CN112813192A - 小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22及其检测引物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体公开一种小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU‑LrZH22及其检测引物和应用。所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU‑LrZH22具有如SEQIDNO:1所示的核酸序列。本发明提供的小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU‑LrZH22与小麦抗叶锈病基因Lr13发生共分离，且与小麦抗叶锈病基因Lr13紧密连锁，有助于更准确的筛选出具有小麦抗叶锈病基因Lr13的小麦品种，为提高小麦育种筛选工作的效率和准确性提供了极佳的CAPS分子标记。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及一种小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22及其检测引物和应用。
背景技术
小麦是世界范围内最重要的粮食作物之一，也是主要的食物来源。然而，几千年来小麦锈菌成为小麦生产的重要威胁。小麦锈菌有小麦叶锈菌(Puccinia triticinia)、小麦秆锈菌(P.graminis f.sp.tritici)和小麦条锈菌(P.striiformis f.sp.tritici)。其中由小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病较为常见，在世界范围内发生最为广泛，是危害小麦产量的重要因素之一，病害严重流行年份可使小麦减产40％以上。随着全球性气候变暖，未来的温度和湿度条件可能会更加适合小麦叶锈病的发生和流行。生产实践表明，利用携带抗病基因的抗病品种防治小麦锈病是一种经济、有效、且对环境友好的措施。
小麦对锈病的抗性有两种，第一种抗性为小种专化抗性(race-specificresistance)，控制小种专化抗性的基因称为主效抗病基因，主效抗病基因一般可与病原生理小种的无毒基因之间产生特异性相互作用，从而限制病原菌小种的进一步侵染，属质量性状，这种抗性不持久，常因病原菌毒性的变化而丧失。利用基因聚合、多系品种及基因布局可以延长小种专化抗性基因的寿命，但必须有丰富的有效抗病基因。另一种为非小种专化抗性(race-non-specific resistance)，一般在成株期表现，又称慢锈性(slow rustingresistance)。这种抗性一般由3-5个数量性状基因控制，也被称作“水平抗性”。这些控制数量性状的基因构成数量性状位点(quantitative trait loci，QTL)，具有数量性状抗性的品种对多数生理小种都有一定抗性，但都不是完全免疫的，寄主与病原菌和平共处，不易引起病原菌产生毒性变异。因而，非小种专化抗性较小种专化抗性更持久。
LrZH22/Lr13是一个来源于普通六倍体优良小麦品种周麦22的温敏抗叶锈病基因，在苗期和成株期均表现抗叶锈病，尤其在高温情况下。该基因的应用主要是通过表型选择，抗病育种费时费力，需要经过多代回交和抗病表型筛选的过程，增加了LrZH22/Lr13基因的抗性育种的周期和难度。Wang(2016)等通过分子标记，发现6个SSR分子标记和2个EST-STS分子标记与LrZH22/Lr13基因紧密连锁，并将其定位在小麦2BS染色体上标记Xbarc55和Xgwm374之间7.2cM的遗传区间。由于这些分子标记与LrZH22/Lr13基因距离较远，导致其在分子标记辅助选择育种中实用性和精确性不足，无法满足生产上利用分子标记辅助选择育种的现实需求。
发明内容
针对现有小麦LrZH22/Lr13基因的抗性育种存在的上述问题，本发明提供一种小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22及其检测引物和应用，上述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的选择及提供的检测引物能快速筛选出具有叶锈病抗性的小麦材料，从而加速小麦新品种的育成步伐。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22，其具有如SEQIDNO:1所示的核酸序列。
相对于现有技术，本发明提供的小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22与小麦抗叶锈病基因Lr13共分离，与小麦抗叶锈病基因Lr13紧密连锁，有助于更准确的筛选出具有小麦抗叶锈病基因Lr13的小麦品种，为提高小麦育种筛选工作的效率和准确性提供了极佳的CAPS分子标记。
本发明还提供检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物，其由上游引物SEQIDNO:2和下游引物SEQIDNO:3组成。
通过本发明提供的上述上游引物SEQIDNO:2和下游引物SEQIDNO:3，可以特异性的准确的扩增出小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22上431bp的碱基序列，该碱基序列经过限制性内切酶HindⅢ的酶切，可得到297bp和134bp的DNA片段，因此，将酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色和扫描观察，通过观察的酶切产物片段的数量和大小即可准确判断出待测小麦品种是否携带小麦抗叶锈病基因Lr13。与现有技术中需要对扩增产物的碱基序列进行基因测序相比，实现了对小麦抗叶锈病基因Lr13的快速判断，提高选择育种的效率，节约大量检测成本和时间成本，具有极高的应用价值。
本发明还提供检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物在小麦抗叶锈病分子标记辅助选择育种中的应用。
本发明提供的检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物极大提高了通过小麦抗叶锈病分子标记辅助选择育种的效率和准确率。
本发明还提供检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物在检测小麦抗叶锈病基因Lr13中的应用。
本发明提供的检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物可以特异性的扩增出分子标记HBAU-LrZH22中431bp的碱基序列，并且扩增产物可特异性的被限制性内切酶HindⅢ酶切成大小为297bp和134bp的DNA片段，实现了通过酶切片段的大小来直接判断小麦抗叶锈病基因Lr13的存在，免去大量基因序列测序费用。
本发明还提供检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物在鉴定小麦抗叶锈病性状中的应用。
本发明还提供检测所述小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物实现了在小麦幼苗期对其抗叶锈病性状的判断。
本发明还提供了一种检测检测小麦抗叶锈病基因Lr13的方法，该方法为：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用所述的引物进行PCR扩增，再用限制性内切酶HindⅢ对扩增产物进行酶切，根据酶切产物的大小判断小麦抗叶锈病基因Lr13的有无。
优选的，所述PCR扩增的条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
优选的，所述酶切的条件为：37℃、30min。
优选的，若所述酶切产物中具有297bp和134bp的DNA片段，则所述待测小麦具有小麦抗叶锈病基因Lr13，否则所述待测小麦不具有小麦抗叶锈病基因Lr13。
本发明还提供了一种检测检测小麦抗叶锈病基因Lr13的试剂盒，该试剂盒包括所述的引物和限制性内切酶HindⅢ。
优选的，所述试剂盒还包括DNA聚合酶、缓冲液和去离子水。
附图说明
图1是本发明实施例1中ZM和ZZ分别接种叶锈菌后的叶片表型图和叶片中叶锈菌孢子染色图，其中，a、不同温度下的叶片接种叶锈菌后的表型图；b、叶片接种叶锈菌后叶片中叶锈菌孢子染色图；
图2是本发明实施例1中分子标记HBAU-LrZH22的定位图谱；
图3是本发明实施例1中绘制的Lr13的遗传连锁图谱；
图4是本发明实施例3中通过实时荧光定量PCR检测得到的ZM和ZZ中的NLR的相对表达量柱形图；
图5是本发明实施例5中重组质粒pTCK303-Hyg-LrZH22/Lr13中NLR基因(LrZH22/Lr13)编码区和玉米Ubiquitin启动子的位置示意图；
图6是本发明实施例5中转基因T0代植株和T1代植株叶片的抗叶锈病表型图；
图7是本发明实施例6中携带有抗叶锈病基因Lr13和不携带抗叶锈病基因Lr13的小麦品种的PCR扩增及酶切产物凝胶图谱。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中，小麦苗期叶锈病抗性鉴定方法根据Stakeman创制的Roelfs等稍加修改的0-4级标准，其中0-2级代表抗病，3-4级代表感病。+/-代表比正常状态下孢子堆偏大或者偏小，病害等级表现较高或较低。X代表混合型。将0-4级反应型换化为0-9(“0”＝0，“；”＝1，“1”＝2，“1+”＝3，“2”＝4，“2+”＝5，“3-/3C/X”＝6，“3”＝7，“3+”＝8，“4”＝9)具体参考如下文献：
Roelfs A P,Singh R P,Saari E E.Rust diseases of wheat:concepts andmethods of disease management[M].CIMMYT,Mexico.1992.
抗叶锈病亲本Zhoumai 22(ZM)、感叶锈病亲本Zhengzhou 5389(ZZ)和叶锈菌生理小种FHDS。在下文中，抗叶锈病亲本Zhoumai 22简称ZM，感叶锈病亲本Zhengzhou 5389简称ZZ，叶锈菌生理小种FHDS为简称叶锈菌。
普通小麦品种Fielder为转基因受体材料。普通小麦品种Fielder为高感叶锈病的小麦品种。在下文中，普通小麦品种Fielder简称Fielder。
pTCK303质粒为构建过表达转基因载体的基础载体，由中科院遗传与发育所刘志勇教授课题组提供；采用限制性内切酶KpnⅠ和SpeⅠ进行双酶切，然后利用同源重组方法构建过表达转基因载体。
以下实施例中LrZH22/Lr13、LrZH22、Lr13和NLR均指同一基因。
实施例1
小麦抗叶锈病基因LrZH22/Lr13高密度遗传连锁图谱构建
1、以ZZ和ZM作为亲本进行杂交，得到杂交F1代。
2、采用小麦苗期叶锈病抗性鉴定方法检测周麦22(ZM)和郑州5389(ZZ)的叶锈病抗性；采用考马斯亮蓝染色方法检测ZM和ZZ的叶锈病抗性。
(考马斯亮蓝染色方法记载于如下文献中：李健强，刘西莉和王红梅(2002)荧光素钠和考马斯亮蓝应用于小麦白粉病菌染色效果比较.菌物系统，21(4):592-596)
检测结果见图1(A为在不同温度下的叶片接种叶锈菌反应，B为叶锈菌孢子染色)。结果表明，ZM均抗叶锈病，ZZ则高感叶锈病。
3、取杂交F1代播种于大田，通过自交方式，得到7213个F2分离群体。
4、采用小麦苗期叶锈病抗性鉴定方法检测来自于F2分离群体的F2:3家系的叶锈病抗性。
5、从F2:3家系中挑选100个家系(包括50个纯合抗病家系和50个纯合感病家系)，分别在苗期接种叶锈菌。接种后24h，将每个抗病家系采集等量叶片混合得到抗病混池，每个感病家系采集等量叶片混合得到感病混池，然后分别提取总RNA，构建转录组测序文库。
6、完成步骤5后，采用高通量测序平台Illumina HiSeq 2000分别对抗病混池和感病混池进行转录组双末端测序。测序原始数据采用小麦BSR-Seq基因定位技术进行分析。
7、通过参考中国春基因组序列和转录组数据分析结果开发了10个与LrZH22/Lr13紧密连锁的分子标记，见图2，所涉及的引物见表1中精细定位引物。
8、完成步骤7后，利用文献(Wang C.,Yin G.,Xia X.,et al.Molecular mappingof a new temperature-sensitive gene LrZH22 for leaf rust resistance inChinese wheat cultivar Zhoumai 22[J].Molecular Breeding,2016,36(2):1-10.)报道的与LrZH22/Lr13基因紧密连锁且位于基因两侧的SSR标记XBarc55和Xgwms374(引物序列见表1)筛选出7213个F2分离群体，鉴定出332份交换单株。
表1
9、采用新开发的10个与LrZH22/Lr13紧密连锁分子标记检测步骤8筛选得到的332个重要交换系。用Mapmaker 3.0计算分子标记与LrZH22基因的遗传距离。用Mapdraw V2.1软件绘制遗传连锁图谱。最终Lr13基因被定位在小麦2BS染色体上的遗传距离为0.15cM，物理距离约70kb间，并发现其中3个分子标记HBAU12、HBAU5和HBAU458与目标基因LrZH22共分离，如图2和图3所示。
实施例2
Lr13基因物理图谱构建
1、参考已发布的中国春基因组序列，依据抗病基因LrZH22构建的高密度遗传图，抗叶锈病基因LrZH22/Lr13最近的侧翼紧密连锁分子标记HBAU3和HBAU46分别在中国春2B染色体参考序列的157.68Mb至157.75Mb物理位置之间，同时采用URGI数据库中TriAnnotPipeline对这0.07Mb的序列进行基因功能注释，共预测出了2个候选基因。
2、将该区间的2个预测基因(TraesCS2B02G182700.1和TraesCS2B02G182800.1)的CDS序列在NCBI Non-redundant protein sequences(nr)数据库中进行功能注释，结果发现TraesCS2B02G182800.1是NBS-LRR类基因，而TraesCS2B02G182700.1为核糖核酸酶类基因(Ribonuclease)；NBS-LRR类基因为典型的抗病基因类型，预测该基因很可能为抗叶锈病基因LrZH22/Lr13的候选基因。
实施例3
NLR基因(NBS-LRR基因)的表达分析
以下所述的hpi(hour post inoculation)表示接种后的时间。
检测NLR基因的引物为表1中所示的BD1-L/R。检测Actin基因的引物为表1中所示的actin-1L/1R。
1、分别选取50粒正常的无机械损伤的抗病亲本周麦22和感病亲本郑州5389的种子播种于花盆中，放置于无菌光照培养箱中培养。光照培养箱设置为：光照培养16h，黑暗培养8h，环境温度设置为22℃。待10天左右，将繁菌好的叶锈菌FHDS病株用扫描法接菌到长至一叶一心的抗病亲本周麦22和感病亲本郑州5389的幼苗上。
2、分别于接种叶锈菌0hpi、6hpi、12hpi、18hpi、24hpi、36hpi、48hpi和72hpi共8个时间点，取抗病亲本周麦22和感病亲本郑州5389叶片3-5厘米，每个时间点设置三个生物学重复。然后分别提取RNA，反转录，得到cDNA。
3、分别以步骤2得到的cDNA为模板，实时荧光定量PCR实验是在RocheLightCycler 480定量PCR仪上进行。数据采用2-ΔΔCT法在Excel和GraphPad Prism 5软件中进行分析(Livak K J.,and Schmittgen T D.Analysis of relative gene expressiondata using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method.Methods,2001,25,402-408.)实时荧光定量PCR检测结果见图4所示。
结果表明：NLR基因在周麦22和郑州5389中的幼苗组织中均表达，且在受到叶锈菌生理小种FHDS诱导后，呈现上调表达。
实施例4
NLR基因的克隆
1、以抗病亲本周麦22接种叶锈菌生理小种FHDS 36hpi取其叶片提取总RNA，并反转录获得的第一链cDNA作为模板，根据RACES测序获得NLR基因全长序列，设计特异性引物Y194F/R，利用高保真酶进行PCR扩增，获得约3.3kb左右的产物进行胶回收。
2、以胶回收产物为模板，将其重组连接到pEASY-T1Cloning Vector载体，并转化到大肠杆菌中。在37℃恒温培养箱中，经过夜培养至长出菌落，然后挑取单克隆进行测序验证，获得正确的以NLR基因所在特异性克隆YH2.2菌液，将其菌液取出500μL加入等量的50％的甘油进行保菌；将其剩下的菌液提取质粒，全长NLR基因为3219bp的核苷酸序列。
NLR基因的编码区(3219bp)的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，其表达的NLR蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:5所示。
实施例5
NLR基因过表达T0和T1家系的获得与叶锈病抗性鉴定
一、重组质粒pTCK303-Lr13/LrZH22的构建
1、取pTCK303质粒，用限制性内切酶Kpn1和Spe1进行双酶切，回收约3400bp载体骨架。
2、以SEQIDNO:4所示的序列(cDNA)为模板，采用Y501F/R(见表1)进行PCR扩增，得到扩增产物。
3、利用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit(CU101-01)同源重组试剂盒将步骤2获得的PCR扩增产物和步骤1回收的载体骨架进行同源重组，得到重组质粒pTCK303-Hyg-LrZH22/Lr13。重组质粒pTCK303-Hyg-LrZH22/Lr13中，NLR基因由玉米的Ubiquitin启动子驱动，如图5所示。
二、重组农杆菌的获得
采用热激转化法，将重组质粒pTCK303-Hyg-LrZH22/Lr13导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pTCK303-Hyg-LrZH22/Lr13。
三、转NLR基因小麦的获得
采用农杆菌介导的遗传转化方法，将EHA105/pTCK303-Hyg-LrZH22/Lr13转化到感叶锈病的普通小麦材料Fielder中，得到12个T0代转基因家系，依次命名为OET0-1至OET0-12。
四、抗性鉴定和分子标记鉴定
将获得的12个T0代家系(OET0-1、OET0-2、OET0-3、OET0-4、OET0-5、OET0-6、OET0-7、OET0-8、OET0-9、OET0-10、OET0-11和OET0-12)培养于温室。然后对其中长势较好的7个转基因T0代植株进行苗期叶锈菌抗性鉴定。实验结果表明：抗病亲本周麦22抗叶锈病；转基因受体Fielder高感叶锈病；3个T0代和9个T1代转基因植株表现抗叶锈病，分子检测结果显示均是阳性，实验结果见表2和图6所示，其中，图6中，“+”表示阳性，即含有NLR基因，“-”表示阴性，即不含NLR基因。
表2转基因植株T0和T1代叶锈菌生理小种FHDS的表型
上述结果表明，NLR基因在普通六倍体小麦中具有良好的抗叶锈病功能，同时也证实NLR基因就是Lr13基因。
实施例6
小麦Lr13基因分子标记的开发和多态性检测
一、NLR基因与nlr基因的核苷酸序列比对
本发明的发明人从周麦22中扩增获得NLR基因，从郑州5389中扩增获得nlr基因。将NLR基因与nlr基因进行比对，结果发现NLR基因与nlr基因的编码区存在两个关键的单核苷酸多态性(SNPs)与抗病相关，对Lr13抗性等位基因具有特异性。其两个SNPs即c.T1308G和c.A1684C。
二、分子标记HBAU-LrZH22的开发
根据周麦22中的NLR基因和郑州5389中的nlr基因在起始密码子开始第1684位的差异A1684C开发CAPS标记HBAU-LrZH22，限制性内切酶为HindⅢ。扩增该分子标记HBAU-LrZH22的核苷酸序列如下所示：
引物F：5’-TGCACATGGATATGCGGAGA-3’(SEQIDNO:2)；
引物R：5’-GCTTTGAGTTGCCCATGCTC-3’(SEQIDNO:3)。
三、多态性检测
限制性内切酶HindⅢ为Takara公司的产品。
2×PCR Mix为北京擎科新业生物技术有限公司的产品。
10×Buffer为限制性内切酶HindⅢ中的组件。
选择5份抗和12份感叶锈菌FDHS的待测小麦材料。
1、采用植物DNA快速提取试剂盒提取待测小麦叶片的基因组DNA。
2、以小麦叶片的基因组DNA为模板，用引物F(SEQIDNO:2)和引物R(SEQIDNO:3)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
PCR反应体系(10μL)：待测小麦叶片的基因组DNA(25ng/μL)2μL、2×PCR Mix 5μL、引物F的水溶液(浓度为10μmol/L)1μL、引物R的水溶液(浓度为10μmol/L)1μL和ddH2O 1μL。
PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min。
3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶HindⅢ酶切，得到酶切产物；然后将酶切产物进行8％琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果进行如下判断：如果酶切产物为带型A(显示两条带，为297bp和134bp)，则待测小麦的基因型为基因型I(携带有抗叶锈病基因Lr13，对叶锈病表现一定的抗性)；如果酶切产物为带型B(只显示一条带，为431bp)，则待测小麦的基因型为基因型II(与感叶锈病的基因型且不携带有抗叶锈病基因Lr13)；其中，297bp和134bp的基因序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示，431bp的基因序列如SEQIDNO:1所示。
酶切体系(10μL)：PCR扩增产物5μL、限制性内切酶HindⅢ1μL、10×Buffer 1μL和ddH2O 3μL。
酶切反应条件：37℃30min。
实验结果见图7，周麦22的基因型为基因型I，郑州5389的基因型为基因型II。
上述结果表明，分子标记HBAU-LrZH22具有较高的多态性。
实施例7
利用扩增分子标记HBAU-LrZH22的引物F(SEQIDNO:2)和引物R(SEQIDNO:3)组成的引物对388份小麦材料和262份中国小麦核心种植进行功能标记鉴定。其中262份中国小麦核心种质由中国科学院遗传与发育生物学研究所刘志勇研究员馈赠，具体记载于如下文献中：Dong YC，Cao YS，Zhang XY，Liu SC，Wang LF，You GX，Pang BS，Li LH，Jia JZ(2003)Establishment of candidate core collections in Chinese common wheatgermplasm.Journal of Plant Genetic Resources，4(1):1-8.和Hao CY，Dong YC，WangLF，You GX，Zhang HN，Ge HM，Jia JZ，Zhang XY(2008)Genetic diversity andconstruction of core collection in Chinese wheat genetic resources.ChineseScience Bulletin，53(8):908-915。
1、在262份核心种植中含有8个品种含有抗病基因Lr13；在388份小麦材料中有23份材料含有抗病基因LrZH22/Lr13。
2、针对上述携带抗病基因Lr13的小麦材料也进行了苗期抗性鉴定，结果表明含有抗病基因Lr13的均表现为抗病，如表3所示。
表3
3、对分布于中国和部分国外的小麦品系的388份材料用于成株表型鉴定，对2015/2016、2016/2017和2017/2018年连续三年间在河北保定和河南周口进行了抗叶锈鉴定，对鉴定的叶锈病严重度(FDS)进行t(P<0.01)检测，其结果表明含有Lr13的23个小麦材料的最终严重度FDS的均值为5.5％，而不含有该基因的FDS平均为30.7％，携带有抗病基因Lr13的小麦材料表型严重度显著低于不携带抗病基因Lr13的最终叶锈表型严重度(FDS)，这表明含有抗叶锈病基因Lr13的小麦材料抗性明显抗于不携带有该基因的小麦材料。
综上结果所述，抗病基因Lr13及其功能标记HBAU-LrZH22和所涉及的引物对利用分子标记辅助选择培育小麦抗叶锈病品种和抗病基因Lr13的有效性。应用本发明提供的分子标记HBAU-LrZH22和对应的引物，能快速筛选出具有叶锈病抗性的小麦材料，从而加速小麦新品种的育成步伐，具有重要的理论意义和经济价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22，其特征在于：其具有如SEQ IDNO:1所示的核酸序列。
2.检测权利要求1所述的小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物，其特征在于：由上游引物SEQ ID NO:2和下游引物SEQ ID NO:3组成。
3.权利要求2所述的检测小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物在小麦抗叶锈病分子标记辅助选择育种中的应用。
4.权利要求2所述的检测小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物在检测小麦抗叶锈病基因Lr13中的应用。
5.权利要求2所述的检测小麦抗叶锈病基因Lr13的分子标记HBAU-LrZH22的引物在鉴定小麦抗叶锈病性状中的应用。
6.一种检测小麦抗叶锈病基因Lr13的方法，其特征在于：以待测小麦的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述的引物进行PCR扩增，再用限制性内切酶HindⅢ对扩增产物进行酶切，根据酶切产物的大小判断小麦抗叶锈病基因Lr13的有无。
7.如权利要求6所述的检测小麦抗叶锈病基因Lr13的方法，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃7min；和/或
所述酶切的条件为：37℃、30min。
8.如权利要求6所述的检测小麦抗叶锈病基因Lr13的方法，其特征在于：若所述酶切产物中具有297bp和134bp的DNA片段，则所述待测小麦具有小麦抗叶锈病基因Lr13，否则所述待测小麦不具有小麦抗叶锈病基因Lr13。
9.一种检测小麦抗叶锈病基因Lr13的试剂盒，其特征在于：包括权利要求2所述的引物和限制性内切酶HindⅢ。
10.如权利要求9所述的检测小麦抗叶锈病基因Lr13的试剂盒，其特征在于：其中还包括DNA聚合酶、缓冲液和去离子水。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CN114480709A (zh) * | 2022-01-30 | 2022-05-13 | 北京大学现代农业研究院 | 检测小麦抗叶锈病基因Lr47的分子标记、检测方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112813192B (zh) | 2022-10-11 |
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