CN104046693A - 水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9及其分子标记方法 - Google Patents

水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9及其分子标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9及其分子标记方法。对抗黑条矮缩病水稻品种9194(♀)与感病品种苏御糯(♂)杂交获得的F2单株的基因型和相应F2:3家系的黑条矮缩病抗性级别进行遗传连锁分析，获得抗黑条矮缩病品种9194抗黑条矮缩病基因位点四个，其中qRBSDV9位于标记RM3912-RM257之间。通过抗黑条矮缩病基因的分子标记来检测抗性品种9194及其衍生品种(系)中是否含有黑条矮缩病抗性基因位点，可预测其黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。

Description

水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9及其分子标记方法
分案说明
本申请是2013-03-29日申请的申请号为2013101097989，发明名称为“水稻品种9194抗黑条矮缩病位点及其分子标记方法”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于分子遗传学领域，涉及水稻品种9194 qRBSDV9抗黑条矮缩病位点及其分子标记方法。
技术背景
水稻是我国的重要粮食作物。水稻黑条矮缩病是一种由水稻黑条矮缩病毒(Riceblack-streaked dwarf virus,RBSDV)引起的病毒病，主要由灰飞虱以持久性不经卵方式进行传播。近年来，随着耕作制度和栽培方式的变化、冬季气候变暖和感病品种的大面积推广，传毒介体灰飞虱发生量日益上升，水稻黑条矮缩病在江苏、浙江、江西和福建大规模发生，并迅速上升为生产上最主要的病毒病害，给水稻的安全生产带来很大威胁。水稻黑条矮缩病的典型症状是病株矮缩，叶色浓绿僵硬，叶背、叶鞘和茎杆有早期蜡白色，后期为黑褐色的短条纹不规则突起，严重发病株不抽穗。目前生产上针对此类病害尚无特效农药，主要是早期通过对灰飞虱的防治，减轻其危害，但防治效果并不理想，且污染环境，破坏生态平衡。防治病毒病最理想的方法是选育和利用抗病品种，筛选、发掘和创新抗病种质是开展抗黑条矮缩病育种的前提和基础。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供水稻品种9194抗黑条矮缩病位点及其分子标记方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
水稻品种9194抗黑条矮缩病位点，包括位于分子标记RM282-RM14898之间的qRBSDV3，位于分子标记RM20069-RM30之间的qRBSDV6、位于分子标记RM3912-RM257之间的qRBSDV9和位于分子标记RM26062-RM536之间的qRBSDV11；所述的分子标记RM282引物为SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，存在qRBSDV3时的扩增条带为146bp条带；所述的分子标记RM14898引物为SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，存在qRBSDV3时的扩增条带为176bp条带；所述的分子标记RM20069引物为SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，存在qRBSDV6时的扩增条带为162bp条带；所述的分子标记RM30引物为SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8，存在qRBSDV6时的扩增条带为136bp条带；所述的分子标记RM3912引物为SEQ ID NO.9/SEQID NO.10，存在qRBSDV9时的扩增条带为191bp条带；所述的分子标记RM257引物为SEQ IDNO.11/SEQ ID NO.12，存在qRBSDV9时的扩增条带为155bp条带；所述的分子标记RM26062引物为SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14，存在qRBSDV11时的扩增条带为149bp条带；所述的分子标记RM536引物为SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16，存在qRBSDV11时的扩增条带为242bp条带。
水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV3的分子标记方法：用分子标记RM282引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记RM14898引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM282引物能够扩增出146bp的扩增片段，或用分子标记RM14898引物能够扩增出176bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV3的存在。
水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV6的分子标记方法：用分子标记RM20069引物：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，或者用分子标记RM30引物：SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM20069引物能够扩增出162bp的扩增片段，或用分子标记RM30引物能够扩增出136bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV6的存在。
水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的分子标记方法：用分子标记RM3912引物：SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10，或者用分子标记RM257引物：SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM3912引物能够扩增出191bp的扩增片段，或用分子标记RM257引物能够扩增出155bp的扩增片段均标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的存在。
水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV11的分子标记方法：用分子标记RM26062引物：SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14，或者用分子标记RM536引物：SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM26062引物能够扩增出149bp的扩增片段，或用分子标记RM536引物能够扩增出242bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV11的存在。
筛选所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点的分子标记的方法，包含如下步骤：
(1)以抗黑条矮缩病品种9194为母本，感黑条矮缩病粳稻品种苏御糯为父本，配制杂种F1,构建了包含200个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系,进行抗黑条矮缩病鉴定；
(2)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料；
(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离；
(4)采用田间诱发结合室内接种鉴定进行黑条矮缩病的抗性鉴定；
(5)利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型和相应家系的黑条矮缩病抗性级别进行连锁分析，并将Kosambi函数转换为遗传距离。利用Windows QTL CartographerV2.0软件复合区间作图法，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率；
(6)获得抗黑条矮缩病品种9194抗黑条矮缩病基因位点四个，分别为qRBSDV3，位于标记RM282-RM14898之间；qRBSDV6，位于标记RM20069-RM30之间；qRBSDV9，位于标记RM3912-RM257之间；qRBSDV11，位于标记RM26062-RM536之间。通过抗黑条矮缩病主基因的分子标记来检测抗性品种9194及其衍生品种(系)中是否含有该主基因位点，可预测其黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。
本发明所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点在水稻育种中的应用。
本发明所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点优选在快速筛选抗黑条矮缩病品种或品系中的应用。
本发明所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点的分子标记引物在水稻育种中的应用。
本发明所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点的分子标记引物在快速筛选抗黑条矮缩病品种或品系中的应用。
有益效果
前期，申请人对来源于20个国家共960份水稻品种进行了抗黑条矮缩病田间诱发和人工接种鉴定，筛选到4个黑条矮缩病发病率较低的水稻品种，其中水稻品种9194，连续三年每年三个地点田间鉴定均对黑条矮缩病表现高抗，进一步室内鉴定结果也表明，该品种具有较高的黑条矮缩病抗性。该抗源的发掘为抗水稻黑条矮缩病基因的定位、克隆和育种利用提供了基础材料。本发明利用9194与感病品种苏御糯杂交获得的F2群体进行遗传连锁分析，获得四个抗黑条矮缩病基因位点，分别为qRBSDV3，qRBSDV6，qRBSDV9和qRBSDV11。通过与上述四个基因位点连锁的分子标记来检测抗性品种9194及其衍生品种(系)中是否含有抗黑条矮缩病基因位点，可预测其黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。本发明所提供的水稻品种9194抗黑条矮缩病主效基因位点的分子标记方法，具有以下优点：
(1)通过本发明在国际上首次用SSR标记定位了水稻品种9194中的抗黑条矮缩病的基因位点。
(2)通过本发明分子标记定位的抗性基因位点位置明确，鉴定方便。通过检测这些与抗黑条矮缩病基因位点连锁的分子标记，即可以预测水稻植株的黑条矮缩病抗性，用于水稻品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有黑条矮缩病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种。抗性基因位点的检测方便快速，不受环境影响；
(3)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要收集具有抗源的亲本与栽培品种进行一系列杂交，而且要对黑条矮缩病的抗性进行单株选择。对水稻黑条矮缩病进行表型鉴定复杂，同时受环境影响，由于黑条矮缩病不能经卵传毒，要经饲养灰飞虱、带毒和接种传毒等复杂的鉴定过程，非常困难，表型鉴定的结果可靠性低。因此，抗黑条矮缩病育种不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测抗黑条矮缩病基因位点，可以在苗期就鉴定出抗黑条矮缩病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。
附图说明
图19194和苏御糯接种后的抗性表现。
图29194和苏御糯F2群体抗黑条矮缩病次数分布图。
图3水稻品种9194抗黑条矮缩病基因在染色体上的分布。
图4抗黑条矮缩病基因紧密连锁分子标记的电泳图谱。M:Mark；1:9194；2:苏御糯；3：F1；4-13:极抗单株；14-23：极感单株。
具体实施方式
材料与方法：
(一)9194/苏御糯F2群体构建及表型鉴定
(1)以抗黑条矮缩病品种9194为母本，感黑条矮缩病粳稻品种苏御糯为父本，配制杂种，构建了9194/苏御糯F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的9194/苏御糯F2:3家系。
(2)表型鉴定
(2.1)田间诱发鉴定
材料分别种植于东海县黄川镇、赣榆县土城镇和灌云县东辛农场试验田，选用四周为麦田的地块种植待鉴定材料，以保证获得足量虫源。2010和2011年材料均在5月10日(麦收前3周)分两个重复进行播种，每个重复单个品种播80粒，均匀撒播1行，行长50cm，行距10cm。6月27日移栽，单苗栽插，行株距15cm×20cm，每个品种栽插60穴。常规肥水管理，不施用任何农药。2012年鉴定材料分别于5月5日、5月10日和5月15日分3个播期进行播种，每个品种播150粒，移栽时间分别为6月20日、6月25日和6月30日，每个品种栽插120穴，其他种植方式与2010和2011年相同。黑条矮缩病诱发如下：首先通过盘拍法调查灰飞虱虫口密度，将33cm×45cm×5cm的搪瓷盆对准秧苗基部轻拍植株，使灰飞虱拍落于盘中，然后迅速将落入盘中的灰飞虱导入高约为60cm，直径约为35cm的塑料桶内。于6月上旬在试验田进行调查，种植材料田块对角线定5点取样，每点拍0.30m2，记载灰飞虱数量。随机对从实验田块采集来的100头灰飞虱进行水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR检测，确定携毒率。
于7月下旬水稻分蘖盛期统计发病率。此时发病植株表现出明显的病状：极明显的矮缩、心叶突破下叶叶鞘而出、部分植株表现为从下叶枕口呈螺旋状伸出、部分叶片的顶端出现旋状卷曲。而健康稻株表现分蘖旺盛，生命力强，但尚未拔节，发病植株和健康植株反差非常明显。另外，此时的发病植株很少有中间型病状，以每个试验点2个重复的发病百分率平均值作为品种抗黑条矮缩病表型值进行统计。
(2.2)人工接种黑条矮缩病毒
将亲本、抗病和感病对照品种浸种催芽，播种200粒露白发芽种子于70.5cm×50.5cm×41.5cm的塑料箱内，底部接塑料管通水，保持水层约3cm。当秧苗长至2.5-3.0叶时间苗，淘汰病弱苗，保留约150株整齐一致的健苗，每个塑料箱顶端用纱布封口。于2012年6月10日接入从东海黄川(试验点中灰飞虱带毒率最高)采集的灰飞虱进行接种，每天驱赶灰飞虱数次。7d后拿掉纱布，移走苗上的灰飞虱，把接种后的苗移栽到大田，长至分蘖盛期时调查病情。人工接种同期每个品种做三个重复，按每苗20头灰飞虱计算接虫。
(二)9194/苏御糯F2群体的分子标记分析
(1)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA。
(2)SSR分析参照Chen et al.(1997)的程序。10μl反应体系包括：10mM Tris-HCl pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,50μM dNTPs,0.2μM引物,0.5U Taq polymerase(TaKaRa,大连)和20ng of DNA模板。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃4min；94℃1min,55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃7min。扩增产物用8％的非变性PAGE胶分离，通过银染显色，银染程序根据Sanguinetti et al.(1994)的方法制定而成。扩增的DNA条带利用装有荧光灯的灯箱进行观察。记录结果，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料；
(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMAKER/EXP3.0，最小LOD值设为2，获得连锁图谱；
(4)利用Windows QTL Cartographer V2.0软件(Wang et al.，2003)复合区间作图法(Compositeinterval mapping，CIM)，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描。QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验(Permutation test)(Churchill and Doerge，1994)方法进行估计，共重复抽样1000次。同时估计了各位点的加性效应和贡献率。利用MAPMAKER/3.0分析软件进行黑条矮缩病抗性与SSR标记的分离分析。并将Kosambi函数转换为遗传距离(cM)。
(三)结果与分析：
9194和苏御糯经黑条矮缩病的田间和室内鉴定其平均发病率分别8.9％和78％，表明9194具有较高的黑条矮缩病抗性，而苏御糯对黑条矮缩病高度敏感(图1)。200个F2:3家系对黑条矮缩病的抗性频率分布呈连续分布，表明该群体中可能存在多个抗黑条矮缩病位点(图2)。从F2群体中挑选三个地点及室内鉴定均表现高抗或高感的单株各10株，进行12条染色体的连锁分析，在水稻第3，6，9和11染色体发现与目标性状有连锁迹象。进一步构建了第3，6，9和11全染色体的连锁图谱，结合表型数据，利用Windows QTL Cartographer V2.0软件进行抗黑条矮缩病的QTL检测。结果在水稻第3染色体标记RM282-RM14898之间检测到一个抗黑条矮缩病QTL qRBSDV3，LOD值为2.34，贡献率为5.4％；在水稻第6染色体标记RM20069-RM30之间检测到一个抗黑条矮缩病QTL qRBSDV6，LOD值为4.42，贡献率为10.3％；在水稻第9染色体标记RM3912-RM257之间检测到一个抗黑条矮缩病QTL qRBSDV9，LOD值为6.63，贡献率为35.5％；在水稻第11染色体标记RM26062-RM536之间检测到一个抗黑条矮缩病QTL qRBSDV11，LOD值为3.55，贡献率为31.1％。上述四个QTLs可解释表型变异82.3％(图3)。
分子标记RM282引物：
上游引物：CTGTGTCGAAAGGCTGCAC(SEQ ID NO.1)
下游引物：CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG(SEQ ID NO.2)
分子标记RM14898引物：
上游引物：ATGTTCAACCTTGTCCCGACTAACC(SEQ ID NO.3)
下游引物：TAAAGACGGCAGCTATCACTTTGC(SEQ ID NO.4)
用分子标记RM282引物：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2或者用分子标记RM14898引物：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4，扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM282引物能够扩增出146bp的扩增片段，或用分子标记RM14898引物能够扩增出176bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV3的存在(图4)。
分子标记RM20069引物：
上游引物：GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG(SEQ ID NO.5)
下游引物：CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG(SEQ ID NO.6)
分子标记RM30引物：
上游引物：ACACTGTAGCGGCCACTG(SEQ ID NO.7)
下游引物：CCTCCACTGCTCCACATCTT(SEQ ID NO.8)
用分子标记RM20069引物：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，或者用分子标记RM30引物：SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM20069引物能够扩增出162bp的扩增片段，或用分子标记RM30引物能够扩增出136bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV6的存在(图4)。
分子标记RM3912引物：
上游引物：GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG (SEQ ID NO.9)
下游引物：CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG(SEQ ID NO.10)
分子标记RM257引物：
上游引物：ACACTGTAGCGGCCACTG(SEQ ID NO.11)
下游引物：CCTCCACTGCTCCACATCTT(SEQ ID NO.12)
用分子标记RM3912引物：SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10，或者用分子标记RM257引物：SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM3912引物能够扩增出191bp的扩增片段，或用分子标记RM257引物能够扩增出155bp的扩增片段均标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的存在(图4)。
分子标记RM26062引物：
上游引物：TTTGCGTTTGCGTTTGCGTAGG (SEQ ID NO.13)
下游引物：ACCCGTACACCTCCACACAGTGC(SEQ ID NO.14)
分子标记RM536引物：
上游引物：TCTCTCCTCTTGTTTGGCTC (SEQ ID NO.15)
下游引物：ACACACCAACACGACCACAC(SEQ ID NO.16)
用分子标记RM26062引物：SEQ ID NO.13/SEQ ID NO.14，或者用分子标记RM536引物：SEQ ID NO.15/SEQ ID NO.16扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM26062引物能够扩增出149bp的扩增片段，或用分子标记RM536引物能够扩增出242bp的扩增片段，则标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV11的存在(图4)。
通过与上述四个基因位点连锁的分子标记来检测抗性品种9194及其衍生品种(系)中是否含有抗黑条矮缩病基因位点，可预测其黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。

Claims (5)

1.水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的分子标记方法，其特征在于：用分子标记RM3912引物：SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10，或者用分子标记RM257引物：SEQ ID NO.11/SEQID NO.12扩增水稻抗黑条矮缩病品种或育种材料DNA，如果用分子标记RM3912引物能够扩增出191bp的扩增片段，或用分子标记RM257引物能够扩增出155bp的扩增片段均标志着水稻品种抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的存在。
2.筛选权利要求1所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点的分子标记的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)以抗黑条矮缩病品种9194为母本，感黑条矮缩病粳稻品种苏御糯为父本，配制杂种F1,构建了包含200个单株的F2分离群体，每个F2单株通过自交获得相应的F2:3家系,进行抗黑条矮缩病鉴定；
(2)用SDS法提取亲本、F1及F2群体各株系的DNA，采用简单重复序列标记SSR对两亲本进行多态性筛选，PCR在PTC-200扩增仪上进行，扩增产物在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析，亲本间有多态的引物在F2群体中进行分析，获取群体基因型资料；
(3)根据连锁交换规律，利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱，所用软件为MAPMARKER/EXP3.0，用Kosambi函数将重组值转换为遗传距离；
(4)采用田间诱发结合室内接种鉴定进行黑条矮缩病的抗性鉴定；
(5)利用MAPMARKER/EXP3.0软件对各个分子标记的群体基因型和相应家系的黑条矮缩病抗性级别进行连锁分析，并将Kosambi函数转换为遗传距离，利用Windows QTL CartographerV2.0软件复合区间作图法，以2cM为步长在全基因组范围内进行扫描，QTL的检测采用5％总体显著水平，相应LOD统计量的显著阈值用排列测验方法进行估计，共重复抽样1000次，同时估计了各位点的加性效应和贡献率；
(6)获得抗黑条矮缩病品种9194抗黑条矮缩病基因位点四个，分别为qRBSDV3，位于标记RM282-RM14898之间；qRBSDV6，位于标记RM20069-RM30之间；qRBSDV9，位于标记RM3912-RM257之间；qRBSDV11，位于标记RM26062-RM536之间，通过抗黑条矮缩病主基因的分子标记来检测抗性品种9194及其衍生品种(系)中是否含有该主基因位点，预测其黑条矮缩病抗性水平，大大提高抗黑条矮缩病水稻的选择效率。
3.权利要求1所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的分子标记引物，其特征在于包括分子标记RM3912引物：SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10，或者分子标记RM257引物：SEQID NO.11/SEQ ID NO.12。
4.权利要求3所述的水稻品种9194抗黑条矮缩病位点qRBSDV9的分子标记引物在水稻育种中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的分子标记引物在快速筛选抗黑条矮缩病品种或品系中的应用。
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