CN108913795B - 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物分子遗传学领域，涉及抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法。抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法，利用水稻抗病品系D4与感病品种广恢998杂交和自交获得的F₂群体进行关联分析和遗传连锁分析，获得抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9，其位于分子标记Indel32‑Indel35之间，分子标记Indel32引物，存在qSRBSDV9时扩增条带为111bp条带；分子标记Indel35引物，存在qSRBSDV9时扩增条带为147bp条带。本发明可通过抗南方水稻黑条矮缩病基因的分子标记来检测抗性材料D4及其衍生品种(系)中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病基因位点，可预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。

Description

抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法

技术领域

本发明属于植物分子遗传学领域，涉及抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米为主要粮食。南方水稻黑条矮缩自2001年首次被发现以来，在短短的几年间病情蔓延迅猛，给我国南方广大稻区及越南北部水稻生产造成了极大损失。与普通水稻黑条矮缩病不同，南方水稻黑条矮缩病是一种以白背飞虱为主要传播媒介的水稻病毒病，其病原病毒为南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，简称SRBSDV），是呼肠孤病毒科斐济病毒属第2组的一个新种。目前，生产上针对此类病害尚无特效农药，主要是在植株早期通过对白背飞虱的防治，减轻其危害，但防治效果不理想，且污染环境，破坏生态系统。

培育和利用抗病品种一直被公认为最经济有效和环境友好的防治病毒措施，筛选、发掘和创新抗病种质是抗南方水稻黑条矮缩病育种的前提和基础。然而，对南方水稻黑条矮缩病抗性遗传特性的研究鲜见报道，更无关于南方水稻黑条矮缩病抗性基因/QTL定位及抗病育种的报道。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明公开了抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9，位于分子标记Indel32-Indel35之间；所述分子标记Indel32引物，存在qSRBSDV9时的扩增条带为111bp条带；所述的分子标记Indel35引物，存在qSRBSDV9时的扩增条带为147bp条带。

作为优选，所述的分子标记Indel32引物的上游序列和下游序列分别具有SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2所示的序列；所述的分子标记Indel35引物的上游序列和下游序列分别具有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示的序列。

本发明还提供了所述抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9的分子标记方法：用分子标记Indel32引物或分子标记Indel35引物扩增抗南方水稻黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记Indel32引物能够扩增出111bp扩增片段或用用分子标记Indel35引物能够扩增出147bp扩增片段，则标志着南方水稻黑条矮缩病品种或育种材料中存在抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9。

本发明还提供了所述的抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9的分子标记的筛选方法，包括以下步骤：

（1）以抗南方水稻黑条矮缩病的普通野生稻导入系材料D4为供体，感南方水稻黑条矮缩病的栽培稻品种广恢998为受体，通过杂交和自交构建了一套包含5000个株系的水稻F2遗传分离群体；

发明人对648份栽培稻、普通野生稻及野生稻导入系材料进行了南方水稻黑条矮缩病的人工接种和田间诱发鉴定，筛选到1份南方水稻黑条矮缩病发病率较低的材料—普通野生稻导入系D4，该普通野生稻材料导入系D4连续三年三点田间鉴定均对南方水稻黑条矮缩病表现高抗，进一步进行室内接种鉴定，三次重复鉴定的结果表明该品系具有较高的南方水稻黑条矮缩病抗性。该抗源的发掘为抗南方水稻黑条矮缩病基因的定位、克隆和育种利用提供了材料基础。

（2）采用室内接种鉴定方法对F₂衍生的F_2：3系进行南方水稻黑条矮缩病的抗性鉴定；

（3）根据F_2：3系的鉴定结果，在F₂群体中取高抗和高感各50个水稻单株，利用CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）提取水稻植株的DNA，构建DNA高、低池，利用基于重测序技术的QTL-seq方法对抗南方水稻黑条矮缩病基因进行主基因定位；

（4）在初定位区间，开发InDel标记，利用染色体代换作图技术，筛选重组单株，结合分子标记带型及抗性表型数据，将初定位抗病基因限定在两个分子标记之间；

（5）获得抗南方水稻黑条矮缩病野生稻导入系材料D4抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9一个，位于标记Indel32-Indel35之间，通过抗南方水稻黑条矮缩病主基因的分子标记来检测抗性材料D4及其衍生品种（系）中是否含有该主基因位点，预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。

其中，步骤（3）中所述主基因定位于第9染色体上。

本发明提供了所述的抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9在水稻育种中的应用。

本发明提供了所述的抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9在快速筛选抗南方水稻黑条矮缩病品种或者品系中的应用。

本发明提供了所述的抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9的分子标记引物在在水稻育种中的应用。

本发明提供了所述的抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9的分子标记引物在快速筛选抗南方水稻黑条矮缩病品种或品系中的应用。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

（1）本发明利用抗南方水稻黑条矮缩病的普通野生稻导入新材料D4与感病品种广恢998杂交和自交获得的F2进行关联分析和遗传连锁分析，获得一个抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9，通过与qSRBSDV9连锁的分子标记来检测抗性材料D4及其衍生品种（系）中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病基因位点，可以预测其南方水稻黑条矮缩病的抗性水平，大大提高抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。

（2）本发明所提供的抗南方水稻黑条矮缩病主效基因位点的分子标记方法，具有以下优点：

①本发明在国际上首次用利用基于重测序技术的QTL-seq方法和InDel分子标记定位了水稻抗南方水稻黑条矮缩病位点。

②通过本发明分子标记定位的抗性基因位点位置明确，鉴定方便快捷。通过检测这些与抗南方水稻黑条矮缩病基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的南方水稻黑条矮缩病抗性水平，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有南方水稻黑条矮缩病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种，抗性基因位点的检测方便快速，不易受环境影响。

③辅助育种选择目标明确，效率高。以往的传统育种技术，在提高抗性育种方法中，通常利用含抗病基因的供体亲本与受体亲本进行杂交、多次回交或聚合复交。而且要对南方水稻黑条矮缩病的抗性进行单株选择；然而，由于南方水稻黑条矮缩病不能经过白背飞虱的虫卵传毒，要经过饲养白背飞虱、饲毒和接种传毒等复杂的鉴定过程，鉴定难度很大，表型鉴定的结果可靠性低；因此，抗南方水稻黑条矮缩病育种不仅费时费工，而且难度大、成本高。通过利用本发明中的分子标记检测南方水稻黑条矮缩病基因位点，可以在苗期就鉴定出抗南方水稻黑条矮缩病的单株，淘汰其它植株，不仅节约成本，而且大大提高了抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。

附图说明

图1为抗南方水稻黑条矮缩病基因紧密连锁分子标记Indel32的电泳图谱；

其中，M：Mark；1：广恢998；2：D4；1-15：极抗单株。

图2为抗南方水稻黑条矮缩病基因紧密连锁分子标记Indel35的电泳图谱；

其中，M：Mark；1：广恢998；2：D4；1-18：极抗单株。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂、试剂盒和仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如果没有作特别说明的，与常规使用的方法一致。

实施例1：

材料与方法

步骤1：遗传分析分离群体的构建

以抗南方水稻黑条矮缩病野生稻导入新材料D4为父本，感南方水稻黑条矮缩病品种广恢998为母本，配制F₁杂种，再进行自交加代繁种获得F₂群体。再自交一代，获得衍生群体F_2：3家系，用于南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定。

步骤2：采用室内接种方法鉴定水稻的南方水稻黑条矮缩病的抗性

把健康低龄白背飞虱转到水稻病株上饲毒2-3d，再转到健康TN1稻苗上，饲养10-12d度过循回期后作为接种传毒介体。在广西农科院水稻所人工气候室内进行接种，温度为26-28℃，相对湿度为75%-90%，将待鉴定水稻材料种植在1000ml的透明塑料杯中，每个材料30株，于1.5-2.5叶龄期接种，接虫量为每株苗4头虫，每天8时和16时驱虫两次，尽量使稻苗均匀获毒，传毒2d后将虫转移走，将已接种的水稻苗移植到防虫网室或温室，常规管理。接种20d后调查每个品种的发病株数，之后每隔7d调查一次，共调查3次，统计每个品种的发病率。重复3次，感病对照品种为TN1。发病率=发病株数/总株数×100%。

步骤3：广恢998 /D4 分离群体的抗南方水稻黑条矮缩病主基因定位

（1）用CTAB法提取亲本、及F₂群体株系的DNA，在F₂群体中取高抗、高感各50株,利用CTAB法提取水稻植株的DNA，构建DNA高、低池；

（2）利用基于重测序技术的QTL-seq方法对抗病基因进行分析和基因定位，实验步骤如下：

①重测序实验流程

样品基因组DNA检测合格后，用机械打断的方法（超声波）将DNA片段化，然后对片段化的DNA进行片段纯化、末端修复、3′端加A、连接测序接头，再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行PCR扩增形成测序文库，建好的文库先进行文库质检，质检合格的文库用Illumina HiSeqTM 2500进行测序。

②数据组装

A 数据过滤

为了保证数据质量，要在信息分析前对原始数据进行质控，并且通过数据过滤来减少数据噪音。我们对下机的 clean reads 再进行更严格的过滤，得到 High qualityclean reads，用于后续的信息分析。

B 比对基因组

使用比对软件bwa（0.7.12）采用mem算法将过滤后的 reads 比对到参考基因组上，比对参数为 -k 32 -M；比对完之后结果使用 picard （1.129）软件（MarkDuplicates）进行标记，在随后进行识别Variant时过滤掉。

C Variant分析

使用软件 GATK （3.4-46）的UnifiedGenotyper模块将处理好的比对文件进行多个样本的Variant检测，检测到的变异使用VariantFiltration进行过滤，过滤参数为 -Window 4，-filter "QD < 4.0 || FS > 60.0 || MQ < 40.0 "，-G_filter "GQ < 20"。使用 ANNOVAR 对检测出的Variant进行功能注释。

③关联分析

为减少测序错误和比对错误造成的影响，对计算出snp index后的样本多态性位点进行过滤：

1. 以主效亲本样本的snp作为参考基因组，符合两个亲本纯和且不一致的深度均大于2的位点作为差异位点；

2. 过滤掉子代snp index都小于0.3，snp深度都小于6的位点；

3. snp index分布图以1M为窗口100k为步进绘制，过滤掉2M范围内小于10个位点的区域；

4. 计算delta(snp index)，即两个子代snp index作差（主效减次效）绘制分布图；

5. 进行1000次置换检验，选取95%（青色）置信水平作为筛选的阈值。

步骤4：利用第9染色体的InDel标记分析F₂分离群体并对抗病基因进行分析。

SSR分析程序如下：

①所述12μlPCR反应体系包括：DNA(10ng/μl)，2μl；Primer(4pmol/μl)，1.5μl；2×Taq PCR Master Mix(中科瑞泰)，6μl；ddH2O，2.5μl；

②扩增反应在东盛龙ETC811扩增仪上进行，所述PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性35s，55℃复性35s，72℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。扩增产物用8%的非变性PAGE胶分离，通过银染显色。亲本间有多态的引物在F₂群体进行分析，获取样本基因型信息；

④以水稻品种日本晴基因组序列为参考序列，利用D4和GH998的全基因组重测序序列在第9染色体上的差异InDels，开发InDel标记。利用多态性InDel标记对F₂群体的单株进行基因型分析，使用Join Map4.0进行连锁分析，绘制连锁遗传图，使用Map QTL6.0进行QTL扫描，利用重组单株进一步缩小定位区间。

步骤5：结果与分析

D4和广恢998经南方水稻黑条矮缩病的田间和室内鉴定，其平均发病率分别为4.86%和82.23%，表明D4具有较高的南方水稻黑条矮缩病抗病性，而广恢998高感南方水稻黑条矮缩病。

以1M为窗口，100kb为步长计算每个子代池的 SNP-index 及△(SNP-index)。对比感池和抗池的SNP-index，在95%置信水平下，大于阈值的窗口作为候选区间，发现在第9条染色体上的16 300 001-17 700 001bp之间出现了SNP不平衡的状况。表明感池单株在此区段与GH998含有相同的片段，而抗池单株在同一区域与D4含有相同的片段。以95%（青色线）置信水平作为筛选的阈值，该区域的△(SNP-index)值大于筛选阈值，因此第9条染色体16300 001 -17 700 001b可能存在控制南方水稻黑条矮缩病抗性的主效QTL位点，命名为qSRBSDV9。

在第9染色体上设计了70对InDel引物，经验证后发现其中10对InDel标记在亲本间具有良好的多态性，分析F₂群体各单株在该区段各InDel标记的基因型并结合抗性表型进行QTL检测，结果显示在标记Indel 7和Indel 40之间（物理位置为16.3Mb-17.7Mb）检测到一个与南方水稻黑条矮缩病抗性相关的主效QTL，其与qSRBSDV9的位置相同。LOD值为4.8，可以解释34.6%的表型贡献率。

进一步在qSRBSDV9定位区间内开发了15对具有良好多态性的InDel标记，并对F₂群体各株系进行基因型分析，最终筛选到12株在该区段重组的单株。结合表型数据进一步将qSRBSDV9限定于标记Indel32和Indel35之间，即第9染色体上17 393 019-17 495 354bp之间102.3kb的范围内。

分子标记Indel32引物：

上游引物：ACTCTGGGAGTGGAGGAT

下游引物：ACCTCACCTGTTCTGTGTTC

分子标记Indel35：

上游引物：GAATCATCCACACACACAGA

下游引物：GTTCACCTGCAGACTCTCTC

用分子标记Indel32引物或者用Indel35引物扩增抗南方水稻黑条矮缩病品种或育种材料DNA。

如图2所示，用分子标记Indel32能够扩增出111bp的扩增片段，或用分子标记Indel35引物能扩增出147bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病的位点qSRBSDV9的存在。

通过与上述基因位点连锁的分子标记来检测抗性材料D4及其衍生品种（系）中是否含有抗南方水稻黑条矮缩病基因位点，可预测其南方水稻黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑条矮缩病水稻的选择效率。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所

<120> 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法

<130> ZYWS

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

actctgggag tggaggat 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

acctcacctg ttctgtgttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

gttcacctgc agactctctc 20

Claims (2)

1.鉴定抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9的分子标记方法，其特征在于：用分子标记Indel32引物，或用分子标记Indel35引物扩增水稻抗南方水稻黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记Indel32引物能够扩增出111bp扩增片段，或用分子标记Indel35引物能够扩增出147bp扩增片段，则标志着水稻抗南方水稻黑条矮缩病品种或育种材料中存在抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9；

所述分子标记Indel32引物的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示；

所述分子标记Indel35引物的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQID No.4所示。

2.检测抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9的分子标记引物在快速筛选抗南方水稻黑条矮缩病品种或品系中的应用，所述分子标记引物包括分子标记Indel32引物和分子标记Indel35引物；

所述分子标记Indel32引物的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示；

所述分子标记Indel35引物的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQID No.4所示。

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