KR101980800B1 - 흰등멸구 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트는 흰등멸구를 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있어 벼 집중고사와 바이러스 매개 위험을 신속하게 예측하고 방제함으로써 우수한 방제 효과를 제공할 수 있다.

Description

흰등멸구 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법{Primers for loop-mediated isothermal amplification to detect Sogatella furcifera and detection method for S. furcifera by using the same}
본 발명은 흰등멸구 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법에 관한 것이다.
벼(Oryza sativa L.)는 세계에서 가장 중요한 작물 중 하나로, 거의 모든 아시아, 남부 및 중부 아메리카 및 중앙 및 동부 아프리카에 이르는 열대 및 아열대 지역 100개 이상의 국가에서 재배된다. 2016년 세계 벼 총생산량은 7억5천톤에 이르고, 이 중 90% 이상이 아시아 국가에서 생산된다. 따라서 세계 인구수가 증가세를 유지할수록 아시아 국가에서의 안정적인 벼 생산이 중요하다. 벼 생육기에 병해충이 대발생하면 심한 경우 벼를 고사시킬 수 있고 쌀 수확량을 급감시켜 농가 수입 감소와 쌀 공급물량의 부족으로 인한 쌀 가격의 급상승을 초래하여 막대한 경제적 혼동을 수반할 수 있다.
우리나라에서 벼의 주요 멸구류 해충은 벼멸구(Nilaparvata lugens), 흰등멸구(Sogatella furcifera) 및 애멸구(Laodelphax striatellus)인데 이들은 직접 벼를 흡즙하여 집중고사 시키거나 바이러스 병을 매개하여 큰 피해를 주고 있다. 이들은 공통적으로 해마다 해외에서 장거리 비래를 통해 이동하여 피해를 주기 때문에 벼 예찰포에서 주기적으로 유인등, 공중포충망, 육안조사 방법 등을 통해 매년 비래시기와 비래량 및 포장 발생밀도를 예찰하여 방제시기를 결정하게 된다. 7월 하순 ~ 8월 초순에 중만생종 벼에서 흰등멸구의 요방제수준은 20주당 100마리이며, 8월 하순에는 20주당 400마리로 시기마다 다르다. 그런데 논과 주변 잡초류에 서식하는 다양한 멸구류 약 30여종이 혼재되어 있어 멸구류 어린 약충들은 전문가들도 육안으로 형태적 구분이 어려운 실정이며, 유인등과 공중포충망을 통해 채집되는 벼 멸구류 성충의 경우도 기타 멸구들과 상당히 유사한 형태를 가지고 있고 시료가 손상된 경우가 많기 때문에 육안 또는 현미경으로 정확하게 구분하기가 쉽지 않다.
흰등멸구[S. furcifera]는 노린재목 멸구과(Hemiptera: Delphacidae)에 속하는 몸 길이 4mm 이하의 소형곤충으로 주로 벼(O. sativa)가 재배되는 아시아와 오세아니아 지역에 분포한다. 흰등멸구는 우리나라에서는 월동을 못하고 벼멸구와 같이 6∼7월에 중국 남동부 지역에서 우리나라로 비래하는 것으로 알려져 있다. 흰등멸구는 벼의 체관부 수액을 직접 빨아먹고 대발생할 경우 벼를 집중고사(hopperburn) 시키는 큰 피해를 주는 벼의 주요해충이다. 더욱이, 중국 남부지역에서는 2000년대 초반부터 흰등멸구가 SRBSDV(Southern rice black-streaked dwarf virus) 바이러스 병을 매개하여 큰 피해를 주고 있으며 2010년에는 베트남 29개 성과 중국 13개 성으로 확산되어 총면적 1,360,000 ha에서 피해를 준바 있다.
우리나라에서 가장 주요한 멸구류 해충인 흰등멸구(S. furcifera), 벼멸구(N. lugens), 및 애멸구(L. striatellus)는 야외 포장에서 이들의 어린 약충은 전문가들도 육안으로 구분이 어려운 실정이며, 매년 비래량을 조사하기 위해 유아등을 통해 채집되는 흰등멸구 성충의 경우 기타 멸구들과 상당히 유사한 형태를 가지고 있기 때문에 육안으로 구분하기가 쉽지 않다. 따라서 흰등멸구 비래량에 대한 정확한 자료 수집과 효율적인 방제 전략 수립을 위해서는 육안 이외의 보조적인 방법으로 흰등멸구, 벼멸구 및 애멸구와 기타멸구류를 정확하게 구별하고 동정해 내는 기술이 필요하다. 등온조건에서 1시간 이내 반응으로 PCR과 유사한 민감도와 특이성을 갖는 고리매개등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)은 타켓 핵산 (DNA 또는 RNA)을 증폭할 수 있는 기술로 PCR방법보다 단기간에 저렴한 비용으로 분석이 가능하고 non-target DNA와 PCR inhibitors (혈액, 혈청, 음식물 성분 등)가 오염된 조건에서도 안정적으로 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 고리매개등온증폭법은 시료 준비 과정에서 원심분리 없이 신속하고 단순하게 진행될 수 있도록 개발되고 있으며, 결과를 확인하는 방법도 침전물 육안 검출에서 형광 실시간 검출 등 다양하게 개발되고 있다.
따라서 본 발명에서는 고리매개등온증폭 기법을 활용하여 현장에서 신속·정확하게 흰등멸구(S. furcifera)를 판별할 수 있는 종 구별 방법을 개발하였다.
1. 한국공개특허 10-2015-0026633 (2015.03.11. 공개) 2. 중국등록특허 CN102168150B (2013.04.10. 등록)
1. Journal of Virological Methods 180 (2012) 91- 95
본 발명은 흰등멸구 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트 및 이를 이용한 흰등멸구 검출 방법을 제공하고자 한다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 구성된 프라이머 조합을 포함하는 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 상술한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 상술한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 상술한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 사용하여 흰등멸구의 DNA 내 특정 부위를 증폭시키는 단계를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) DNA 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 시료에서 DNA를 추출하는 단계 및 상기 시료에서 얻은 DNA를 주형으로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 구성된 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머 조합을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는, 흰등멸구(Sogatella furcifera)을 높은 민감도로 특이적으로 검출할 수 있어 현장에서 발생 초기 신속·정확한 예찰을 통해 우수한 방제 효과를 제공할 수 있다.
도 1a 및 1b은 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭반응의 특이성을 확인한 결과이다.(WBPH:흰등멸구, BPH: 벼멸구, SBPH: 애멸구)
도 2는 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭반응시 민감도를 확인한 결과이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트는, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머로 구성된 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머 조합을 포함한다.
본 발명의 흰등멸구(S. furcifera)는 벼멸구와 비교하여 포장에서 분산특성이 강하지만 대발생시 벼를 집중고사(hopperburn)시킬 수 있으며 2000년 이후 최근에는 중국 남부와 베트남 지역에서 SRBSDV (Southern rice black streaked dwarf virus)를 매개하여 쌀 생산에 큰 피해를 주고 있다. 흰등멸구가 매개하는 SRBSDV 병(disease)은 아직 국내에서는 발견되지 않았으나 바이러스를 갖는 보독충이 비래할 가능성은 매우 높다. 그리고 이 병은 포장에서 육안으로 관찰했을 때 애멸구가 매개하는 벼검은줄오갈병(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)과 병징이 매우 유사하므로 구분하기가 거의 불가능하다. 따라서 비래한 흰등멸구를 본 발명을 이용하여 정확하고 신속하게 구별하고 바이러스 보독여부를 조사하여 조기에 방제함으로써 벼 생육초기에 일어날 수 있는 SRBSDV 매개를 사전에 차단하고 큰 피해를 효과적으로 예방할 수 있다.
본 명세서의 용어 “프라이머”란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 명세서의 용어 "프라이머 세트(a pair of primers)"란 진단대상 유전자를 고리매개등온증폭법을 이용하여 증폭시키기 위한 염기서열들로, 하나의 진단대상 유전자에 정방향 프라이머와 역방향 프라이머가 세트를 이루어 반응하여 산물을 합성한다.
본원 발명에서 사용하는 용어인 “검출”은 시료에서 흰등멸구(S. furcifera)를 분리하여 식별할 수 있는 것을 의미한다.
상술한 본 발명의 프라이머 조합은 흰등멸구(S. furcifera)에 특이적으로 결합하여 흰등멸구(S. furcifera)를 검출할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 상기 프라이머 조합 상기 검출은 다른 멸구류 곤충인 애멸구 및 흰등멸구에는 결합하지는 않아서 흰등멸구(S. furcifera)만을 특이적으로 검출할 수 있다.
총 6개의 프라이머 조합으로 이루어진 본 발명의 프라이머 세트는 DNA를 고리매개등온증폭 (Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP)시킬 수 있는 반응에 기본적으로 필요한 4개의 타켓 핵산 특이 프라이머(외부 프라이머 세트: F3와 B3, 내부 프라이머 세트: FIP와 BIP)를 포함하고, 증폭시간을 1/2정도 단축시킬 수 있도록 추가된 2개의 고리 프라이머(Loop primer, LF와 LB)를 포함한다.
본 발명의 프라이머 세트는 흰등멸구(S. furcifera)의 ITS2 영역을 분석하여 제조된 프라이머 세트이다. 상기의 프라이머 세트를 이용하면, 다양한 멸구류 곤충 중에서 흰등멸구(S. furcifera)만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였고, 특히 최소 0.01ng/25㎕ 농도의 DNA에서도 흰등멸구(S. furcifera)의 존재 여부를 검출할 수 있어, 높은 특이도와 민감도로 흰등멸구(S. furcifera)만을 신속하고 정확하게 진단할 수 있고, 나아가 고리 프라이머도 포함하여 증폭 시간도 단축시킬 수 있다.
본 발명에서 고리매개등온증폭은, 변성(denaturation), 접합(annealing), 신장(extension) 세 가지 단계의 온도의 변화를 주어야 하는 기존의 PCR과 달리, 일정한 온도에서 변성, 접합 및 신장이 가능한 장점이 있다. 고리매개등온증폭에서는 특히 Bst. DNA 중합효소를 사용하며, 이 Bst. DNA 중합효소는 일반 PCR의 Taq. DNA 중합효소와는 달리 헬리카제(helicase)의 성격을 가지고 있어 DNA의 이중나선 구조를 열에 의한 변성을 거치지 않고 Tm 값에 가까운 접합 온도에서 변성, 접합 및 신장이 수행될 수 있도록 한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 상술한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 상술한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 키트는 상술한 흰등멸구(S. furcifera) 검출용 키트 프라이머 세트와 검출용 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 검출용 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, Bst DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 상술한 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 사용하여 흰등멸구의 DNA 내 특정 부위를 증폭시키는 단계를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) DNA 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 일 태양에 따르면, 시료에서 DNA를 추출하는 단계 및 상기 시료에서 얻은 DNA를 주형으로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 구성된 프라이머 조합을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는 흰등멸구(S. furcifera) 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 흰등멸구(S. furcifera) 검출 방법의 첫 단계는 시료에서 DNA를 분리하는 단계이다. 이때, DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 흰등멸구(S. furcifera) 자체 또는 흰등멸구 감염이 의심되는 개체일 수 있으며, 감염이 의심되는 개체는 벼 자체 또는 벼가 존재하는 토양일 수 있다. 예컨대, 벼 자체를 진단하는 경우 벼의 잎이나 뿌리 등을 시료로 사용하거나, 벼의 뿌리에 존재하는 토양의 흙을 시료로 사용할 수 있다.
그 다음으로, 상기에서 분리된 DNA를 주형으로 하고, 상술한 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계를 수행한다. 상기 등온증폭반응은 바람직하게는 50~70℃에서 수행될 수 있다. 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭 시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
그 다음으로 상기에서 얻어진 증폭산물을 검출하는 단계를 수행한다. 상기 증폭산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 등 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로오스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 상기 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광을 형광 측정기를 이용하여 측정하는 방법이다. 상기 방사성 측정 방법은 증폭 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하여 증폭산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 증폭산물 검출은 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 형광 염색 물질을 적용할 수 있으나, 바람직하게는, SYBR 그린I과 GeneFinder, 페놀 레드를 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 SYBR 그린I과 GeneFinder을 사용할 수 있다. 상기 형광 염색 물질은 DNA 이중가닥에 결합하는 특성을 이용하여 추가적 실험을 필요로 하지 않고도 결과의 여부를 판독할 수 있도록 하기 위하여 첨가한 것이다. 특히, 상기 SYBR 그린I 또는 GeneFinder는 DNA 이중 가닥에 삽입되어 자외선 조사 시 녹색의 형광을 발현하는 물질이다. 따라서 흰등멸구 유전자를 본 발명에 따라 LAMP법으로 증폭시키고, 증폭된 LAMP 생성물에 SYBR 그린I 또는 GeneFinder을 첨가한 후 자외선을 조사하게 되면 녹색 형광을 나타내게 된다. 즉, 본 발명은 전기영동 등 별도의 추가적 실험을 하지 않고도, LAMP 증폭실험 후 SYBR 그린I 또는 GeneFinder 염색에서 녹색형광을 나타내면 흰등멸구의 존재를 의미하고, 녹색형광을 나타내지 않으면 비존재를 의미하므로 흰등멸구 존재 여부를 고감도이면서 신속하게 육안으로 확인할 수 있다. 또한 고리매개등온증폭 결과 피로인산[pyrophosphate, (P2O7)-4]과 2가 금속 양이온(Mg2+ or Mn2+)의 결합산물(Mg2P2O7 or Mn2P2O7) 침전에 의한 혼탁도(turbidity)를 측정하는 방법, 고리매개등온증폭 결과 Mg-hydroxynaphthol(HNB)(보라색) → hydroxynaphthol(HNB)(하늘색)+ Mg2P2O7 색변화를 확인하는 방법, 고리매개등온증폭 결과 Mn-Calcein(주황색) + Mg2+ → Mg-calcein(초록색)+ Mn2P2O7 색변화를 확인하는 방법 등이 있다.
상기 방법을 이용하여 흰등멸구를 검출하는 경우, 0.01ng의 소량의 게놈DNA에서도 민감성이 높고, 흰등멸구만을 검출하는 특이성이 우수할 뿐만 아니라, 고가의 장비를 요구하지 않아 흰등멸구가 발생하는 현장에서 직접 수행할 수 있어, 흰등멸구 검출에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 검출 방법에 의하여 흰등멸구가 발생하는 것으로 판단되면 방제를 수행하여 흰등멸구를 제거하고 동시에 바이러스 전염이나 전파를 막을 수 있다. 현재 알려진 벼 바이러스병 감염주를 치료할 수 있는 방법이 없으므로, 흰등멸구를 신속하고 정확하게 확인하고 방제하여 바이러스 전염을 방지하는 것이 최선의 예방 방법이다.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 흰등멸구 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 제작
흰등멸구의 ITS2 유전자(KC417469, AB625596 ~ AB625607)를 바탕으로 유사 멸구류 곤충들의 ITS2 영역 DNA정보를 비교하여 흰등멸구 검출용 등온증폭반응용 프라이머를 제작하였다.
상기 제작된 프라이머 세트의 구체적인 프라이머 조합 내용은 다음 표와 같다.
셋트 구분 서열(5'-3') mer 서열
번호
WBPH-65 65-F3 ATGGCTCGTCCTAGGTAG 18 1
65-B3 CACACACTGGCAGTTCAA 18 2
65-FIP AGCATCAGCAATATGCTCACAATA-AGCAACAGTCAAGTTGTTC 43 3
65-BIP AAGATGAGTTGTGCATGCACT-TCAGTGAATGCAGCCTTAC 40 4
65-LF ACAAAGCTCCCTCTTCCTTGG 21 5
65-LB ACACTTAGCA GTGTGT(A/G)GTGTATGT 25 6
[실시예 2] 본 발명의 프라이머 세트의 등온증폭반응 및 특이성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 등온증폭반응 및 그의 특이성을 확인하였다. 본 실험을 위해, 흰등멸구의 게놈 DNA는 CTAB 추출 용액(extraction solution)과 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)을 이용하여 추출되었다.
구체적으로, CTAB 추출 용액 10 ml에 2-머캅토에탄올 73 ㎕을 섞어 CTAB 추출 용액을 만들어 1.5ml 튜브에 200 ㎕를 넣고 한 개체를 마쇄하였다. 65 ℃에서 1시간 동안 가열 시킨 후 클로로포름/IAA 200㎕을 넣고 vortex하고 13,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상층액을 새 1.5 ml 튜브로 옮기고 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 100 ㎕와 잘 섞어 침전이 일어나도록 상온에서 20분간 보관 후 4 ℃ 조건에서 13,000rpm으로 20분간 원심분리를 하였다. 이후 70% EtOH을 이용하여 세척 후 멸균된 3차 증류수 20 ㎕에 녹이고 RNase A 1 ㎕를 넣어 30분간 상온에 놓아 둔 후 NanoDrop 2000을 이용하여 추출된 게놈 DNA 양을 측정하였다. LAMP 반응은 하기 표 2의 LAMP 반응액을 제조하여 수행되었다. LAMP 반응액은 PCR 튜브(200 ㎕)에 2ｘReaction Mix(반응버퍼) 12.5 ㎕, LAMP 프라이머 세트 (FIP & BIP 40 pmol; LF & LB 20 pmol; F3 & B3 5 pmol) 2.5 ㎕, Bst DNA 중합효소 1 ㎕, 멸균된 3차 증류수 7 ㎕, 형광용액 (calcein) 1 ㎕를 넣고 잘 섞은 다음 1 ㎕의 게놈 DNA를 마지막으로 추가하여 최종 반응액이 25 ㎕가 되도록 하여 제조되었다. 음성대조군 또는 형광용액이 없는 처리의 LAMP 반응용액에는 그 대신 동일한 양의 멸균된 3차 증류수로 채워 넣어 25 ㎕의 최종 반응액으로 만들었다. 그리고 65℃ 항온조건에서 60분간 보관하여 증폭시킨 후 다시 80℃ 항온조건에서 5분간 두어 중합효소의 기능을 불활성화 시키고 LAMP 결과를 확인하였다. LAMP 결과는 1% 아가로스 겔에 로딩한 후 전기영동을 통해 확인하였다. 마커로 100bp 사이즈 마커가 사용되었고, 양성 대조구(PC), DNA를 무첨가한 음성대조구(NC), 및 100 ng의 흰등멸구 시료가 실험에 사용되었다. 그 결과를 도 1a와 1b에 나타내었다.
성분 부피(㎕)
반응버퍼(2X) 12.5
프라이머 세트 2.5
Bst Pol. 1.0
3차 증류수 7.0
멸구류 DNA 1.0
형광용액 또는 3차 증류수 1.0
최종 반응액 25.0
실험 결과, 본 발명의 프라이머 세트가 흰등멸구(WBPH) DNA양이 100ng(/25㎕ 반응액)에서 증폭된 반면, 벼멸구(BPH) 및 애멸구(SBPH)에서는 증폭되지 않았음을 확인하였다(도 1a). 또한, 본 발명의 프라이머 세트는 흰등멸구 DNA양이 0.01ng(/25㎕ 반응액)에서 증폭된 것을 확인하였다(도 1b).
이를 통해 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하였을 때 흰등멸구를 특이적으로 검출할 뿐만 아니라 낮은 농도의 흰등멸구 DNA 수준에서도 민감하게 검출할 수 있다는 것을 확인하였다.
[실시예 3] LAMP 증폭시간 및 흰등멸구 게놈 DNA 농도에 따른 증폭 효과
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 효과를 볼 수 있는 게놈 DNA 양과 반응시간 조건 설정하기 위한 실험을 진행하였다. 상기 실시예 1에 사용한 방법과 동일한 방법으로 LAMP 반응액을 제조한 후, LAMP 증폭시간 및 흰등멸구 게놈 DNA 농도에 따른 증폭 효과를 확인하였다 (도 2). LAMP 증폭은 각각 20분, 30분, 40분 및 60분 수행되었으며, 실험에 사용된 흰등멸구 DNA 양은 각각 0 ng(흰등멸구 게놈 DNA 대신 3차 증류수), 0.01ng, 0.1 ng, 1 ng, 10 ng, 및 100 ng이었다. DNA 증폭은 Calcein 형광을 통해 그 결과를 확인하였다. 상기 DNA 양은 LAMP 반응액 총 25μl에서의 DNA 양을 의미한다.
구체적으로, 흰등멸구 Genomic DNA를 추출한 후 하기 표의 조성으로 LAMP 반응 혼합액과 섞어 최종 25㎕를 만들고, 65℃ 항온조건에서 각각 20분, 30분, 40분, 60분간 가온시켜 증폭시킨 후 다시 80℃ 항온조건에서 5분간 가열하여 중합효소의 기능을 불활성화 시키고 LAMP 결과를 확인하기까지 4℃에서 냉장 보관하였다.
실험 결과, 도 2에 나타난 것처럼, 65℃에서 흰등멸구 게놈 DNA 1ng 이상을 40분 반응시키면 육안 판별 가능하였고, 65℃에서 흰등멸구 게놈 DNA 0.01ng 이상을 60분 반응시키면 육안 판별 가능하였다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primers for loop-mediated isothermal amplification to detect Sogatella furcifera and detection method for S. furcifera by using the same <130> P18-086 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMP primer to detect Sogatella furcifera, F3 <400> 1 atggctcgtc ctaggtag 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMP primer to detect Sogatella furcifera, B3 <400> 2 cacacactgg cagttcaa 18 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMP primer to detect Sogatella furcifera, FIP <400> 3 agcatcagca atatgctcac aataagcaac agtcaagttg ttc 43 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMP primer to detect Sogatella furcifera, BIP <400> 4 aagatgagtt gtgcatgcac ttcagtgaat gcagccttac 40 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMP primer to detect Sogatella furcifera, LF <400> 5 acaaagctcc ctcttccttg g 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LAMP primer to detect Sogatella furcifera, LB <400> 6 acacttagca gtgtgtrgtg tatgt 25

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 구성된 프라이머 조합을 포함하는 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출용 고리매개등온증폭용 프라이머 세트.
  2. 제1항의 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출용 조성물.
  3. 제1항의 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 포함하는 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출용 키트.
  4. 제1항의 고리매개등온증폭용 프라이머 세트를 사용하여 흰등멸구의 DNA 내 특정 부위를 증폭시키는 단계를 포함하는 흰등멸구(Sogatella furcifera) DNA 검출 방법.
  5. 시료에서 DNA를 추출하는 단계; 및
    상기 시료에서 얻은 DNA를 주형으로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 갖는 프라이머, 서열번호 5의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머로 구성된 프라이머 조합을 포함하는 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는 흰등멸구(Sogatella furcifera) 검출 방법.
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