID NO:79)和S45R1(5’AACTTGACTCCCTTGAAGAGG3’；SEQ ID NO:80)[用于Sr45]引物对来扩增cDNA。

实施例11：Sr22和Sr45基因与它们各自的遗传基因座的共分隔

为了进一步验证我们克隆了Sr22和Sr45，我们使用所述序列以生成PCR分子标志物，并在高分辨率作图群体中显示与基因基因座的完全连锁(对于Sr22，Schomburgk xWestonia和PI190945x PI272557群体；对于Sr45，CS1D5406 x Chinese Spring)(图3-4)。使用序列特异性引物对所鉴定的Sr22基因序列进行作图，[对Schomburgk中Sr22具有特异性的S22F2(5’CGCAGATGGATTTCTGAAGGC 3’；SEQ ID NO:81)/S22R3(5’ATGTGCCAAATATCATAGTCCG 3’；SEQ ID NO:82),对PI190945中Sr22具有特异性的S22F2(SEQID NO:82)/S22R10(5’CAAATAACGGCTTCTGGG3’；SEQ ID NO:83)，对Westonia中Sr22(Schomburgk)的抗性基因类似物具有特异性的S22F2(SEQ ID NO:81)/S22R51(5’ATGGACTCGGCAATACTCC 3’；SEQ ID NO:84)，以及对PI272557中Sr22(Schomburgk)的抗性基因类似物具有特异性的S22F2(SEQ ID NO:81)/S22R22(5’AAGCTCCGTGATTCCTGTAAG 3’；SEQID NO:85)]。为了对Sr45作图，使用对Sr45基因具有特异性的引物对S45F1(5’AGTACTGTAATAATTGATTCCGTCG 3’；SEQ ID NO:86)/S45R1(5’AACTTGACTCCCTTGAAGAGG 3’；SEQ ID NO:80)。

实施例12：Sr22单体型分析

除了Schomburgk中存在的野生一粒小麦的Sr22来源以外，将得自栽培一粒小麦的秆锈病抗性的第二来源导入至其他六倍体小麦背景的染色体7A中，并且基于对秆锈病物种的一致特异性，也称为Sr22。六倍体小麦W3534(Paull et al.(1994)Theor.Appl.Genet.89:1039-1045)是野生一粒小麦衍生的Sr22的原型，并且在栽培一粒小麦集合的随后广泛分析中，多个编号(包括PI190945)被推测为Sr22的载体。已经证明PI190945具有单显性基因，所述单显性基因独立于除了Sr22以外的栽培一粒小麦秆锈病抗性基因而被分隔(Rouse and Jin(2011)Phytopathology 101:1418-1423)。除了用于构建作图群体的4个亲代品系以外，使用表3所示的32个栽培一粒小麦编号、16个野生一粒小麦编号(得自ICARDA)、DV92和W3534(Paull et al.(1994)Theor.Appl.Genet.89:1039-1045)鉴定Sr22基因序列的变体。使用2个重叠引物对来扩增Sr22相关的序列：S22F25(5’AACAATGGCGGAAGTTCTG 3；SEQ ID NO:87)和S22R16(5’ATGTTCTCTTCAGAGGATTTGTCA 3’；SEQID NO:88)，以及S22F2(SEQ ID NO:81)和S22R36(5’CGTGATACTTGTCTTACTTATTCCTAGTC 3’；SEQ ID NO:89)。就Westonia而言，使用引物对S22F29(5’CCGTGCTGTATACCATGTGA 3’；SEQID NO:90)和S22R51(SEQ ID NO:84)代替S22F25和S22R16。我们获得得自PI190945的对应Sr22序列，并且其与在二倍体作图群体(PI190945x PI272557)中位于与在Schomburgk中的直系同源位点所发现的相同位置处的抗性表型共分隔(图3)。此外，显示W3534和PI190945具有一致的Sr22样基因序列。然而，它们与Schomburgk中的参照Sr22基因序列具有33个氨基酸改变(图10A-10P)，表明对于这些基因型在Sr22基因座处的等位基因变异。得自栽培一粒小麦编号PI289605和PI330550的其他序列(其显示与PI190945相似的针对小麦秆锈病菌物种的应答)(表3)是彼此一致的，但是在7个氨基酸位置处与PI190945和W3534不同。在抗性野生一粒小麦编号(IG44857和IG44921)和Schomburgk的序列之间，也发现相似的氨基酸改变，而得自第三野生一粒小麦编号IG44855的序列与Schomburgk是几乎一致的，除了在于N末端区域的2个氨基酸删除(图10A-10P)。意外的是，具有低秆锈病感染的栽培一粒小麦编号PI573523的序列与易感野生一粒小麦编号IG44878的序列密切相关，表明抗性得自除了Sr22以外的基因座的可能性。总之，发现大量氨基酸可以提供二倍体A基因组类群(taxa)之间的差异，但是得自栽培一粒小麦的一种秆锈病易感编号的序列与野生一粒小麦抗性基因型归为一组，表明中间类群或错误分类的可能性(图7)。

表3.用于鉴定Sr22变体的二倍体编号(A基因组)和六倍体小麦

实施例13：Sr22和Sr45构建体的创建

由小麦(普通小麦)cv Schomburgk分离基因组片段7.815kb，其携带由野生一粒小麦渗入的Sr22秆锈病抗性基因。使用引物S22F14(5'GCGAACTTTACTGTCAACGG 3'；SEQ IDNO:91)+S22R4(5'CAAAGATCTCATCGCGACG 3'；SEQ ID NO:92)，以及Phusion High-FidelityDNA Polymerase(New England Biolabs Inc.)在制造商建议的条件下扩增所述片段。类似地，还使用S22F43(5’CAATTTCATCAAGACATGCG3’；SEQ ID NO:93)和S22R24(5’GATGTTATTTAATTATGGTTTGGCC 3’；SEQ ID NO:94)引物，由栽培一粒小麦编号PI190945扩增相应的Sr22序列。就Sr45而言，使用S45F1(5’AGTACTGTAATAATTGATTCCGTCG3’；SEQ ID NO:86)和S45R5(5’GAAATTCCTGCTGCATTGC3’；SEQ ID NO:137)引物，由节节麦编号AUS18911扩增包含Sr45的6.8kb基因组片段。将Sr22基因组片段克隆至二元载体pVecBARII(SEQ IDNO:163)的NotI位点中，所述二元载体是pWBvec8(Wang et al.(1998)Acta Hortic.461:401-405)的衍生物，其中，35S潮霉素基因已经被衍生自pCMneoSTL2的35S NPTII选择性标志物基因替代(Maas et al.(1997)Mol.Breed.3:15-28)。

通过GoldenGate克隆生成Sr22和Sr45二元构建体

1.Sr22和Sr45成分的设计

就Sr22而言，3种启动子(包括玉米泛素、Sr33启动子区和Sr22-PI190945启动子区)用于所述设计。得自3种不同来源(包括Sr22-Schomburgk、PI190945和PI573523)的Sr22编码区(由起始密码子至终止密码子的序列，包括外显子和内含子)用于所述设计。为了使构建体的合成简便，将编码区分成2个部分，即，编码区1和2。3个终止子区域(包括Sr22-Schomburgk、Sr22-PI190945和Sr33终止子)用于所述设计。

就Sr45而言，Sr45编码区用于所述设计。

就GoldenGate克隆而言，选择BsaI限制性核酸内切酶。因此，驯化(domesticate)所有的BsaI位点(即，在DNA合成之前，通过编辑除去)，而不改变编码区的外显子中预测的氨基酸编码序列并且不改变内含子剪接供体/受体位点。在Sr45的情况下，我们也除去单一的BpiI位点，而不改变预测的氨基酸编码序列。使用程序Geneious 7.1.7进行BsaI位点(在Sr45的情况下为BpiI)的驯化。加入序列AATG以连接启动子和编码区，并且加入GCTT以连接编码区和终止子。加入序列ACGT以连接编码区1和2。加入GGAG和CGCT以连接载体的左边界和右边界。

总共设计11个构建体，9个用于Sr22，而1个3个用于Sr45(表4)。

此外，设计并合成一种完整的合成基因，其BsaI位点未驯化，并且由与Sr22编码区融合的Sr33启动子构成，其中所述Sr22编码区与Sr33终止子融合。

为了有利于将合成基因转移至二元载体vecBAR II中，在启动子的起始处和终止子的终止处引入NotI位点。

2.构建体的合成

由市售可得的DNA合成提供者合成所有这些工具包构建体。载体PUC57中接受Sr22工具包序列，而载体pMS中接受Sr45构建体。

3.工具包构建体的质粒拯救

将包含工具包序列的质粒稀释100倍，并根据制造商的方案转化至得自LifeTechnology Ltd的SUBCLONING EFF DH5 COMPETENT CELLS中。将50μl的10倍稀释的转化的DH5铺展在具有抗生素选择的平板上。将单一的集落挑选至50ml圆锥管中的10mL BL培养基中并过夜培养。使用NucleoSpin Plasmid(Macherery-Nagel)，根据制造商的方案提取质粒。

4.GoldenGate克隆法

通过GoldenGate克隆，根据以下方案生成总共用于Sr22-Schomburgk的3个合成基因(启动子、编码区和终止子的组合)、用于Sr22-PI190945的2个合成基因、用于Sr22-PI573523的2个合成基因以及用于Sr45的3个合成基因(表4)：

a.100ng受体质粒-pICH47732用于各个反应。

b.针对浓度测试包含待插入的各部分的质粒。摩尔比例为2:1的插入物:受体质粒用于所有的启动子-编码区-终止子的组合。

c.2.0μl T4连接酶缓冲剂(10x,NEB)，2μl牛血清白蛋白(10x)，0.5μl400U/μl T4DNA连接酶(200units,NEB)和0.5μl 10U/μl BsaI(5个单位,NEB)用于各反应。反应时间表为：

37℃，20秒

然后进行如下的26个循环：

37℃，3min

16℃，4min

接着，

50℃，5min

80℃，5min

10℃，储存。

根据制造商的方案，将5μl反应物用于转化至Life Technology Ltd的DH5COMPETENT CELLS中。将50-100μl转化的DH5铺展至包含羧苄青霉素(50mg/ml)、IPTG(0.1mM)、X-Gal(20ug/ml)的平板上。在包含羧苄青霉素(50mg/ml)的LB培养基中培养白色集落。将5ml培养物沉淀下来，并使用NucleoSpin Plasmid(Macherey-Nagel)根据所述公司的方案提取质粒。

表4.用于8个Sr22和3个Sr45合成基因的启动子-编码区-终止子的组合

¹制备分离的Sr22合成基因用于表4中列出的各编码区。例如使用SEQ ID NO:141中列出的Sr22Schomburgk编码区构建第一Sr22-1合成基因，并使用SEQ ID NO:142中列出的Sr22 Schomburgk编码区构建第二Sr22-1合成基因。

使用程序Primers 3设计总共41种引物，用于检查由GoldenGate克隆得到的合成的Sr22和Sr45基因的序列(表5)。

表5. 41种引物的序列

5.将合成的基因转移至二元载体vecBAR II中

通过上文所用的相同的方案回收载体vecBAR II(第3点)。使用NotI消化vecBARII质粒，然后使用Antarctic Phosphatase(NEB)根据所述公司的方案将所述质粒脱磷酸化。

使用NotI，根据所述公司的方案消化得自GoldenGate克隆的包含合成的Sr22和Sr45基因的质粒。在琼脂糖凝胶上运行所消化的质粒，并且切除插入物条带，再使用QIAquick Gel purification Kit根据所述公司的方案进行纯化。接着，使用DNA T4连接酶，根据所述公司的方案连接Sr22和Sr45合成的基因(插入物)和脱磷酸化的vecBAR II。取得5μl连接反应物，转化至Life Technology Ltd的DH5 COMPETENT CELLS中。将50-100μl转化的DH5铺展在包含壮观霉素(50mg/ml)的平板上。在包含壮观霉素(50mg/ml)的LB培养基中培养单一的白色集落。使5ml培养物沉淀下来，并使用NucleoSpin Plasmid(Machery-Nagel)根据所述公司的方案提取质粒。将包含所需的插入物的二元质粒转化至用于小麦转化的根癌土壤杆菌中。

实施例14：使用Sr22和Sr45转化小麦

如Ishida et al.(2014)“Wheat(Triticum aestivum L.)Transformation UsingImmature Embryos,”in“Agrobacterium Protocols:Volume 1,”Methods in MolecularBiology 1223:199-209所述进行小麦的土壤杆菌转化。使用24℃，16h光/18℃，8h暗生长策略，在温室生长条件下使小麦栽培品种Fielder植物繁殖，并使用水溶胶(Aquasol)每2周一次对植物进行施肥。在开花期标记小麦头，并如Ishida等人(2014)所述并在CSIRO,Canberra,Australia(Richardson et al.(2014)Plant Cell Tiss.Organ Cult.119:647-659)中采用的那样，在开花期后12-14天收获小麦头用于转化试验。简言之，将种子在0.8％次氯酸钠溶液中进行表面消毒10min。在无菌条件下除去种子的胚芽，并与包含Sr22和Sr45基因组片段二元构建体的土壤杆菌菌种在WLS-AS培养基上在黑暗中共同培养2天(Ishidaet al.(2014)“Wheat(Triticum aestivum L.)Transformation Using ImmatureEmbryos,”in“Agrobacterium Protocols:Volume 1,”Methods in Molecular Biology1223:199-209)。在使用手术刀切除共同培养的胚轴后，将外植体随后转移至WLS-Res培养基中，并在24℃放置于黑暗中。在5天后，将外植体转移至包含5mg/ml草丁膦(PPT)的WLS-P5愈伤组织诱导培养基中用于愈伤组织形成。

2周后，将所得的愈伤组织一分为二，并在黑暗中在WLS-P10(10mg/lPPT)上放置3周。然后，在24℃在200μmols m^-2s^-1光照下，愈伤组织在LSZ-P5(5mg/l PPT)培养基上再生。将幼苗转移至LSF-P5(5mg/l PPT)培养基中，使根形成，并且一旦健壮的根系统发育形成，则将植物转移至温室中。

实施例15：Sr22和Sr45转化子对于抵抗秆锈病的评分

为了对Sr22和Sr45介导的抗性的存在情况进行评分，使用秆锈病抗性物种98-1,2,3,5和6感染得自T0和T1代的转基因品系。接种后2周，评估植物的抗性。具有抗性至中等抗性感染类型的植物的特征在于小至中等尺寸的夏孢子堆具有由萎黄病包围的绿色小岛。预计抗性和中等抗性感染类型与转基因植物中的转基因共分隔。相反，高感染类型的植物的特征为大的夏孢子堆，并且无萎黄病。预计高感染类型不与转基因植物中的Sr22或Sr45转基因共分隔。

实施例16：对转基因小麦中Sr22和Sr45介导的抗性的验证

将分离的构建体克隆至pVecBARII二元载体的NotI位点中，其中所述分离的构建体包含得自Schomburgk的Sr22、得自PI190945的Sr22、得自PI573523的Sr22或Sr45，并且具有天然的或非天然的调控元件(表6)，然后将所述构建体转移至土壤杆菌中，用于转化小麦栽培品种Fielder，基本如实施例14所述。针对抵抗澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性，筛选转基因小麦品系，基本如实施例15所述，并且结果示于图11A-11E中。

表6.用于产生转化的植物的构建体和转化子表型的描述

¹列出通过驯化由启动子区(P)、编码区(C)和终止子区(T)除去的限制性核酸内切酶位点。天然的表示没有位点被驯化。

²R＝抗性，S＝易感

图11A示出使用构建体PC103转化的易感栽培品种Fielder的结果，其中所述构建体PC103包含得自Schomburgk(野生一粒小麦)的Sr22，并具有天然的Sr22 5’和3’调控元件。该图示出6种转基因植物(编号PC103-1、-2、-3、-4、-5、-6)。发现所有的植物都对澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6具有抗性，类似于栽培品种Schomburgk中的Sr22应答(感染型2-)。

图11B示出使用构建体PC129转化的易感栽培品种Fielder的结果，其中所述构建体PC129包含得自PI190945(栽培一粒小麦)的Sr22，并具有天然的5’和3’调控元件。总共回收13种转基因植物，并针对抵抗澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性进行评分。植物编号PC129-1、-4、-6、-7、-8、-10、-11、-13具有类似于PI190945中的Sr22应答(感染型2-)的抗性。所有这8种植物中，图像中显示PC129-1、-4、-6、-11和-13。一种植物(PC129-9)具有感染型2(稍微高于PI190945)，而3种植物(PC129-2、-5和-12)具有感染型2+(高于PI190945)。一种植物(PC129-3)具有感染型3+，其类似于Fielder。

图11C示出使用构建体PC110转化的易感栽培品种Fielder的结果，其中所述构建体PC110包含得自节节麦编号AUS18911的Sr45，并具有天然的5’和3’调控元件。总共回收12种转基因植物，并针对抵抗澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性进行评分。七种植物(PC110-1、-2、-4、-5、-7、-10、-12)具有感染型1，其类似于AUS18911和CS1D5406中的Sr45。4种植物(PC110-3、-6、-9、-11)具有感染型1(稍微高于AUS18911)。一种植物(PC110-8)具有感染型3+，其类似于Fielder。

图11D-11E示出由转基因植物得到的结果，其中所述转基因植物包含得自Schomburgk的Sr22，得自PI190945的Sr22，以及得自PI573523的Sr22，并具有天然的或非天然的调控元件。使用构建体PC126、PC127、PC128、PC130、PC131、PC132、PC146和PC147转化易感栽培品种Fielder。用于各构建体的启动子、编码区和终止子列于表6中。对于各构建体而言，针对抵抗澳大利亚秆锈病物种98-1,2,3,5和6的抗性，对10种转基因植物进行评分。在图11D中，衍生自PC126、PC127、PC128、PC130和PC132的植物均具有感染型1+至2的抗性，而衍生自PC131的植物均是易感的并具有感染型3+。各构建体的代表性植物示于图片中。在图11E中，衍生自PC146的所有植物均是高度易感的，而衍生自PC147的植物(除了品系9)均产生感染型1，其为Sr45的典型的强抗性反应。

冠词“一个”和“一种”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)的冠词的语法对象。例如“一个元件”是指一个或多个元件。

在整个说明书中，词语分词形式的“包含”或其变体(例如动词形式的“包含”或分词形式的“包含”)应该理解为意味着涵盖所陈述的元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组，但是不包含任何其他的元件、整数或步骤，或者元件、整数或步骤的组。

在本说明书中提及的所有公开和专利申请表明了本发明所属技术领域的那些技术人员的水平。所有公开和专利申请均以引用方式并入本文，如同每一份公开或专利申请特意地且单独地表明以引用方式并入本文。

尽管为了达到清楚理解的目的，通过示意和实例相当详细地描述了上述发明，但是显而易见的是某些变化和修改可以在所附的权利要求书的范围内实施。

Claims (22)

1.包含核苷酸序列的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自：

(a)SEQ ID NO:1、4或49中列出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2、5或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；以及

(c)SEQ ID NO:3、6或51中列出的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的核酸分子，其中所述核酸分子为分离的核酸分子。

3.表达盒，其包含权利要求1所述的核酸分子以及可操作地连接的异源启动子。

4.载体，其包含权利要求1所述的核酸分子或者权利要求3的表达盒。

5.权利要求4所述的载体，其进一步包含其他的小麦秆锈病抗性基因。

6.权利要求5所述的载体，其中所述其他的小麦秆锈病抗性基因选自Sr26、Sr32、Sr33、Sr39、Sr40、Sr47和Sr50。

7.用于增强小麦植物抵抗小麦秆锈病的抗性的方法，所述方法包括将多核苷酸构建体引入至少一种小麦植物细胞中，所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO:1、4或49中列出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2、5或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；以及

(c)SEQ ID NO:3、6或51中列出的核苷酸序列。

8.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸构建体被稳定地引入所述植物细胞的基因组中。

9.权利要求7或8所述的方法，其中所述小麦植物细胞再生成在其基因组中包含所述多核苷酸构建体的小麦植物。

10.权利要求7或8所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含(b)或(c)的核苷酸序列和可操作地连接的用于在植物中表达所述核苷酸序列的启动子。

11.权利要求10所述的方法，其中所述启动子选自病原体诱导型、构成型、组织优选型、伤口诱导型和化学调节型启动子。

12.权利要求7所述的方法，其中相对于对照小麦植物而言，包含所述多核苷酸构建体的所述小麦植物包含抵抗由小麦秆锈病菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)的至少一个物种引起的小麦秆锈病的增强的抗性。

13.权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸构建体包含至少2个核苷酸序列。

14.权利要求13所述的方法，其中所述至少2个核苷酸序列的每一个编码用于抵抗小麦秆锈病的不同的蛋白质。

15.在农业农作物生产中限制小麦秆锈病的方法，所述方法包括：

(a)种植小麦种子，所述小麦种子在其基因组中稳定引入多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(i)SEQ ID NO:1、4或49中列出的核苷酸序列；

(ii)编码SEQ ID NO:2、5或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；和

(iii)SEQ ID NO:3、6或51中列出的核苷酸序列；以及

(b)使小麦植物在有利于所述小麦植物生长和发育的条件下生长。

16.权利要求15所述的方法，其进一步包括由所述小麦植物收获至少一个种子。

17.多核苷酸构建体用于产生小麦植物或种子的用途，所述小麦植物或种子在农业农作物生产中具有增强的抵抗小麦秆锈病的抗性，其中在所述小麦植物或种子的基因组中稳定引入所述多核苷酸构建体，并且其中所述多核苷酸构建体包含选自以下的核苷酸序列：

(a)SEQ ID NO:1、4或49中列出的核苷酸序列；

(b)编码SEQ ID NO:2、5或50中列出的氨基酸序列的核苷酸序列；以及

(c)SEQ ID NO:3、6或51中列出的核苷酸序列。

18.包含选自以下的氨基酸序列的多肽：

(a)由SEQ ID NO:1、4或49中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列；

(b)SEQ ID NO:2、5或50中列出的氨基酸序列；以及

(c)由SEQ ID NO:3中列出的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

19.用于鉴定小麦植物的方法，其中所述小麦植物展示新赋予的或增强的抵抗小麦秆锈病的抗性，所述方法包括检测所述小麦植物中选自Sr22和Sr45的R基因的存在情况，其中所述Sr22包含SEQ ID NO:1或4中列出的核苷酸序列或由SEQ ID NO:1或4中列出的核苷酸序列组成，并且所述Sr45包含SEQ ID NO:49中列出的核苷酸序列或由SEQ ID NO:49中列出的核苷酸序列组成。

20.权利要求19所述的方法，其中所述R基因的存在情况是通过检测所述R基因中至少一种标志物而检测的。

21.权利要求19或20所述的方法，其中所述方法包括检测Sr22和Sr45两者的存在情况。

22.权利要求19或20所述的方法，其中检测所述R基因的存在情况包括选自以下的一种：PCR扩增、核酸测序、核酸杂交以及用于检测由R基因编码的R蛋白质的免疫测试。

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