CN112321694A

CN112321694A - 小麦抗叶锈病蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN112321694A
Application number: CN202011295096.0A
Authority: CN
Inventors: 李在峰; 闫晓翠; 李淼淼; 张培培; 殷贵鸿; 刘志勇; 刘大群
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-18
Also published as: CN112321694B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开一种小麦抗叶锈病蛋白及其编码基因和应用。所述小麦抗叶锈病蛋白其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列经缺失、替换或添加一个或多个氨基酸得到的具有提高小麦抗叶锈病功能的氨基酸序列，所述小麦抗叶锈病蛋白或编码其的基因可应用于调控或提高小麦抗叶锈病性能。本发明提供了小麦抗叶锈病蛋白，并具体公开了所述小麦抗叶锈病蛋白的氨基酸序列，在小麦中提高该小麦抗叶锈病蛋白的表达量能够显著提高小麦对叶锈病的抵抗能力，其对于小麦抗叶锈病育种具有重大的应用推广价值。

Description

小麦抗叶锈病蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小麦抗叶锈病蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

小麦是世界范围内最重要的粮食作物之一，也是主要的食物来源。然而，几千年来小麦锈菌一直威胁着小麦生产，成为小麦生产的主要病害。小麦锈菌分为小麦叶锈菌(Puccinia triticinia)、小麦秆锈菌(P.graminis f.sp.tritici)和小麦条锈菌(P.striiformis f.sp.tritici)。其中由小麦叶锈菌引起的小麦叶锈病较为常见，在世界范围内发生最为广泛，是危害小麦产量的重要因素之一，病害严重流行年份可使小麦减产40％以上，甚至绝收。小麦叶锈病主要发生在长江流域、黄淮流域、华北麦区和东北麦区等，1969年、1973年、1975年和1979年该病害的大面积流行给我国小麦产量造成了严重损失。近几年，华北及黄淮麦区频频发生，尤其是2012年和2015年，小麦叶锈病在我国大部分小麦产区传播，造成了小麦生产的巨大损失。随着全球气候变暖，未来可能会加剧小麦叶锈病的发生和流行，选育和利用抗病品种是控制小麦叶锈病最经济、有效且对环境安全的防控措施。

目前，由于长期大面积种植具有单一或少数基因的抗病品种，对病原菌产生了选择压力。病原菌为了适应这种压力，通过无毒基因或其调控基因的变异，进化出了对这些品种致病的菌株，导致抗病品种抗性被克服。目前国内外已正式命名了79个抗叶锈病基因，这些基因多数为小种专化抗病基因，其随小种的毒性变异容易丧失抗性。在我国，目前只有少数抗病基因属于有效的抗锈病基因。为了控制小麦锈病，一方面需要加快抗病基因的挖掘，培育具有持久抗性品种的培育，另一方面需要利用已有的抗性资源，对含有不同抗病基因的品种进行轮换和布局，尽可能使病原菌群体毒性变异趋于稳定，以延长品种使用年限。因此定位和克隆小麦抗锈病基因并开发其功能标记，可以加速抗病品种的培育，同时为研究小麦抗病基因和锈菌无毒基因互作的分子机理奠定基础。

发明内容

针对现有小麦抗小麦叶锈菌的品种单一，在病菌长期变异过程中，其抗性容易被克服，且目前的抗叶锈病基因多数为小种专化抗病基因，其随小种的毒性变异容易丧失抗性的问题，本发明提供一种小麦抗叶锈病蛋白及其编码基因和应用。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

小麦抗叶锈病蛋白，其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ IDNO:1所述的氨基酸序列经缺失、替换或添加一个或多个氨基酸得到的具有提高小麦抗叶锈病功能的氨基酸序列。

相对于现有技术，本发明提供了一种小麦抗叶锈病蛋白，并具体公开了所述小麦抗叶锈病蛋白的氨基酸序列，在小麦中提高该小麦抗叶锈病蛋白的表达量能够显著提高小麦对叶锈病的抵抗能力，其对于小麦抗叶锈病育种具有重大的应用推广价值。

优选的，所述小麦抗叶锈病蛋白为在SEQ ID NO:1序列的N端或/和C端连接蛋白标签。

优选的，所述蛋白标签为序列为SEQ ID NO:2的Poly-Arg、序列为SEQ ID NO:3的Poly-His、序列为SEQ ID NO:4的FLAG、序列为SEQ ID NO:5的Strep-tag II、序列为SEQ IDNO:6的c-myc和序列为SEQ ID NO:7的HA中的任意一种。

本发明还提供编码所述小麦抗叶锈病蛋白的核酸分子。

本发明还提供包含所述核酸分子及其表达调控原件的重组表达载体，所述重组表达载体具体可为在现有植物表达载体中插入所述核酸分子得到的重组质粒。其中现有植物表达载体具体可为pTCK303载体。

本发明还提供包含所述核酸分子并进行表达的宿主细胞。

本发明还提供所述小麦抗叶锈病蛋白在调控或提高小麦抗叶锈病性能中的应用。

本发明还提供编码所述小麦抗叶锈病蛋白的核酸分子在抗叶锈病小麦品种遗传育种中的应用。

本发明还提供一种用于扩增编码得到所述小麦抗叶锈病蛋白的基因的引物，其上游引物为HBAU194F：5′-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGCCATGATCTTACCAGCC-3′；

下游引物为HBAU194R：5′-ATTCGAGCTCTCTAGAACTAGTTTAATCAGCCCGTGGCCAC-3′。

本发明提供的扩增编码所述小麦抗叶锈病蛋白的基因的引物可以特异性的扩增并准确得到编码小麦抗叶锈病蛋白的基因序列。

本发明还提供一种用于鉴定编码所述小麦抗叶锈病蛋白的基因的引物，其上游引物为BD1-L：5′-TCGTACACTGCATCCTTGATCT-3′；下游引物为BD1-R：5′-AGGCTGAAGACTCGTATTTGGA-3′。

本发明提供的用于鉴定编码所述小麦抗叶锈病蛋白的基因的引物可以特异性的结合到编码小麦抗叶锈病蛋白的基因上，准确检测出编码小麦抗叶锈病蛋白的基因，特异性较强；且上述引物的灵敏度高，检测准确率为100％。

附图说明

图1是本发明实施例中编码小麦抗叶锈病蛋白的基因在小麦品种周麦22(ZM)上接种叶锈菌后不同时间点的表达量柱形图；

图2是本发明实施例中转基因植株在T₀代的抗叶锈病表型图，其中，“+”表示阳性，即含有Lr13基因，“-”表示阴性，即不含Lr13基因；

图3是本发明实施例中T₁代转基因植株的抗叶锈病表型图，其中，“+”表示阳性，即含有Lr13基因，“-”表示阴性，即不含Lr13基因。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1、材料

普通小麦品种周麦22(ZM)：高抗叶锈病的中国小麦地方品种；

小麦品种郑州5389(ZZ)：为高感叶锈病品种；

小麦品种Fielder：为叶锈病感病材料品种；

叶锈病致病真菌：叶锈病菌(Puccinia triticinia)，FHDS生理小种。

2、小麦抗叶锈病的分级标准

根据表型，植株的叶锈病抗病性侵染型采用0-4级的分级标准。“0”为免疫，“；”为近免疫，“1”为高度抗病，“2”为中度抗病，“3”为中度感病，“4”为高度感病。按大分类来说，0-2为抗病，3-4为感病。各个分级标准相应的表型见表1。

表1

3、蛋白及其编码基因序列的获得

课题组先期在周麦22中定位了一个苗期温敏抗叶锈病新基因LrZH22，距离两侧最近的SSR标记为Xbarc55 and Xgwm374，距离LrZH22分别为2.4cM和4.8cM。进一步利用标记检测7213个周麦22/郑州5389的F_2:3家系，获得332个重组家系。结合重组体的表型数据并利用中国春参考序列及混池转录组测序(BSR-Seq)方法设计特异标记引物对LrZH22进行精细定位，构建了LrZH22所在区域的精细遗传连锁图谱，将LrZH22定位到约70kb的物理区段。该区间有2个注释基因，其中1个是典型的与抗病相关的NBS-LRR蛋白。同时选取抗病亲本周麦22和8个纯感EMS突变家系进行MutRenSeq，结果将抗病基因LrZH22成功定位在2BS的特定物理区间，该结果与精细定位的NBS-LRR类抗病基因结果一致。利用诺唯赞高保真DNA聚合酶，通过PCR扩增普通小麦品种周麦22及小麦感病品种郑州5389的候选蛋白基因序列，其表达的蛋白序列如SEQ ID NO:1所示，将该蛋白命名为Lr13蛋白。周麦22的cDNA中编码Lr13蛋白的开放阅读框如SEQ ID NO:8所示。周麦22的基因组DNA中，编码Lr13蛋白的基因序列如SEQID NO:9所示(具有4个外显子)。

4、Lr13基因在不同接种时间的表达分析

供试植株为普通小麦周麦22(ZM)植株。将供试植株培养至一叶一心期，然后接种叶锈菌生理小种FHDS。在恒定温度22度条件下，分别于接种0h、6h、12h、24h、36h、48h和72h后，取植株的第一片叶片，检测Lr13基因的相对表达水平。

接种方式：将感染叶锈病致病菌并充分发病的感病小麦材料郑州5389(ZZ)植株在供试植株上方采用人工扫抹法进行接菌。

检测Lr13基因的相对表达水平的方法：提取供试植株叶片的总RNA，以Actin基因为内参基因，通过qRT-PCR检测Lr13基因的相对表达水平。

用于鉴定Lr13基因表达量的引物如下：

BD1-L(SEQ ID NO:10)：5′-TCGTACACTGCATCCTTGATCT-3′；

BD1-R(SEQ ID NO:11)：5′-AGGCTGAAGACTCGTATTTGGA-3′。

检测结果如图1所示，Lr13基因的表达受到叶锈致病菌的诱导，接种叶锈菌6h和36h表达量达到最高。

4、转基因验证Lr13蛋白功能

4.1、构建重组质粒

(1)取小麦周麦22的叶片，提取总RNA。

(2)将步骤(1)得到的RNA进行反转录，获得cDNA，以该cDNA作为模板，通过设计特异性引物HBAU194F(SEQ ID NO:12)和HBAU194R(SEQ ID NO:13)，用高保真DNA聚合酶对Lr13的全长基因编码区进行扩增，回收PCR扩增产物。

HBAU194F：5′-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGCCATGATCTTACCAGCC-3′；

HBAU194R：5′-ATTCGAGCTCTCTAGAACTAGTTTAATCAGCCCGTGGCCAC-3′。

(3)用限制性内切酶KpnI和SpeI分别对步骤(2)回收的PCR扩增产物和pTCK303载体进行双酶切，回收酶切后的PCR扩增产物以及载体骨架。

(4)将酶切后的PCR扩增产物以及载体骨架用pEASY-Uni Seamless Cloning andAssembly Kit(CU101-01)同源重组试剂盒进行重组，得到重组质粒。该重组质粒转化大肠杆菌后，挑选阳性克隆进行测序，结果表明，Lr13基因的CDS片段正确连接到pTPCK303-Hyg载体上，说明成功构建了Lr13的过表达载体pTPCK303-Hyg-Lr13。

4.2、构建转基因植株

(1)将4.1中得到的重组质粒pTPCK303-Hyg-Lr13导入农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌。

(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对小麦Fielder的胚性愈伤组织进行遗传转化，培养获得植株，即为T₀代植株。

(3)T₀代植株自交获得籽粒，将籽粒培育为植株，即为T₁代植株。

(4)从T₁代植株中筛选转基因植株。

筛选转基因植株的方法：提取植株叶片的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用22-5OE-1L/R引物对进行PCR扩增来验证转基因植株。

22-5OE-1L(SEQ ID NO:16)：5′-CTTCTGCAGGTCGACTCTAG-3′；

22-5OE-1R(SEQ ID NO:17)：5′-TAATTATTGGGCTCATCACAGTC-3′。

具体验证方法为：

(1)取转基因T₀和T1代小麦材料的叶片，提取DNA。

(2)分别以其DNA作为模板，通过设计的特异性引物22-5OE-1L/R，用高保真DNA聚合酶对转基因后代植株进行扩增，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。如果得到的PCR扩增产物中含有约518bp的DNA片段，则该小麦含有Lr13基因；否则该小麦不含有Lr13基因。4.3、制备转空载体植株

用pTCK303空载体代替重组质粒pTPCK303-Hyg-Lr13，参照4.2中的步骤(1)-(2)进行操作，得到转空载体植株。

4.4、Lr13蛋白的叶锈病抗病性鉴定

在4.2中的第一批转基因植株中，获得7棵T₀代转基因植株，在其长至一叶一心时对其接菌叶锈生理小种FHDS，当充分发病后(10天后)，进行表型鉴定和PCR表达检测。发现3株阳性转基因苗与抗病材料周麦22表现抗性，参见图2，其中3株阳性转基因苗分别为T₀-1、T₀-2和T₀-3，并分别获得相应T₁代种子，同样对其进行接菌表型鉴定。

T₁代转基因植株与周麦22植株表型一致，表现出明显的叶锈病抗病性，如图3所示。转空载体的植株和小麦Fielder植株表型一致，表型出明显的叶锈病感病性。T₀-1、T₀-2和T₀-3的抗病等级均为2级。周麦22的抗病等级为1或2级。转空载体植株和小麦Fielder植株的抗病等级均为4级。

对T₀-1、T₀-2和T₀-3和其获得的T₁代植株的基因组DNA用22-5OE-1L/R引物进行PCR扩增验证，PCR扩增产物中含有518bp的DNA片段，而空载体植株和小麦Fielder的基因组的PCR扩增产物中未扩增得到518bp的DNA片段。即T₀-1、T₀-2和T₀-3和其获得的T₁代小麦中均含有Lr13基因，与该小麦表现出的抗叶锈病表型相一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种小麦抗叶锈病蛋白及其编码基因和应用

<130> 2020

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1072

<212> PRT

<213> Lr13氨基酸序列

<400> 1

Met Ala Met Ile Leu Pro Ala Leu Pro Val Ala Val Glu Val Ile Ser

1 5 10 15

Ser Val Asn Ala Leu Asn Glu Phe Val Gly Trp Ala Thr Pro His Met

20 25 30

Lys Ala Ala Ile Arg Tyr Ala Arg Asn Ile Pro Arg Ser Pro Asp Glu

35 40 45

Glu Asn Thr Ala Ala Gln Arg Gln Ile Gln Glu Lys Ile Glu Gln Leu

50 55 60

Gly Asp Lys Leu Gly Arg Leu Lys Thr Arg Ile Trp Lys Leu Lys Thr

65 70 75 80

Thr Met Pro Lys Met Leu Asp Leu Ile Asp Arg Val Glu Trp Gln Ser

85 90 95

His Lys Glu Gln Ala Thr Val Leu Leu Pro Glu Ile Lys Asp Ala Val

100 105 110

Tyr Asp Ala Glu Asp Leu Leu Asp Glu Phe Asp Tyr Tyr Ala Leu Lys

115 120 125

Leu Lys Val Glu Cys Asn Lys Asn Leu Gly Gln Asp His Leu His Asn

130 135 140

Ala Phe Met Glu Phe Leu Asn Thr Ile Asp Cys Asp Glu Pro Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Thr Thr Lys Val Asn Asp Ile Gln Glu Arg Leu Asp His Leu Asn

165 170 175

Gln Gln Ser Lys Asp Met Gly Leu His Lys Ala Glu Leu Arg Phe Asp

180 185 190

Lys Ser Val Arg Pro Glu Thr Ser Ser Phe Val Asn Glu Thr Lys Ile

195 200 205

Phe Gly Arg Lys Lys Glu Leu Lys Ser Leu Met Glu Lys Leu Gly Val

210 215 220

Lys Ile Pro Val Lys Ser Thr Gly Lys Arg Lys Leu Ala Glu Gly Ser

225 230 235 240

Ala Arg Met Glu Glu Leu Pro Val Leu Pro Ile Gly Asn Ala Arg Met

245 250 255

Thr Glu Leu Ser Val Leu Pro Ile Val Gly Met Gly Gly Met Gly Lys

260 265 270

Thr Thr Met Ala Gln Gln Ile Cys Ser Asp Ser Lys Val Lys Lys His

275 280 285

Phe Asp Leu Ile Ile Trp Thr Cys Ala Ser Asp Asp Phe Asp Lys Lys

290 295 300

Arg Leu Thr Lys Glu Ile Leu Glu His Leu Gly Gln Asp Thr Ser Ser

305 310 315 320

Asn Asn Leu Asn Phe Leu Met Thr Lys Leu Gln Asp Cys Val Arg Ser

325 330 335

Lys Lys Phe Leu Leu Val Val Asp Asp Ile Trp Asp Gly Ile Leu Lys

340 345 350

Asp Asp Gly Ala Gly Trp Arg Glu Phe Cys Ala Pro Leu Gln Asn Gly

355 360 365

Ser Glu Gly Ser Arg Ile Leu Val Thr Thr Arg Phe Ala Glu Val Ala

370 375 380

Lys Val Ile Ser Pro Thr Tyr His Tyr Glu Leu Pro Cys Leu Lys Gly

385 390 395 400

Asp Val Phe Trp Lys Phe Phe Lys Leu Cys Ala Phe Gly Ser Thr Ser

405 410 415

Ser Val Asp Asn Arg Glu Ser Leu Glu Cys Ile Gly Lys Asn Ile Leu

420 425 430

Pro Lys Leu Lys Gly Asn Pro Leu Ala Ala Lys Thr Ile Gly Arg Leu

435 440 445

Leu Arg Met Asp Leu Ser Thr Thr His Trp Glu Asn Ile Met Glu Ser

450 455 460

Glu Leu Trp Gln Val Glu Gln Thr Glu Asn Asp Ile Leu Pro Ala Leu

465 470 475 480

Arg Leu Ser Tyr Met Tyr Leu Pro Gln Asn Leu Lys Arg Cys Phe Ser

485 490 495

Ile Cys Ala Met Tyr Pro Lys Asp His Lys Phe Glu Met Arg Phe Leu

500 505 510

Ala Asp Ile Trp Thr Ala His Gly Tyr Ala Glu Asn Pro Gln Lys Ala

515 520 525

Ser Leu Tyr Phe Asn Ala Leu Ala Asn Arg Ser Phe Phe Gln Lys Ala

530 535 540

Ser Thr Tyr Ser Ser Met Tyr Val Ile His Asp Leu Met His Asp Thr

545 550 555 560

Ala Lys Leu Val Ser Lys Asp Glu Cys Phe Ile Ile Lys His Pro Arg

565 570 575

Asp Ile Asp Arg Val Pro Ser Thr Val Arg His Leu Ser Ile Phe Gly

580 585 590

Asn Gly Asp Ile Asp Cys Ser Glu Leu Lys Lys Ile Cys Asn Ser Lys

595 600 605

Lys Ile Arg Thr Leu Val Cys Asp Asp Lys Phe Asn Ser Gly Ala Asp

610 615 620

Phe Ala Gly Val Ile Asp Ser Trp Phe Lys Glu Leu Leu Lys Ile Arg

625 630 635 640

Val Leu Lys Phe Arg Val Gly Lys Val Arg Lys Leu Pro Glu Ser Met

645 650 655

Gly Asn Ser Lys His Leu Arg Tyr Phe Cys Leu Leu Gly Pro Ser Asn

660 665 670

Phe Gly Thr Leu Pro Ser Thr Val Cys Arg Leu His Lys Leu Arg Ile

675 680 685

Ile Glu Arg Ala Gly Gly Val Ile Lys Arg Phe Pro Thr Gly Phe Ser

690 695 700

Asp Leu Ile Ser Leu Gln Arg Ile Asn Ser Lys Gly Phe Thr Tyr Asp

705 710 715 720

Arg Asp Gln Ser Asp Lys Leu Cys Leu Glu Trp Ser Phe Glu Val Gly

725 730 735

Ala Pro Ser Ser Glu Thr Val Arg Met Met Glu Asn Gln Met Glu Glu

740 745 750

Leu Pro His Trp Asn Ile Gln His Leu His Val Glu Asn Tyr Glu Gly

755 760 765

Glu Ser Cys Pro Ser Trp Leu Lys Pro Asn Leu Leu Pro Gly Leu Arg

770 775 780

Ser Leu Lys Phe Arg Arg Cys Gly Lys Ile Lys Ser Ile Pro Phe Phe

785 790 795 800

Val Pro Ser Glu Glu Ser Arg Asp Asn Ala Gln Gly Pro Asp Asn Leu

805 810 815

Asn Arg Leu Glu Glu Leu Val Val Asp Ala Cys Tyr Glu Ile Asn Trp

820 825 830

Gln Gly Ser Ile Val Leu Pro Thr Ser Leu Arg Lys Leu Thr Leu Ser

835 840 845

Ala Ser Gly Cys Ser Met Asp Asn Leu Val Ser Cys Phe Arg Asp Leu

850 855 860

Thr Ser Leu Thr His Met Glu Ile Arg Phe Gly Arg Ser Leu Thr Ser

865 870 875 880

Ile Pro Leu Asp Val Trp Ser Ser Asn Leu Pro Ser Leu Glu Asp Leu

885 890 895

Ser Ile Met Asp Cys Tyr Arg Leu Ala Ser Ile Ser Ala Ser Gly Ala

900 905 910

Ser Ser Ser Ser Gly Val Lys Gly Phe Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu

915 920 925

Phe Tyr Glu Cys Gly Ala Leu Leu Ser Leu Asp Glu Leu Leu Thr Pro

930 935 940

Asp Tyr Leu Pro Ala Val Lys Thr Ile Ser Val Thr His Cys Glu Ala

945 950 955 960

Leu Ala Ser Val Ser Val Asp Arg Leu His Gly Leu Glu Asn Leu Glu

965 970 975

Ile Gly Arg Cys His Asn Cys Arg Ile Leu Ser Val Pro Ser Ser Leu

980 985 990

Lys Gln Leu Asp Leu Tyr Ser Ser Asp Gly Ile Glu Phe Ile Asp Leu

995 1000 1005

Ser Asn Ser Gln Ser Arg Ser Ser Ser Ala Leu Lys Val Leu Ser

1010 1015 1020

Ile Thr Gly Cys Pro Ser Leu Arg Ser Ile Gly Gly Glu Ala Ala

1025 1030 1035

Ile Ala Glu Ile Met Asn Val Gly Ile Thr Gly Cys Pro Asn Leu

1040 1045 1050

Thr Glu Ile Gln Gln Pro Leu Glu Arg Gly Thr Gly Arg Trp Trp

1055 1060 1065

Pro Arg Ala Asp

1070

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> Poly-Arg

<400> 2

Arg Arg Arg Arg Arg

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> Poly-His

<400> 3

His His His His His His

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> FLAG

<400> 4

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> Strep-tag II

<400> 5

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> c-myc

<400> 6

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> HA

<400> 7

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 8

<211> 3219

<212> DNA

<213> Lr13编码区序列

<400> 8

atggccatga tcttaccagc ccttcctgta gctgttgagg taatttccag tgtcaatgca 60

ttgaacgaat tcgtcggctg ggcgacacca cacatgaaag cggccatacg ttatgcacgg 120

aacattccac ggtcaccaga tgaagagaac acagctgcac aacgccagat tcaagagaaa 180

attgagcagc taggcgataa gcttgggagg ctgaagactc gtatttggaa gctgaagaca 240

actatgccca agatgcttga cctcattgac agggttgagt ggcaaagcca caaggaacaa 300

gccactgttc tactcccgga gatcaaggat gcagtgtacg atgcagagga tctgcttgat 360

gagtttgatt attatgcgct caagttgaag gttgagtgca acaaaaattt ggggcaagat 420

cacttgcata atgccttcat ggaattctta aacactatag actgtgatga gcccaataat 480

tacaccacga aagtcaatga tattcaagaa agactagatc atctgaatca acagtccaaa 540

gatatgggct tgcacaaagc agagctgagg tttgataaat cagttaggcc agaaacgagt 600

tctttcgtta atgagacaaa aatatttggt cgtaaaaaag aattgaaatc tttgatggag 660

aagctgggag ttaaaattcc agttaaaagt acagggaaga gaaaattggc cgaaggtagt 720

gcaagaatgg aagaattacc tgtgttgcca ataggtaatg caagaatgac agaattgtct 780

gtgttgccaa tagtcggcat gggaggtatg ggaaagacaa caatggctca acaaatctgc 840

agtgattcaa aggtgaagaa gcactttgat ctcataattt ggacatgtgc ttcagatgat 900

tttgacaaaa aaagattaac caaagagatt ctagaacacc tgggacaaga tacatcatcc 960

aataacctga attttcttat gacaaaacta caagattgtg tcaggtccaa aaagttctta 1020

cttgttgttg atgacatttg ggatggtatc ttgaaggatg atggggcggg atggagggag 1080

ttttgtgcac ctctgcaaaa tggttctgaa ggaagtagga ttttggtcac tactagattt 1140

gccgaggttg ctaaagtaat tagccccacg tatcactatg agttaccttg cttaaaaggt 1200

gacgtattct ggaagttctt caaattatgt gcatttggat ccacgagttc tgtcgacaac 1260

cgtgagtcac tagagtgcat tgggaagaat atacttccaa agttgaaggg caacccattg 1320

gctgccaaga ctattggacg tttgttgagg atggacctaa gtacaacaca ttgggaaaat 1380

ataatggaaa gtgaactctg gcaagtagaa caaacggaga atgacatttt gccggccctt 1440

cgactgagct atatgtacct tcctcagaac ctgaaaagat gcttctcaat ctgtgcaatg 1500

tatcccaagg atcacaaatt tgagatgcgt tttttagctg atatttggac tgcacatgga 1560

tatgcggaga atccccaaaa agcatcactc tactttaatg cccttgcaaa tcggtcattc 1620

tttcagaaag catctacata cagttctatg tatgtaattc atgatctgat gcatgatacg 1680

gcaaagcttg tctcaaagga tgagtgcttc atcataaagc atccgcgtga catagataga 1740

gtcccttcaa ctgtccgtca tctgtcaata tttggaaacg gagatattga ttgttctgaa 1800

ctgaagaaaa tatgtaacag caaaaaaata aggaccctgg tatgtgatga taaatttaac 1860

agcggagcag attttgctgg cgtgattgac tcttggttca aggaactgtt gaaaatccgt 1920

gtactgaagt ttagagttgg caaagtaagg aagttacccg agagcatggg caactcaaag 1980

catctgcgtt acttttgttt actggggcct tccaacttcg gcaccctacc ttcaacggtt 2040

tgtcgtctgc ataagctcag aattatagag cgtgccggtg gtgtcattaa aaggtttccg 2100

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gtatcgttct ccctcatggg ggcatcgtct tggagcaagt gctggttgga ggggacaaga 26700

ggaggagcgg tgatttatct ggtccattga tgacgacgga cctcggcggc atggcgcagt 26760

ggagacccgg cgcctgatgt gcggagatgg actcgcgcag gagggtgacg ctgcctggcg 26820

tcgtggtggc gtcggcggca gctagaccgg gcaaggttga tgcagcagta cagctctgaa 26880

gatggattgg tggcaggtgg ctgcggcggc ctcatacccg gcaggcgtcc tggttgagaa 26940

gcacgccgga ctaatgggtg cccacaccag gcaggcgtcc tggttgggac ctcaagtctt 27000

agatgttagg tttggctgca aggtctattt ggtattaggc ccagactttc agcgccccta 27060

catcaactgg atagggatag cgatagatgt tgcttagttg gtggctttag gcttattgtt 27120

gtatgactct gtaaggtctt gtgtcaataa ttaataaaat agccgtatgc attgtccaga 27180

tgcagaggcc gggggtcgtc ctccttttct aaaaaaaaaa tcaaagaacg acctatacct 27240

aacaaaacca gatcaggtac caaaagtgtc agtaccatat taatcactgg tgttattaat 27300

tccaaaatct gggcgtgtaa tttcaaacag aacatgatac acactgactg aaagaatcag 27360

atcacttaca tcaaaatcct atctacaggt tgaaagaaca tataagctta gaagatctgc 27420

ttttcaaaag aggaaaaatc agccaacaca tgtcctgcaa gcaacaatgt gcaagtgtat 27480

aacacataca tacatggcaa acttgtaaca atttggggaa tgaagtatca ttttttcacc 27540

ccctatttat ttgtggagca aacatcaact ctcatttcca taagaagaaa gcaacaaat 27599

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> BD1-L

<400> 10

tcgtacactg catccttgat ct 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> BD1-R

<400> 11

aggctgaaga ctcgtatttg ga 22

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> HBAU194F

<400> 12

tctagaggat ccccgggtac catggccatg atcttaccag cc 42

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> HBAU194R

<400> 13

attcgagctc tctagaacta gtttaatcag cccgtggcca c 41

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 22-5OE-1L

<400> 14

cttctgcagg tcgactctag 20

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 22-5OE-1R

<400> 15

taattattgg gctcatcaca gtc 23

Claims

1.小麦抗叶锈病蛋白，其特征在于：其具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者具有如SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列经缺失、替换或添加一个或多个氨基酸得到的具有提高小麦抗叶锈病功能的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的小麦抗叶锈病蛋白，其特征在于：所述小麦抗叶锈病蛋白为在SEQ ID NO:1序列的N端或/和C端连接蛋白标签。

3.如权利要求2所述的小麦抗叶锈病蛋白，其特征在于：所述蛋白标签为序列为SEQ IDNO:2的Poly-Arg、序列为SEQ ID NO:3的Poly-His、序列为SEQ ID NO:4的FLAG、序列为SEQID NO:5的Strep-tag II、序列为SEQ ID NO:6的c-myc和序列为SEQ ID NO:7的HA中的任意一种。

4.编码权利要求1-3任一项所述的小麦抗叶锈病蛋白的核酸分子。

5.包含权利要求4所述的核酸分子及其表达调控原件的重组表达载体。

6.包含权利要求4所述的核酸分子并进行表达的宿主细胞。

7.权利要求1-3任一项所述的小麦抗叶锈病蛋白在调控或提高小麦抗叶锈病性能中的应用。

8.权利要求4所述的编码所述小麦抗叶锈病蛋白的核酸分子在抗叶锈病小麦品种遗传育种中的应用。

9.一种用于扩增得到编码权利要求1-3任一项所述的小麦抗叶锈病蛋白的基因的引物，其特征在于：其上游引物为HBAU194F：5′-TCTAGAGGATCCCCGGGTACCATGGCCATGATCTTACCAGCC-3′；下游引物为HBAU194R：5′-ATTCGAGCTCTCTAGAACTAGTTTAATCAGCCCGTGGCCAC-3′。

10.一种用于鉴定编码权利要求1-3任一项所述的小麦抗叶锈病蛋白的基因的引物，其特征在于：其上游引物为BD1-L：5′-TCGTACACTGCATCCTTGATCT-3′；下游引物为BD1-R：5′-AGGCTGAAGACTCGTATTTGGA-3′。