KR20150026633A - 아열대지역에서 발생하는 벼 바이러스병 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멸구류에 의해 매개되는 아열대지역에서 주로 발생되는 벼 바이러스인 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스, 벼 그라시 스턴트 바이러스, 벼 래기드 스턴트 바이러스 또는 벼 퉁그로 구형 바이러스에 특이적인 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트들을 포함하는 멸구류에 의해 매개되는 아열대성 벼 바이러스병의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼 또는 매개 곤충으로부터 분리된 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 아열대성 벼 바이러스병의 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 멸구류에 의해 매개되는 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 바이러스 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 진단 방법은 벼에 발생하는 아열대성 바이러스를 특이적으로, 그리고 개별적으로 또는 동시에 진단할 수 있는 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 진단용 프라이머 및 이를 이용한 진단 방법은 멸구류 매개 아열대지역에서 발생하는 바이러스 이병주의 진단이 가능하며, 이로써 지구 온난화에 따라 발생이 우려되는 상기 벼 바이러스 병의 종합 관리체계 확립 및 우량종자 확보에 기여할 수 있다.
Description
본 발명은 아열대지역에서 주로 발생되는 벼 바이러스인 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스, 벼 그라시 스턴트 바이러스, 벼 래기드 스턴트 바이러스 또는 벼 퉁그로 구형 바이러스에 특이적인 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트들을 포함하는 멸구류에 의해 매개되는 아열대성 벼 바이러스병의 진단용 조성물, 진단용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 벼 또는 매개 곤충으로부터 분리된 RNA를 주형으로 RT-PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 아열대성 벼 바이러스병의 진단 방법에 관한 것이다.
벼(Oryza sativa L.)는 세계 인구의 반 이상에게 중요한 식량 자원이며, 가장 많이 이용되는 곡물 중 하나이다. 따라서 바이러스 감염에 의해 상기 작물에 발생하는 바이러스병은 대규모의 고사로 연결될 수 있어 심한 경우 재배농가에는 수확량의 급감으로 인한 수입 감소를 유발하는 한편, 소비자에게는 수요와 공급의 불균형으로 인한 공급가의 급상승을 초래하여 막대한 경제적 혼동을 수반할 수 있다.
아직 국내에서는 발생이 없으나 아열대 지역에서는 벼농사에 막대한 피해를 입히는 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스, 벼 그라시 스턴트 바이러스, 벼 래기드 스턴트 바이러스 또는 벼 퉁그로 구형 바이러스 등의 바이러스에 의한 벼 바이러스병이 알려져 있으며, 이들 아열대지역에 발생하는 벼 바이러스병은 대부분이 멸구류에 의해 매개되는 것으로 조사되었다. 지구 온난화 현상으로 인한 바이러스 매개충의 월동조건이 호전되고 멸구류의 서식조건이 양호해져 바이러스병의 발병 위험이 점점 증가되고 있으며, 따라서, 이들 아열대성 벼 바이러스병의 발생이 우려된다. 또한, 벼멸구 보독충이 벼를 가해하면 20일 안에 생육억제, 황화 및 고사되는 등 피해가 막대한 병해로 알려져 있다.
근본적으로 바이러스병에 대한 저항성 품종을 개발하는 것이 방제를 위한 하나의 방법이라 할 수 있다. 한편 상기 바이러스병들은 매개곤충에 의해 전염되는 것들로 자체에 대한 약물방제가 불가능하므로, 매개곤충에 대한 약제 방제를 실시하거나, 감염이 확인되면 병든 포기를 즉시 제거하는 방법을 고려할 수 있다. 따라서, 매개곤충의 보독여부 및 재배 중인 포기의 감염여부를 진단할 수 있는 방법이 요구된다.
이에 본 발명자들은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스, 벼 그라시 스턴트 바이러스, 벼 래기드 스턴트 바이러스 또는 벼 퉁그로 구형 바이러스에 의한 아열대성 벼 바이러스병을 진단할 수 있는 방법을 예의 연구 노력한 결과 상기 아열대성 벼 바이러스병에 대한 특이적인 프라이머 세트를 발굴하여 이를 이용함으로써 단일 스텝의 RT-PCR 과정을 통해 상기 아열대성 벼 바이러스병의 감염 여부를 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스(southern rice black streaked dwarf virus; SRBSDV)에 특이적인 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 벼 그라시 스턴트 바이러스(rice grassy stunt virus; RGSV)에 특이적인 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 벼 래기드 스턴트 바이러스(rice ragged stunt virus; RRSV)에 특이적인 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트, 벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus; RTSV)에 특이적인 서열번호 7과 8 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 아열대성 벼 바이러스병 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 아열대성 벼 바이러스병의 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 아열대성 벼 바이러스병 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 벼 또는 매개곤충으로부터 분리된 RNA를 주형으로 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 아열대성 벼 바이러스병의 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스(southern rice black streaked dwarf virus; SRBSDV)에 특이적인 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 벼 그라시 스턴트 바이러스(rice grassy stunt virus; RGSV)에 특이적인 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 벼 래기드 스턴트 바이러스(rice ragged stunt virus; RRSV)에 특이적인 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트, 벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus; RTSV)에 특이적인 서열번호 7과 8 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 아열대성 벼 바이러스병 진단용 조성물을 제공한다.
바람직하게 상기 진단용 조성물은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 아열대성 벼 바이러스병을 특이적으로, 그리고 개별적으로 또는 동시에 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 진단용 조성물은 단일 단계(one step) RT-PCR(reverse-transcription polymerase chain reaction)을 가능케 하는 특징이 있다.
본 발명에서 용어 “아열대성 벼 바이러스병”은 주로 열대 및 동남아시아 아열대 지방에서 발생하여 가장 문제시 되고 있는 벼 바이러스병으로, 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병 등이 이에 속한다. 최근 지구 온난화로 한반도가 아열대 기후로 바뀌면서 한반도에 새롭게 발생될 가능성이 있는 벼 바이러스병으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 “서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병(southern rice black streaked dwarf virus; SRBSDV)”은 레오비리대(reoviridae)에 속하는 구형 바이러스로서, 입자의 직경은 75 내지 80 nm이다. 상기 바이러스에 의해 유발되는 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병은 흰등멸구(Laodelphax striatellus)에 의해 충매 전염되며, 상기 바이러스에 대한 기주 식물로는 벼, 옥수수, 보리, 밀 등이 있다. 상기 바이러스의 게놈은 dsRNA의 10개의 분절 게놈으로 이루어져 있으며, 전기영동 이동도가 느린 것으로부터 S1에서 S10으로 명명하고 있다. 현재 피지바이러스(Fijivirus) 속은 충매 전염 벡터, 식물 기주, 혈청학적 유연관계, 염기배열 등에 의해 5개의 그룹으로 나누며, 이 중 그룹 2에는 RBSDV, MRDV(Maize rough dwarf virus), MRCV(Mal de Rio Cuarto virus), PaSV(Pangola stunt virus)의 4개의 멤버가 있다. 그룹 1, 3, 4와 5는 각각 FDV(Fiji disease virus), OSDV(Oat sterile dwarf virus), GDV(Garlic dwarf virus) 및 NARV(Nilaparvata lugens reovirus)의 각각 하나의 멤버만 가지고 있다.
상기 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스 입자는 사부 조직 속에 존재하며, 봉입체는 감염된 세포의 바이로플라즘(viroplasm) 또는 핵에 존재하고 다른 세포적인 변화로는 사부 조직의 비대화 등이 나타난다. 혈청학적인 유연관계로는 MRD 질환과 가깝다고 알려져 있으며, 한국, 일본, 중국 등에서 발생하는 것으로 알려져 있다.
상기 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병에 의한 병징은 발생 시 벼가 위축되는 확실한 병징을 가지고 꽤 후기가 되어서부터 처음으로 나타나기 때문에 진단하기가 매우 쉽다. 초기에는 엽색도 변하지 않고 단지 생육이 조금 늦은 것 같은 모양이나 분얼최성기 또는 그 후가 되면 잎선단이 꼬이고 엽맥이 융기하는 것이 보인다. 초장은 15 cm 정도에 멈추는 것으로부터 건전벼와 비슷한 것까지 있으며, 출수하는 것도 있다. 상기 바이러스에 의해 70 내지 90%의 주가 전염되어 큰 감수를 가져다준 예가 있다. 상기 바이러스에 의해 발생하는 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병은 흰등멸구에 의해서 매개 전염되나, 상기 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스는 부모에서 새끼로 전달되지 않는다. 따라서, 1세대가 보독하고 있더라도 다음 세대의 충이 새로운 바이러스를 별도의 경로로 획득하지 않는 한 2세대는 보독하지 않는다.
본 발명에서 용어 “벼 그라시 스턴트 바이러스(rice grassy stunt virus; RGSV)”는 테뉴이바이러스(tenuivirus)속의 사상형 식물 바이러스로서, 입자의 길이는 950 내지 1350 nm이다. 상기 바이러스의 게놈은 선상의 ssRNA로서 전체 게놈 사이즈는 15.46kb 로서 게놈은 4개의 파트로 나누어져 있다. 숙주범위는 벼과 작물로서 멸구류에 의해 전염된다.
본 발명에서 용어 “벼 래기드 스턴트 바이러스(rice ragged stunt virus; RRSV)”는 오리자바이러스(oryzavirus)속의 구형 식물 바이러스로서, 입자의 직경은 약 65 nm이다. 상기 바이러스의 게놈은 dsRNA의 10개의 분절 게놈으로 이루어져 있으며, 전체 게놈 사이즈는 26.66kb 이다. 숙주범위는 벼과 작물로서 멸구류에 의해 영속 전염된다.
상기 벼 그라시 스턴트 바이러스(RGSV)와 벼 래기드 스턴트 바이러스(RRSV)를 포함한 벼 바이러스의 복합감염에 의해 발병하는 바이러스 병인 "옐로우 신드롬(yellow syndrome)"은 벼멸구에 의해 매개되고 주요 병징은 황화모자이크 및 위축증상이며, 드물게 고사 증상도 관찰되는 것을 특징으로 한다. 벼멸구 보독충이 벼를 가해하면 20일 안에 생육 억제, 황화 및 고사되는 피해가 막대한 병해로 알려져 있으며, 베트남의 메콩 델타 지역에서 가장 큰 문제로 대두되고 있다. 또한, 이 벼 옐로우 신드롬 증상은 계속적으로 베트남, 캄보디아 등 동남아시아에 확산되고 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 “벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus; RTSV)”는 와이카바이러스(waikavirus) 속의 구형 바이러스로서 입자의 직경은 약 30 nm이다. 상기 바이러스에 의해 유발되는 벼 퉁그로 병은 파키스탄에서 필리핀에 이르는 남부 및 남서부 아시아에서 벼에 발생하는 가장 심각한 바이러스 병이며, 벼 퉁그로 병은 ssRNA 바이러스인 상기 벼 퉁그로 구형 바이러스(RTSV)와 dsDNA 바이러스인 벼 퉁그로 간상 바이러스(rice tungro bacilliform virus; RTBV) 이 두 바이러스의 복합 감염의 결과로 발생한다. 상기 벼 퉁그로 구형 바이러스(RTSV)는 매미충, 특히 끝동매미충(nephotettis virescens)에 의해 반영속형으로 전염되며, 상기 바이러스에 감염된 벼는 위축되고 잎이 얼룩지며 노란색 내지 오렌지색으로 변색된다. 벼 퉁그로 병의 특유의 병징은 벼 퉁그로 간상 바이러스(RTBV)에 의해 생길 수 있으나 벼 퉁그로 구형 바이러스(RTSV)가 같이 있으면 더욱 심해진다. 또한 상기 벼 퉁그로 구형 바이러스는 매미충에 의해 단독으로 전염될 수 있다.
상기 본 발명의 국내 미발생 아열대성 벼 바이러스병 진단용 조성물은 바람직하게 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스(southern rice black streaked dwarf virus; SRBSDV)에 특이적인 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 벼 그라시 스턴트 바이러스(rice grassy stunt virus; RGSV)에 특이적인 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 벼 래기드 스턴트 바이러스(rice ragged stunt virus; RRSV)에 특이적인 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트, 벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus; RTSV)에 특이적인 서열번호 7과 8 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하여 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 아열대성 벼 바이러스병을 진단하는 것이 특징이다.
구체적으로 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트는 바람직하게는 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병을 진단할 수 있고, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트는 바람직하게는 벼 그라시 스턴트 바이러스병을 진단할 수 있으며, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트는 바람직하게는 벼 래기드 스턴트 바이러스병을 진단할 수 있다. 또한, 서열번호 3과 4 또는 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트는 그라시 스턴트 바이러스병 및 벼 래기드 스턴트 바이러스병을 진단할 수 있으며, 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 세트 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트는 바람직하게는 벼 퉁그로 병을 진단할 수 있다.
본 발명의 용어 "특이적인 서열"이란 다른 유전자와 반응 시에는 PCR 산물을 합성하지 않으면서 진단대상 유전자가 존재할 때만 이를 주형으로 하여 PCR 산물을 합성할 수 있는 일련의 염기서열을 의미한다. 본 발명의 진단용 조성물은 진단하고자 하는 아열대성 벼 바이러스병, 예컨대 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼멸구에 의해 매개되는 RGSV 및 RRSV를 포함한 벼 바이러스에 의한 바이러스병인 옐로우 신드롬 및 벼 퉁그로 병 유전자에 각각 특이적인, 서열번호 1과 2, 3과 4, 5와 6, 7과 8 및/또는 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하므로 상기 아열대성 벼 바이러스병 감염여부를 특이적으로 진단할 수 있다.
이와 같이 단일 단계 RT-PCR을 이용하여 1종 이상 또는 동시에 2종 이상의 바이러스를 진단하기 위해서는 각 바이러스 간의 RT-PCR 산물이 적절한 크기로 분리되어 하나의 겔(gel) 상에서도 손쉽게 확인할 수 있어야 하며, 동일한 어닐링 온도 및 시간(annealing temperature and time)을 갖고 있어서, 동일한 어닐링 온도에서 동일한 시간 동안 반응을 할 수 있는 특이적인 프라이머가 필요하며, 이와 같은 적절한 프라이머를 본 발명에서 최초로 규명하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병 유전자에 각각 특이적인, 서열번호 1과 2, 3과 4, 5와 6 및 7과 8로 표시되는 프라이머 세트는 500 bp 크기의 PCR 생성물을 합성할 수 있으며, 벼 퉁그로 병 유전자에 특이적인 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트는 300 bp 크기의 PCR 생성물을 합성할 수 있다(도 2). 그에 따라, 본 발명의 진단용 조성물은 서로 다른 크기의 PCR 생성물의 합성을 확인함으로써 2종 이상의 아열대성 벼 바이러스병을 동시에 진단할 수 있다. 즉, 최종 산물이 300 bp인 RTSV에 특이적인 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트와, 최종 산물이 500 bp인 SRBSDV, RGSV 및 RRSV에 각각 특이적인 서열번호 1과 2, 3과 4, 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트 중 하나를 혼합하여 아열대성 벼 바이러스 RTSV를 포함한 2종의 벼 바이러스병을 동시에 진단할 수 있다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 단일 단계 RT-PCR을 통해 상기 아열대성 벼 바이러스병의 단독 또는 복합적 감염여부를 진단할 수 있다.
본 발명의 용어 "진단"이란 감염이 의심되는 개체를 본 발명의 조성물로 테스트하여 감염여부를 판단하는 것을 의미한다. 본 발명에서 상기 감염이 의심되는 개체는 벼 자체일 수 있으며, 바이러스 전염을 매개하는 매개곤충일 수 있다. 예컨대, 벼 자체를 진단하는 경우 해당 벼의 바이러스병 감염여부를 판단할 수 있고, 매개곤충을 진단하는 경우 해당곤충이 바이러스를 전염시킬 수 있는 보독충인지 여부를 판단할 수 있다. 따라서 벼가 바이러스병에 감염된 것으로 판단되면 해당포기를 제거하는 방법을 택할 수 있으며, 해당곤충에 보독충인 것으로 판단되면 해당곤충에 대한 방제를 수행하여 전염을 예방하는 방법을 택할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 7과 8 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트 및 이들의 조합으로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병이 포함되는 아열대성 벼 바이러스병으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 벼 바이러스병의 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 진단대상 유전자를 RT-PCR을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 PCR 산물을 합성한다. 이때, 상기 정방향과 역방향 프라이머 세트가 결정되면 이로부터 합성되는 PCR 생성물의 크기를 예측할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아열대성 벼 바이러스병 진단용 키트를 제공한다.
상기 본 발명의 진단용 키트는 바람직하게 서열번호 1과 2, 3과 4, 5와 6, 7과 8 또는 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트를 이용하여 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 4종의 아열대성 바이러스를 특이적으로, 그리고 개별적으로 또는 동시에 진단하는 것이 특징이다.
본 발명의 진단용 키트는 바람직하게 역전사 반응 및 PCR 반응을 용이하게 수행할 수 있도록 하기 위한 역전사효소, DNA 중합효소 및 그 완충용액 및 상기 기재한 조성의 PCR 반응 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 진단 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 벼 또는 매개곤충으로부터 분리된 RNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 아열대성 벼 바이러스병의 진단 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 아열대성 벼 바이러스병에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 진단 방법은 (a) 벼 또는 매개곤충의 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 진단 방법을 이용하여, 벼의 바이러스병 감염여부를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 바이러스병을 전염시키는 매개곤충의 보독여부도 확인할 수 있다. 바람직하게 상기 매개곤충은 멸구류에 속하는 매개곤충일 수 있으며, 보다 바람직하게는 열대성 해충인 벼멸구, 흰등멸구 및 애멸구일 수 있다.
현재 알려진 벼 바이러스병 감염주를 치료할 수 있는 방법이 없으므로, 바이러스 전염을 매개하는 매개곤충을 방제하여 바이러스 전염을 방지하는 것이 최선의 예방 방법이다. 따라서 본 발명의 진단 방법을 이용하여 매개곤충의 보독 여부를 확인하여 보독충이 존재하는 것으로 판명되면 해당 곤충을 방제하는 방법으로 벼 바이러스병 발생을 예방할 수 있다.
이러한 본 발명의 진단 방법은 시료로부터 분리된 RNA를 주형으로 하여 당업계에 공지된 RT-PCR 기법에 의해 수행될 수 있으나, 바람직하게 본 발명의 진단 방법은 cDNA 합성을 위하여 49 내지 51℃에서 25 내지 35분; 주형 DNA 전변성을 위해 94 내지 95℃에서 10 내지 20분; 변성(denaturation), 어닐링(annealing) 및 증폭(extension)을 위한 93 내지 95℃, 55 내지 57℃ 및 71 내지 73℃에서 각각 50 내지 70초, 50 내지 70초, 및 30 내지 50초씩 30 내지 40회 사이클; 및 최종 증폭 및 신장(elongation)을 위한 71 내지 73℃에서 5 내지 15분의 조건하에서 수행할 수 있다. 최종 생성된 산물은 바람직하게 4℃로 유지할 수 있다.
특히, 본 발명의 진단 방법은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR의 어닐링 단계의 온도를 55 내지 57℃, 바람직하게는 56℃로 하여 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 어닐링 단계 온도는 상기 어닐링 온도 56℃에서, 합성된 cDNA 주형에 상기 특이적인 프라이머가 결합력이 우수한 것을 확인하였으며, 반면에 어닐링 온도를 53℃로 수행하는 경우에는 상기 프라이머 세트를 이용하더라도 적절한 진단이 이루어지지 않음을 확인하였다(도 3).
또한 본 발명의 진단 방법은 RT-PCR에 앞서 벼 또는 매개곤충 등의 시료로부터 RNA를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 RNA의 분리는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 또는 상용화하여 판매되는 RNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
이와 같은 진단 방법은 단일 RT-PCR 조건 하에서 멸구류에 의해 매개되는 SRBSDV(서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스), RGSV(벼 그라시 스턴트 바이러스), RRSV(벼 래기드 스턴트 바이러스) 또는 RTSV(벼 퉁그로 구형 바이러스)에 각각 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 아열대성 벼 바이러스병을 진단할 수 있으므로, 상기 벼 바이러스에 대한 감염여부가 의심스러운 시료의 진단이 필요한 경우에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 멸구류에 의해 매개되는 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 바이러스 진단용 프라이머 세트, 조성물 및 진단 방법은 벼에 발생하는 아열대성 바이러스를 특이적으로, 그리고 개별적으로 또는 동시에 진단할 수 있는 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 진단용 프라이머 및 이를 이용한 진단 방법은 멸구류 매개 아열대성 바이러스 이병주의 진단이 가능하며, 이로써 지구 온난화에 따라 발생이 우려되는 상기 벼 바이러스병의 종합 관리체계 확립 및 우량종자 확보에 기여할 수 있다.
도 1은 각각 벼 바이러스병에 감염된 4종의 시료에 대해 토탈 RNA 분리 결과를 나타낸 도이다. 각 감염시료로부터 토탈 RNA를 분리한 후 전기영동을 이용하여 그 결과를 확인하였다.
도 2는 본 발명의 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 벼 바이러스병 4종 진단 특이 프라이머 염기서열을 포함한 진단 키트를 이용하여 어닐링 온도 56℃로 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다. 각각의 바이러스 유전자에 대하여 RT-PCR을 수행하여 예상 밴드 위치를 확인하였다(2, 4, 6, 8 및 10열).
도 3은 발명의 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 벼 바이러스병 4종 진단 특이 프라이머 염기서열을 포함한 진단 키트를 이용하여 어닐링 온도 53℃로 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다. 각각의 바이러스 유전자에 대하여 RT-PCR을 수행한 결과, 상기 어닐링 온도 조건에서는 예상 크기 위치에서 밴드가 확인되지 않았다.
도 2는 본 발명의 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 벼 바이러스병 4종 진단 특이 프라이머 염기서열을 포함한 진단 키트를 이용하여 어닐링 온도 56℃로 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다. 각각의 바이러스 유전자에 대하여 RT-PCR을 수행하여 예상 밴드 위치를 확인하였다(2, 4, 6, 8 및 10열).
도 3은 발명의 SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV에 대한 벼 바이러스병 4종 진단 특이 프라이머 염기서열을 포함한 진단 키트를 이용하여 어닐링 온도 53℃로 수행한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다. 각각의 바이러스 유전자에 대하여 RT-PCR을 수행한 결과, 상기 어닐링 온도 조건에서는 예상 크기 위치에서 밴드가 확인되지 않았다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 특이적
프라이머
세트의 설계 및 개발
본 발명에 따른 아열대성 벼 바이러스병 진단 특이 프라이머 염기서열 세트를 설계하고 개발하기 위하여, SRBSDV, RGSV, RRSV 및 RTSV의 염기서열을 기초로 각각의 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 설계하였다. 각각의 프라이머 세트의 염기서열은 표 1에 기재된 바와 같다.
실시예 2: 이병주로부터 토탈 RNA의 분리
본 발명에 따른 진단 특이적 프라이머 서열을 이용한 RT-PCR의 주형으로 사용하기 위하여, 국제미작연구소(IRRI)에서 계대 보관중인 이병주로부터 토탈 RNA를 분리하였다. 본 발명에 사용된 국내 미발생 바이러스 이병주는 식물 검역상 국내 반입이 불가하여 국제미작연구소에서 실험을 수행하였다. 구체적으로, RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen, Germany)을 이용하여 이병주 100 mg으로부터 토탈 RNA를 분리하였다. 분리된 토탈 RNA는 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 분리된 RNA의 농도 및 순도를 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.
실시예
3:
RT
-
PCR
조건 확립
상기 실시예 2에서 분리한 토탈 RNA를 주형으로 하고 본 발명의 진단 특이적 프라이머를 사용하였으며 표 1과 같다. 하기 표 3에 개시한 조건으로 RT-PCR 반응을 수행하였다. 본 분석에는 One step RT-PCR kit(Qiagen, Germany)를 사용하였다.
실시예
4:
RT
-
PCR
상기 실시예 3에서 확립한 RT-PCR 조건을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다. 도 2는 어닐링 온도를 56℃로 하여 수행한 결과를 타나내며, 각각에 대해 예상되는 위치에서 특이적인 밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 반면, 도 3은 어닐링 온도를 53℃로 하여 수행한 결과를 나타내며, 어닐링 온도를 제외하고는 동일한 프라이머 세트 및 조건을 사용하였음에도 불구하고 예상되는 위치에서 특이적인 밴드가 나타나지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트는 RT-PCR 수행 시, 56℃의 어닐링 온도와 같은 특정 조건에서 각각의 아열대성 벼 바이러스병을 효율적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 밴드의 크기가 다른 서열번호 9와 10의 프라이머 세트를 이용하여 벼 퉁그로 병을 진단하는 경우, 다른 프라이머 세트를 함께 이용하여 다른 아열대성 벼 바이러스병과 동시에 진단이 가능할 수 있음을 알 수 있었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Primer sets for diagnosing subtropical rice virus diseases and
use thereof
<130> PA130528/KR
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SRBSDV Forward primer
<400> 1
cgaccaacaa tcacacttct gt 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SRBSDV Reverse primer
<400> 2
gcaggaactt cacgacaaca 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGSV Forward primer
<400> 3
gaatgctggt gacaatgctg tt 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RGSV Reverse primer
<400> 4
ccctgcagca gaaatcaaca a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RRSV Forward primer
<400> 5
ccaatgtcgt ttgtgcaagg t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RRSV Reverse primer
<400> 6
tcagatagcg acggcatcac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RTSV Forward primer
<400> 7
acataacgcc atgctgcaaa 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RTSV Reverse primer
<400> 8
gggcttgtca aattgtaccc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RTSV 300 Forward primer
<400> 9
aacataacgc catgctgcaa 20
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RTSV 300 Reverse primer
<400> 10
tcatcgaggg gaggttgct 19
Claims (13)
- 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스(southern rice black streaked dwarf virus; SRBSDV)에 특이적인 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 벼 그라시 스턴트 바이러스(rice grassy stunt virus; RGSV)에 특이적인 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 벼 래기드 스턴트 바이러스(rice ragged stunt virus; RRSV)에 특이적인 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트, 벼 퉁그로 구형 바이러스(rice tungro spherical virus; RTSV)에 특이적인 서열번호 7과 8 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 아열대성 벼 바이러스병 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 아열대성 벼 바이러스병은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 벼 바이러스병인 것인 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 세트; 및 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하여, 2종 이상의 아열대성 벼 바이러스병을 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스에 특이적인 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 벼 그라시 스턴트 바이러스에 특이적인 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 벼 래기드 스턴트 바이러스에 특이적인 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트, 벼 퉁그로 구형 바이러스에 특이적인 서열번호 7과 8 또는 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 아열대성 벼 바이러스병 진단용 프라이머 세트.
- 제4항에 있어서,
상기 아열대성 벼 바이러스병은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 벼 바이러스병인 것인 프라이머 세트.
- 제4항 또는 제5항의 프라이머 세트를 포함하는, 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 아열대성 벼 바이러스병 진단용 키트.
- 제6항에 있어서,
서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 세트, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 프라이머 세트; 및 서열번호 9와 10으로 표시되는 프라이머 세트를 포함하여, 2종 이상의 아열대성 벼 바이러스병을 동시에 진단하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 벼 또는 매개곤충으로부터 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제4항의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 아열대성 벼 바이러스병의 진단 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 아열대성 벼 바이러스병은 서던 라이스 블랙 스트리크 드워프 바이러스병, 벼 그라시 스턴트 바이러스병, 벼 래기드 스턴트 바이러스병 및 벼 퉁그로 병으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 벼 바이러스병인 것인 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 매개곤충은 벼멸구, 흰등멸구 또는 애멸구인 것인 방법.
- 제8항에 있어서,
(a) 벼 또는 매개곤충의 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제4항의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 RT-PCR은 어닐링(annealing) 단계의 온도를 56℃로 하여 수행되는 것을 특징으로 하는 바이러스병 진단 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 RT-PCR은
(a) 역전사 반응 단계로서 49 내지 51℃에서 25 내지 35분;
(b) 초기 PCR 활성 단계로서 94 내지 95℃에서 10 내지 20분;
(c) 변성 단계로서 93 내지 95℃에서 50 내지 70초, 어닐링 단계로서 55 내지 57℃에서 50 내지 70초 및 증폭 단계로서 71 내지 73℃에서 30 내지 50초를 30 내지 40 사이클; 및
(d) 최종 증폭 단계로서 71 내지 73℃에서 5 내지 15분의 반응이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20130105725A KR20150026633A (ko) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 아열대지역에서 발생하는 벼 바이러스병 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR20130105725A KR20150026633A (ko) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 아열대지역에서 발생하는 벼 바이러스병 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150026633A true KR20150026633A (ko) | 2015-03-11 |
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ID=53022538
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| KR20130105725A KR20150026633A (ko) | 2013-09-03 | 2013-09-03 | 아열대지역에서 발생하는 벼 바이러스병 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| KR (1) | KR20150026633A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108913795A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-30 | 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 | 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法 |
| KR20190047399A (ko) * | 2017-10-27 | 2019-05-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 애멸구 진단용 고리매개 등온 증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 애멸구 진단 방법 |
| KR101980800B1 (ko) | 2018-08-16 | 2019-05-21 | 대한민국 | 흰등멸구 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법 |
-
2013
- 2013-09-03 KR KR20130105725A patent/KR20150026633A/ko not_active Application Discontinuation
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|---|---|---|---|---|
| KR20190047399A (ko) * | 2017-10-27 | 2019-05-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 애멸구 진단용 고리매개 등온 증폭 프라이머 세트 및 이를 이용한 애멸구 진단 방법 |
| CN108913795A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-11-30 | 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 | 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法 |
| CN108913795B (zh) * | 2018-06-11 | 2021-09-10 | 广西壮族自治区农业科学院水稻研究所 | 抗南方水稻黑条矮缩病位点qSRBSDV9及其分子标记方法 |
| KR101980800B1 (ko) | 2018-08-16 | 2019-05-21 | 대한민국 | 흰등멸구 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법 |
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