CN116640774B - 水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水稻基因工程技术领域，公开了水稻稻瘟病抗性基因Pik‑W25及其应用，该基因包括Pik‑W25‑1和Pik‑W25‑2，Pik‑W25‑1和Pik‑ W25‑1的蛋白序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，编码蛋白的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。抗谱分析表明，Pik‑ w25对不含无毒基因Avr‑Pik菌株敏感，对含有AvrPik‑D的菌株显示抗病，这与其他Pik等位基因一致。更重要的是，将AvrPik‑C、AvrPik‑D和AvrPik‑E转入到菌株R88002(该菌株不含有任何AvrPik单倍型)后，转基因菌株对Pik‑W25不能致病，这表明Pik‑W25可识别AvrPik‑C、AvrPik‑D和AvrPik‑E并引发抗病性。从这些数据我们可以得出结论，Pik‑W25是Pik一个等位基因。通过序列比对，我们发现Pik‑W25的序列是K1和K2的嵌合体，此前从未报道过。同时，对AvrPik‑C的抗性使Pik‑W25成为一种不可替代的Pik等位基因，可用于水稻育种中提高对稻瘟病的抗性。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因工程技术领域，具体涉及水稻稻瘟病抗性基因及其应用。
背景技术
水稻(Oryza sativa)是世界上50％以上人口的主要粮食作物，尤其在亚洲食品市场占主导地位。它的生产受到由子囊菌Magnaporthe oryzae引起的稻瘟病的威胁。将抗病(R)基因引入水稻品种是防治稻瘟病最有效、环保的方法。野生水稻(Oryza rufipogon)对人类和野生动物都具有重要意义。野生水稻是一个巨大的遗传多样性库，可用于探索大量有价值的基因，以提高水稻的质量和产量性状。例如，从野生水稻中克隆了抗稻瘟病基因Pid3-A4、Pi9和Pi54和抗白叶枯病基因Xa21。
目前，水稻中已有100多个R基因被定位，其中35个已克隆。大多数克隆的R基因编码含有核苷酸结合位点和富亮氨酸重复序列(NBS-LRR)结构域的蛋白质。基于N端结构域，NBS-LRR基因可系统地分为三个亚类:Toll/Interleukin 1受体(TIR)-NBS-LRR、Coiled-coi l(CC)-NBS-LRR和抗白粉病8(RPW8)-NBS-LRR。LRR结构域和非LRR结构域(TIR和NBS)均被报道用于确定病原体识别特异性。此外，NB-LRR蛋白中的核心核苷酸结合折叠是称为NB-ARC结构域的更大实体的一部分，因为它存在于APAF-1(凋亡蛋白酶激活因子-1)、R蛋白和CED-4(秀丽隐杆线虫死亡-4蛋白)中。
抗稻瘟病的R基因集中在6号、11号和12号染色体上，一些克隆的R基因定位于同一位点，称为等位基因。水稻Pik位点上的8个等位基因(Pik,Pik-p,Pik-h,Pikm,Piks,Pike,Pi7和Pi1)已被分离和鉴定，其功能由一对紧密相连的CC-NBS-LRR基因决定。除Piks外，克隆的Pik等位基因共享大于90％的序列，Heavy-Metal Associated(HMA)结构域占DNA变异的最大部分。六种AvrPik单倍型(AvrPik-A,B,C,D,E和F)被克隆，AvrPik-F(GeneBank登录号:KU593517)不能激活对任何Pik等位基因的抗性。Pik等位基因与AvrPik单倍型之间的相互作用与HMA结构域的一些多态残基和效应子的多态性有关。Pik等位基因与AvrPik单倍型之间的相互作用呈现“军备竞赛”模式。研究表明，AvrPik-D单倍型最有可能是祖先单倍型，水稻中的Pik-p出现最早识别AvrPik-D；AvrPik-D之后进化出能够逃避Pik-p识别的AvrPik-E，然后水稻进化出了能够识别AvrPik-E的Pik；进一步稻瘟病菌进化出AvrPik-A以逃避Pik的识别，然后水稻进化Pikm以识别AvrPik-A。到目前为止，还没有识别AvrPik-C和AvrPik-F的Pik等位基因。
由于稻瘟病菌中Avr基因的高水平变异性，大多数R基因不能提供持久抗性。因此，不断鉴定新的R基因或等位基因，分析其与M.oryzae无毒基因相互作用的分子机制，对防治稻瘟病具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明从野生稻中发掘新的R基因Pik-W25，明确了含Pik-W25水稻品种的抗性水平，这些研究丰富了无毒基因与抗病基因间的相互作用机制，为水稻稻瘟病的防治提供理论依据。
第一方面，本发明提供了一种水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25，包括Pik-W25-1和Pik-W25-2，所述Pik-W25-1和所述Pik-W25-2编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
第二方面，本发明还提供了一种水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25，包括Pik-W25-1和Pik-W25-2，所述Pik-W25-1和所述Pik-W25-2的核苷酸分子序列分别如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
第三方面，本发明还提供了含有所述Pik-W25-1或所述Pik-W25-2核苷酸分子的重组载体或重组微生物，所述重组载体为向表达载体或克隆载体插入权利要求2中所述Pik-W25-1或所述Pik-W25-2核酸分子得到的重组质粒。
第四方面，本发明还提供了所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25产生的分子标记，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.5所示，扩增所述分子标记的引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
第五方面，本发明还提供了所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25、所述的重组载体或重组微生物、所述的分子标记在抗稻瘟病水稻品种育种或鉴定或提高水稻对稻瘟病菌的抗性中的应用。
第六方面，本发明还提供了一种提高水稻对稻瘟病菌抗性的方法，所述的方法为将所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25转入到水稻中。
在某些实施例中，将所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25连接到水稻表达载体上导入到水稻中；或将含有所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25的水稻或种子通过有性杂交的方式将抗性基因Pik-W25转入到水稻中。
第七方面，本发明还提供了一种利用所述的分子标记鉴定水稻是否含有所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25的方法，包括如下步骤：利用所述的引物对水稻DNA模板进行PCR扩增；扩增产物为210bp片段，即含有所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25。
在某些实施例中，所述扩增产物分子标记的序列如SEQ ID NO.5所示，扩增所述分子标记的引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
本申请与现有技术相比，发现了一个新的Pik等位基因，称为Pik-W25。通过BSA-Seq在11号染色体端粒2.1Mb处定位Pik-W25，遗传分析表明，Pik-W25与HMA结构域紧密相连。抗谱分析表明，Pik-W25对不含无毒基因Avr-Pik菌株敏感，对含有AvrPik-D的菌株显示抗病，这与其他Pik等位基因一致。更重要的是，将AvrPik-C、AvrPik-D和AvrPik-E转入到菌株R88002(该菌株不含有任何AvrPik单倍型)后，转基因菌株对Pik-W25不能致病，这表明Pik-W25可识别AvrPik-C、AvrPik-D和AvrPik-E并引发抗病性。从这些数据我们可以得出结论，Pik-W25是Pik一个等位基因。通过序列比对，我们发现Pik-W25的序列是Pik-W25-1和Pik-W25-2的嵌合体，此前从未报道过。同时，对AvrPik-C的抗性使Pik-W25成为一种不可替代的Pik等位基因，可用于水稻育种中提高对稻瘟病的抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1用BSA-Seq在11号染色体端粒2.1Mb处定出R基因。A:R-bulk中SNPs的AlleleFrequency，横轴表示SNPs在不同染色体上的物理位置，纵轴表示SNPs的AlleleFrequency；B:S-bulk中SNPs的等位频率；C:s-体和r-体的等位基因频率差(AFD)，横轴表示SNP在不同染色体上的物理位置，纵轴表示SNP的等位基因频率差；D:CMH检验结果，横轴为不同染色体上SNP的物理位置，纵轴为计算负对数P值的CMH检验结果，-log10(P值)；E:AFD的滑动窗口结果，块大小为10kb。横轴表示SNP在不同染色体上的物理位置，纵轴表示通过计算立方AverageAFD得到的平均等位基因频率差异；F:BSA-Seq鉴定的基因组区域范围。
图2WR25中R基因与Pik位点HMA结构域的连锁分析红色三角形的线代表阳性对照。P的意思是池子。P1-P23代表DNA池1到DNA池23。
图3WR25 BC3F3子代对不同分离株的识别模式。R88002是亲本分离株，将6个AvrPik单倍型转入菌株R88002中，以水稻品种CO39为感病对照。
图4Pik-W25基因结构及Pik等位基因同源树。A)Pik-W25-1和Pik-W25-2的基因结构。B)Pik-1等位基因同源树。C)Pik-2等位基因的同源树。D)Pik等位基因HMA结构域同源比对分析。E)Pik-W25结构类型分析。
图5利用Pik-W25-1分子标记对119个江苏省主栽品种中Pik-W25-1的分布频率分析
图6抗病基因Pik-W25-1识别无毒基因AvrPik-C、-D、-E分析。A)采用致病性分析CRISPR/cas9编辑获得的Pik-W25-1功能丧失突变体对含有AvrPik-C、-D、-E菌株的抗性。B)测序验证CRISPR/cas9编辑成功获得了Pik-W25-1功能丧失突变体纯合子#7和#10。
具体实施方式
材料与方法
1、植物材料及分离株
本发明使用的植物材料列在表1中。从国际水稻研究所(IRRI)的国际水稻基因库(IRGC)(https://www.irri.org/)中获得野生水稻31种。在申请人团队保存了6个含有不同Pik等位基因的单基因系(表1)。除6株转基因菌株外，其余菌株均来自申请人团队稻瘟病分离株采集(表2)。6株转基因分离株来自福建农林大学闽台作物生态有害生物防治国家重点实验室。
表1使用的植物材料
表2使用的分离株的收集年份和收集地点
2、遗传群体构建
以5个野生稻品种WR2、WR9、WR18、WR22和WR25，及感病水稻品种CO39为亲本构建F2群体。以CO39为循环亲本，构建BC1F1、BC1F2、BC2F1、BC2F2、BC3F1、BC3F2和BC3F3群体。用Ca89接种构建的群体，在WR25中追踪目标R基因。用Ca89接种BC1F1群体，挑选出抗性株系，移植抗性株系。以CO39为雌株，在花期与抗性BC1F1系杂交，生成BC2F1。抗性BC1F1系也会通过自交产生BC1F2。同样，用Ca89接种BC2F1群体，移植抗性株系。将抗性BC 2F1与CO39杂交，生成BC3F1。抗性BC2F1系也会通过自交产生BC2F2。将BC3F1群体接种Ca89，将抗性株系移植生成BC3F2。BC3F2群体接种Ca89，抗性的BC3F2将被移植产生BC3F3子代。BC3F3子代采用单株采集。每个BC3F3群体选择30粒种子接种Ca89，只有未分离的群体作为目的R基因的单基因系WR25 BC3F3。
3、病原菌接种和病情指数评估
温室人工接种水稻致病性的病情指数评估遵循Yanoria等人(2008)的方法。即病原菌菌株在梅子琼脂培养基(3颗梅子、5gα-乳糖一水合物、1g酵母提取物、21g琼脂条和1L蒸馏水)中培养，用0.02％(vol/vol)吐温20蒸馏水收集孢子。接种的最终孢子浓度为1ⅹ105分生孢子/ml。以3～4叶期水稻幼苗为接种对象，进行稻瘟病接种。接种后6-7天按照Bonman et al(1986)的方法进行疾病评估，0级：没有病斑；1级：直径小于0.5mm的褐色斑点，没有孢子。2级：直径为0.5-1mm的褐色斑点，没有孢子；3级：直径为1-3mm的圆形或者椭圆形病斑，中间灰白，病斑边缘褐色，可以产生孢子；4级：3mm或者更长的梭形病斑，中间灰白，可以产孢，有的会出现水渍状病斑；5级病斑形状与第4级相同，不过不同病斑会连接在一起导致2-4个水稻叶片的至少一半叶片组织被菌杀死。病斑等级为1-3的视为抗病，4-5级视为感病。
4、测序文库建设与NGS测序
对于BSA-Seq，通过选择100个极端抗性(R-bulk)和100个极端易感(S-bulk)个体，并使用DNeasy Plant Maxi Kit提取两个bulk的基因组DNA，建立了两个DNA库。从两个bulk中获得等量的叶片，用两个bulk中的10ug DNA构建测序文库。测序是由“Novogene:Genomesequencing Company”(https://en.novogene.com/)在Illumina HiSeqTM 2500平台上完成的。使用bwa mem(版本0.7.15)对Nippon bare参考基因组(版本RGAP 7)的测序readsreads进行比对(Li and Durbin 2010)。使用Samblaster(版本0.1.24)标记重复(Faust and Hall 2014)，使用Samtools(版本1.6)排列比对hit(Li and Durbin 2010)。Freebayes(Garrison和2012年3月)被用来调用变体(snp和短indel)。变体处理器(https://github.com/jointgene/VariantsProcessor)was)的Perl脚本，用于过滤低质量的变体。只留下亲本纯合、亲本F1多态的变异进行进一步分析。
5、等位基因频率(AF)和等位基因频率差(AFD)分析
每个变体有两个等位基因，来自两个bulk的等位基因的数量可以形成一个2×2的列表。在本发明中，来自CO39的S-bulk中等位基因的数量称为“a”，WR25的S-bulk等位基因数称为“b”，R-bulk中来自CO39的等位基因数称为“c”，WR25在R-bulk中的等位基因数称为“d”。
等位频率(Allele Frequency，AF)表示每个SNP标记的等位基因在混池中出现的概率。来自于CO39的SNP的等位基因在感病池中的等位频率计算如下：AFCO39 in S-bulk＝a/(a+b)；来自于CO39的SNP的等位基因在抗病池中的等位频率计算如下：AFCO39 in R-bulk＝c/(c+d)；来自于WR25的SNP的等位基因在感病池中的等位频率计算如下：AFWR25 in S-bulk＝b/(a+b)；来自于WR25的SNP的等位基因在抗病池中的等位频率计算如下：AFWR25 inR-bulk＝d/(c+d)。
利用等位频率差(Allele Frequency Difference，AFD)衡量等位基因读数的差异大小。来自于CO39的SNP的等位基因在感病池和抗病池的等位频率差计算如下：AFDCO39inS-bulk and R-bulk＝{a/(a+b)}-{c/(c+d)}；来自于WR25的SNP的等位基因在感病池和抗病池的等位频率差计算如下：AFDWR25 in S-bulk and R-bulk＝{b/(a+b)}-{d/(c+d)}。
利用Cochran-Mantel-Haenszel检验(简称CMH检验)衡量等位基因读数的差异显著性。为了定位目标基因所在基因组区间(Loc us)，采用BReM(区块回归定位)方法中的“Block+LOESS+AI Cc”的数据平滑方法，对各个单标记统计量进行数据平滑(或称拟合、回归)。设定区块大小(block size)为10kb，对各种单标记统计量进行数据平滑、或回归拟合等，计算结果及其平滑曲线。
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1从100个水稻品种中筛选候选野生稻
为了从野生稻中挖掘新的抗病基因，从国际水稻所引进了100种普通野生稻材料。为了筛选在Pi2/9位点新的等位基因，首先用Pi2/9位点的分子标记对100种野生稻材料进行筛选，发现31种野生稻材料都含有Pi2/9位点保守的序列。为了找到与已克隆的Pi2/9位点等位基因抗谱不同的水稻材料，用4个针对Pi2/9位点的鉴别菌株对31种野生稻材料进行抗谱分析，结果五种野生稻材料(WR2、WR9、WR18、WR22和WR25)的抗谱与已克隆的Pi2/9位点的抗病基因(Pi2、Pizt和Pi9)不同，因此可以用来进行新基因的挖掘。首先对WR25与CO39进行杂交，获得的F2材料进行遗传分析。用对WR 25无毒的Ca89接种该F2群体，从接种结果来看，一共234株F2个体，188株抗病，46株感病，用卡方测验检测，其结果符合3：1的抗感分离比(表3)，说明WR25对Ca89的抗性是由一个基因或位点控制。接种后用44个感病材料做连锁分析，所用的分子标记是Pi2/9位点特有的显性分子标记Pi50F2/R2，该分子标记在抗病材料中能扩出1169bp条带，在感病材料中扩不出条带。结果44个感病材料有10个都能扩出条带，说明控制WR25对Ca89抗性的R基因与Pi2/9位点不连锁，不能利用等位基因挖掘法来克隆该基因。
表3WR25分离群体接种结果的卡方测验
实施例2利用BSA-seq技术将WR25的R基因定位在11号染色体端粒上
为了快速定位WR25对Ca89抗性的目标基因，采用BSA-Seq的方法。
首先用Ca89接种WR25和CO39杂交的BC1F2群体，1131株水稻材料中有866株抗病，265株感病(表3)，卡方测验结果证明其符合3：1的分离比，再次证明了WR25对Ca89的抗性是由一个基因或位点控制。接种后取100株极感病的植株作为感病池(S-bulk)，同时取100株极抗病的植株作为抗病池(R-bulk)。用The DNeasy Plant Maxi Kit试剂盒分别提取感病池和抗病池的基因组DNA并将基因组DNA送到公司进行全基因组重测序。测序平台是Illumina HiSeqTM 2500。CO39作为母本，其序列先前已测通，可以直接分析。S-bulk和R-bulk基因组DNA用来建库，平均插入大小分别为341bp和348.6bp。CO39、S-bulk和R-bulk的总读段数(reads)分别为61291878、283071846和350950212个(表4)。日本晴的基因组序列作为整个序列分析的参考基因组序列。CO39、S-bulk和R-bulk的总读段数分别有95.4％、96.04％和95％能够比对到参考基因组上，该比对率可以反映出较好的测序质量。除了比对率，覆盖深度(coverage depth)和覆盖度(coverage)也可以反映测序质量。平均测序深度(Mean of coverage depth)＝比对到参考基因组上的碱基总数除以参考基因组大小。S-bulk和R-bulk的平均覆盖深度为118.73和97.86。另外用参考基因组中至少有1次/5次/7次/10次/20次覆盖的碱基占基因组的百分比(Coverage at least 1X/5X/7X/10X/20X)表示覆盖度。S-bulk和R-bulk至少1次覆盖的碱基占日本晴基因组的百分比分别是95.12％和94.99％(表4)；S-bulk和R-bulk至少7次覆盖的碱基占日本晴基因组的百分比分别是91.91％和91.61％；S-bulk和R-bulk至少10次覆盖的碱基占日本晴基因组的百分比分别是91.08％和90.72％，S-bulk和R-bulk至少20次覆盖的碱基占日本晴基因组的百分比分别是89.04％和88.46％(表4)。
表4CO39与抗病池和感病池的全基因组测序结果
通过Freebayes软件分析比对结果，获得了26914个SNPs和31720个Indels数据集(表5)。为了进一步调查变异在基因组上的密度分布，通过滑动窗口(滑动窗口大小设为3Mb)对变异集进行扫描，结果是SNP在12条染色体上的个数分别为：14448、74365、30075、1942、19453、15593、53128、1790、1131、5258、24702和4931。InDel在12条染色体上的个数分别为：1915、9561、4144、128、2417、1868、7309、82、45、778、2922和548，可以看出，SNP和InDel主要集中在1号和3号染色体的前端以及2号、6号、7号和11号染色体的末端。
表5测序鉴定到的SNP和Indel再不同染色体分布的个数
| Chromosome | ThenumberofSNPs | ThenumberofInDels |
| 1 | 14448 | 1915 |
| 2 | 74365 | 9561 |
| 3 | 30075 | 4144 |
| 4 | 1942 | 128 |
| 5 | 19453 | 2417 |
| 6 | 15593 | 1868 |
| 7 | 53128 | 7309 |
| 8 | 1790 | 82 |
| 9 | 1131 | 45 |
| 10 | 5258 | 778 |
| 11 | 24702 | 2822 |
| 12 | 4931 | 548 |
为了找到与目标基因连锁的SNP分子标记，将所有的SNP在抗病池和感病池中的等位频率以及两个池的等位频率差进行分析。所有SNP在抗病池和感病池的等位频率只有一个比较高的峰，位于11号染色体。除了该峰所在的区域，SNP在抗病池和感病池中的等位频率都在0.5上下浮动，但是11号染色体峰所在的区域，SNP在抗病池中的等位频率接近于0，在感病池中的等位频率接近于1(图1中A和B)。等位频率差在11号染色体峰接近于-1，在其他位置接近于0(图1中C)。同时，对SNP在抗病池和感病池中的等位频率进行统计学分析，首先用CMH分析SNP的等位频率在两个池中的差异显著性，用-log10(p value)进行计算并分析，11号染色体峰的-log10(pvalue)接近于40，P<0.01说明在这个区域，SNP在抗病池和感病池中的等位频率差异显著。相反的，在其它区域，-log10(p value)接近于0，P约为1，说明SNP在抗病池和感病池中的等位频率基本没有差异(图1中D)。由以上结果可以初步判断关联SNP的位置位于11号染色体。为了定位目标基因所在基因组区间(Locus)，采用BRe M(区块回归定位)方法中的“Block+LOESS+AICc”的数据平滑方法，对各个单标记统计量进行数据平滑(或称拟合、回归)。对于等位频率差采用等位频率差均值(Average allelefrequency difference，Avg.AFD)的三次方来计算(图1中E)。从数据平滑结果可知，目标基因主峰应位于11号染色体末端。为了精确定位目标基因所在的区间，11号染色体上所有的SNP的等位频率，等位频率差以及统计学分析的数据平滑结果被分析，最终确定的区间大约为2.1Mb(26,900,000bp-29,021,106bp)(图1中F)。
实施例3WR25抗Ca89的R基因与Pik位点紧密相连
众所周知，Pik位点也位于11号染色体的端粒上。为明确WR25中R基因与Pik位点之间的关系，在BC2F2群体接种Ca89后，对900个易感株系进行了连锁分析(表3)。基于Pik位点HMA结构域设计了显性标记RGA4F3/R3，在含Pik等位基因的抗性株系中扩增出1354bp片段。在4个抗性株系中都能扩增出目标条带，而在900个敏感株系中则不能，说明WR25抗Ca89的R基因与Pik位点紧密相连(图2)。
实施例4WR25抗Ca89的R基因特异性识别AvrPik-C、AvrPi k-D和AvrPik-E
为了确定WR25抗Ca89的R基因是否为Pik等位基因，用17株差异分离株接种BC1F2子代。如表6所示，BC1F2子代易受11个不含AvrPik单倍型的分离株(IK81-25、M015-9、M015-13、M015-45、M015-52、M015-119、M015-120、M015-144、M015-145、M015-171和M015-249)和3个只含AvrPik-f的分离株(Ca41、M015-245和MO15-247)的影响(表6)。对仅含有AvrPik-D的IK81-3和M101-7-2-1-1具有抗性(表6)。我们还分析了Ca89的序列，发现其含有AvrPik-D和AvrPik-E(表6)。从结果推测，R基因很可能是Pik等位基因，至少可以识别AvrPik-D。
表6不同菌株对不同品种的反应模式
为了验证我们的推测，我们构建了WR25中R基因的单基因系(BC3F3群体)，并将亲本分离株R88002和6株含有AvrPik-A、-B、-C、-D、-E、-F的转基因分离株接种。作为敏感对照，CO39对R88002和6个转基因分离株敏感(图3)。单基因系对R88002和含有AvrPik-B和f的转基因菌株敏感，而单基因系对含有AvrPik-C、-D和-E的转基因菌株抗性。值得注意的是，单基因系对含有AvrPik-A的分离物的抗性强于R88002(图3)。结果表明，WR25抗Ca89的R基因由一个Pik等位基因控制，至少可以识别AvrPik-C、-D和-E，这种新的等位基因被称为Pik-W25。
实施例5Pik-W25序列是K1和K2的嵌合体
采用5对引物(RGA4F1/R1、RGA4F2/R2、RGA4F3/R3、RGA5F1/R1和RGA5F2/R2)扩增了两个相邻NBS-LRR基因Pik-W25的序列(Pik-W25-1和Pik-W25-2)，引物序列如表7所示。
表7引物序列
长度为564、566和2299bp的三个外显子组成了Pik-W25-1，推导出的基因产物编码了一个1143残基多肽(图4)。Pik-W25-1的N端区域包含CC结构域、HMA结构域(残基186-259)和NBS-ARC结构域，C端区域包含LRR重复序列(图4)。Pik-W25-2的3066bp编码区被一个164bp的内含子中断，推导出的基因产物编码了一个1022残基多肽(图4)。
如图4所示，Pik-W25-1/Pikh-1、Pik-W25-1/Pi7-1、Pik-W25-1/Pi kp-1、Pik-W25-1/Pik-1、Pik-W25-1/Pik-1、Pik-W25-1/Pik-1和Pik-W25-1/Pikm-1氨基酸序列一致性水平分别为98.77％、98.69％、98.60％、96.50％、96.76％和96.50％(图4)。基于Pik-W25-2氨基酸序列的类似比较显示，相似度为99.71％(Pik-h-2,Pikp-2和Pi7-2)，99.61％(Pi k-2和Pikm-2)和99.51％(Pi1-2)(图4)。有趣的是，Pik-W25-1的HM A结构域(残基186-259)与K1的Pikh-1、pikp-1和pi7-1一致，而Pi k-W25-1的NB-ARC结构域(残基262)与K2的Pik-1、Pikm-1和Pi1-1一致，说明Pik-W25是K1和K2的嵌合体，所述Pik-W25的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示。
实施例5Pik-W25-1特异性分子标记的检测应用
为了更好的对抗病基因Pik-W25-1进行应用，根据其基因组序列与其他Pik等位基因的比对分析，设计了一个分子标记，其序列如SEQ ID NO.5所示，利用引物Indel-25-1-F：5’-ACTCGTGGTCATGC CGTTTC-3’(SEQ ID NO.6)和引物Indel-25-1-R：5’-CACTCATGTTCTCTGATTC-3’(SEQ ID NO.7)对该分子标记进行扩增，PCR体系为20μl，含2ⅹphantaFlash Master Mix 10μl，1μl的DNA模板，1μl的上下游引物，7μl的ddH2O。PCR反应程序：预变性94℃5分钟；变性94℃45秒，退火57℃30秒，延伸72℃20秒，32个循环，充分延伸72℃10分钟。扩增产物在2％琼脂糖凝胶电泳，在成像仪下观察并拍照，结果如图5所示。
该分子标记能够在Pik-W25-1启动子区扩增出210bp的DNA片段，但其他Pik等位基因均可以扩增出216bp的DNA片段。利用这个分子标记对江苏省119个水稻主栽品种进行检测，结果如图5所示，36个品种能够扩增出216bp条带，在转基因植株#7和阳性对照G9中扩增出210bp的DNA片段，如SEQ ID NO.5所示ACTCGTGG TCATGCCGTTTCTCCCTAATATTCCCTCCGTCCTTTGATATAATGTCTTTAACATTTTGCTTGTACTACTCCCTCCATTATAAAATATAAGTCATAACCACCCCTAACCCAAACACCAAGAAAATAATTATTATTATCTTGTAGTTTAGAATATCCTAATAAATACAATGCATGCATCCAATAGAATCAGAGAACATGAGTG(SEQ ID NO.5)，其余均未扩增出条带，上述结果表明119个主栽品种中36个品种含有其他Pik等位基因，83个品种不含有任何Pik等位基因，1株转基因植株中成功转入Pik-W25(G9为阳性对照)。
实施例6抗病基因Pik-W25-1识别无毒基因AvrPik-C、-D、-E分析
为了研究Pik-W25是否识别Avr-Pik-C、D和-E，使水稻植株产生抗病性，本申请在G9背景下生成了Pik-W25-1缺失功能突变的CRISPR/cas9编辑转基因水稻品系。经过CRISPR/cas9编辑的水稻品系#7和#10经PCR和DNA测序鉴定为纯合子(图6B)。更进一步，本申请测试了这些转基因水稻品系对R88002和含有AvrPik-A、-B、-C、-D、-E和-F的6个转基因分离株的抗性，转基因水稻品系7号和10号的突变恢复了对含有AvrPik-C/D/E的稻瘟病菌的易感性(图6A)。这说明Pik-W25基因可以应用到抗病水稻品种生产中。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (7)
1.一种水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25，其特征在于，由Pik-W25-1、Pik-W25-2和promoter区域组成，所述Pik-W25-1和所述Pik-W25-2的核苷酸分子序列分别如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示，所述Pik-W25的核苷酸序列如SEQ ID NO .8所示。
2.含有权利要求1中所述Pik-W25-1或所述Pik-W25-2的核苷酸分子的重组载体，其特征在于，所述重组载体为向表达载体或克隆载体插入权利要求1中所述Pik-W25-1或所述Pik-W25-2的核酸分子得到的重组质粒。
3.一种用于检测权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25的分子标记，其特征在于，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.5所示，扩增所述分子标记的引物序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。
4.权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25或权利要求2所述的重组载体在抗稻瘟病水稻品种育种中的应用，其特征在于，所述应用具体为识别无毒基因AvrPik-C、AvrPik-D和AvrPik-E。
5.一种提高水稻对稻瘟病菌抗性的方法，其特征在于，所述的方法为将权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25转入到水稻中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25连接到水稻表达载体上导入到水稻中；或将含有权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25的水稻或种子通过有性杂交的方式将抗性基因Pik-W25转入到水稻中。
7.一种利用权利要求3所述的分子标记鉴定水稻是否含有权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用权利要求3中所述的引物对水稻DNA模板进行PCR扩增；扩增产物为210bp片段，即含有权利要求1所述的水稻稻瘟病抗性基因Pik-W25。
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